贵州某鸡场大肠杆菌与葡萄球菌混合感染病原的分离鉴定

为探明贵州某鸡场患病鸡的细菌感染种类、耐药性及致病性等情况,本试验对送检的4只病鸡进行细菌分离培养,并对分离所得的细菌进行革兰氏染色镜检、生化试验、药敏试验、16S rDNA分子序列及动物感染试验等分析。结果显示,成功分离到了2株菌落形态不一的菌株,分别为革兰氏阴性杆菌与阳性球菌,根据分离地点和时间将其分别命名为GZHX2016-1及GZHX2016-2。GZHX2016-1为大肠杆菌,具有多重耐药性;GZHX2016-2为模仿葡萄球菌,血浆凝固酶阴性,对多种常用抗生素耐药。GZHX2016-1的16S rDNA与大肠杆菌（GenBank登录号：CP007442.1、CP014667、KT156725.1等）同源性达99.5%,GZHX2016-2与葡萄球菌（GenBank登录号：HM140412.1、AM944030.1、KM877513.1等）同源性达97.9%。GZHX2016-1与GZHX2016-2对小鼠都有致病性,GZHX2016-1的最小致死量为1.12×10⁸ CFU,GZHX2016-2为3.20×10⁷ CFU。综上所述,本试验成功从送检鸡中分离出1株致病性大肠杆菌和1株致病性血浆凝固酶阴性模仿葡萄球菌,该鸡场鸡群存在大肠杆菌与葡萄球菌混合感染的情况,且该鸡场感染细菌对多种抗生素耐药,应采取有效措施控制细菌在鸡群中的污染并限制抗生素在养鸡过程中的使用,以减少细菌耐药性的产生,保障鸡肉及鸡肉制品的食品安全。     

鹿场环境中细菌的分布及耐药性调查

为探究辽宁省西丰县鹿场环境中细菌的分布及耐药性情况,本试验采集了鹿场粪便、饮水、空气、饲料等样品,进行了细菌的分离培养及鉴定,对分离到的菌株16S rDNA基因进行PCR扩增、测序分析,并对分选出的致病菌和条件致病菌进行药敏试验。结果显示,所测样品共分离纯化出27株菌,公鹿精饲料、母鹿精饲料、粗饲料和水的含菌量分别为1.0×10⁵、8.7×10⁴、2.7×10⁷ CFU/g和2.9×10⁴ CFU/mL,表明水和粗饲料不符合国家规定的养殖场环境卫生要求;16S rDNA基因序列在NCBI比对后,鉴定出有大肠埃希菌、志贺氏菌等15种不同菌株,其中致病菌和条件致病菌共13种,这13种细菌对呋喃唑酮、多黏菌素B和头孢氨苄等耐药,对头孢曲松、环丙沙星和丁胺卡那等药物敏感。本试验结果可为鹿场细菌性疾病的防控及用药提供参考依据。     

大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织细胞因子表达及损伤程度的影响

本试验旨在研究体外感染金黄色葡萄球菌与大肠杆菌对奶牛子宫内膜组织中细胞因子白介素-6（IL-6）、IL-1β和IL-8的表达及损伤程度的影响。以体外培养的奶牛子宫内膜组织作为研究对象,采用1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL大肠杆菌与金黄色葡萄球菌对奶牛子宫内膜组织进行体外感染,通过实时荧光定量PCR和ELISA方法检测两种细菌刺激后奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白的表达量,并用HE染色法观察两种细菌感染后奶牛子宫内膜组织病理学切片。结果显示,1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL大肠杆菌体外感染后,奶牛子宫内膜组织中IL-6、IL-1β和IL-8 mRNA表达量均极显著高于空白对照组（P<0.01）;金黄色葡萄球菌感染浓度为1×10⁵、1×10⁶ CFU/mL时,IL-6、IL-1β mRNA表达量极显著高于空白对照组（P<0.01）,感染浓度为1×10⁷ CFU/mL时,IL-6、IL-1β mRNA表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,感染浓度为1×10⁶ CFU/mL时,IL-8 mRNA表达量显著高于空白对照组（P<0.05）,其他感染浓度均与空白对照组无显著差异（P>0.05）。奶牛子宫内膜组织感染1×10⁵~1×10⁹ CFU/mL金黄色葡萄球菌和大肠杆菌时,IL-6、IL-1β及IL-8蛋白表达量均极显著高于空白对照组（P<0.01）。相同浓度的大肠杆菌感染奶牛子宫内膜组织后,IL-6、IL-1β及IL-8 mRNA与蛋白表达量均极显著高于金黄色葡萄球菌感染组（P<0.01）。HE切片染色结果显示,大肠杆菌感染后仍有部分上皮细胞保留,而金黄色葡萄球菌感染后上皮细胞全部脱落。本试验结果表明,大肠杆菌与金黄色葡萄球菌感染奶牛子宫内膜组织后,引起的炎症反应不同。大肠杆菌感染后,促炎性细胞因子被显著上调,而金黄色葡萄球菌感染后破坏子宫内膜上皮细胞程度更加严重。     

1株罗曼粉鸡源申氏不动杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了解贵州省某养殖场罗曼粉鸡发病病原的特征及其耐药性,本试验从病死鸡中分离出一株革兰氏阴性菌,命名为GZ2019,并对其进行纯化培养、生化试验、16S rRNA序列分析、药敏试验及动物回归试验。分离菌在普通琼脂培养基上呈圆形凸起、表面光滑、半透明的灰白色小菌落,鲜血营养琼脂培养基上菌落形态与普通琼脂培养基上的一致,但不溶血;革兰氏染色结果镜检显示,分离菌为成双排列的阴性球杆菌,偶见单个存在或链状排列;生化试验结果显示,分离菌枸橼酸盐利用、过氧化氢酶反应为阳性,硝酸还原、氧化酶、葡萄糖发酵等反应为阴性,无运动性;16S rRNA序列分析结果显示,分离株与不动杆菌的核苷酸同源性在72.6%~99.9%之间,与申氏不动杆菌LUH 4760株（GenBank登录号：AJ275041）、SNSK 752株（GenBank登录号：MG584984）、MCDA01株（GenBank登录号：KY385627）及RP1株（GenBank登录号：MG461636）的核苷酸同源性高达99.9%;药敏试验结果显示,分离菌对头孢曲松和痢特灵敏感,对头孢哌酮、头孢呋辛、头孢他啶等5种药物中度敏感,对新霉素、环丙沙星、羧苄西林等17种药物耐药;动物回归试验结果显示,试验组小鼠隔离饲养1周仅死亡1只,死亡率为20%,表明该分离菌致病性较弱。本试验成功分离出1株低致病性申氏不动杆菌GZ2019,可为鸡源申氏不动杆菌病的预防和治疗提供一定的参考依据。     

一例鸡大肠杆菌病的病原分离鉴定

为确诊某养鸡场发病的原因,采集临床病死鸡的肝脏、脾脏进行细菌分离培养,并通过细菌形态学观察、生化试验、分子生物学鉴定和药物敏感性试验.结果:分离细菌为革兰氏阴性杆菌,菌落形态和生化鉴定特征与大肠杆菌相符;16S rDNA PCR扩增及基因同源性分析确定为大肠杆菌;菌株对安普霉素、泰妙菌素、多西环素、硫酸粘菌素较敏感,对替米考星、泰万菌素、磺胺间甲氧嘧啶、泰乐菌素、阿莫西林存在耐药性.     

甘肃省某奶牛场肠杆菌性乳房炎主要病原菌的分离鉴定与耐药性分析

为查明甘肃省某奶牛场发生临床型奶牛乳房炎的主要病原菌并选择治疗用敏感药物,随机无菌采集了6份临床型病牛乳样和1份大罐乳样,采用划线分离、菌落形态观察、革兰染色镜检、生化鉴定及16S rDNA序列分析等方法进行细菌分离鉴定,同时采用K-B法测定主要分离菌株对抗菌药物的敏感性。结果表明,从临床型乳房炎乳样中分离鉴定出大肠埃希菌、芽胞杆菌、凝固酶阴性葡萄球菌(腐生葡萄球菌)3种细菌,其中大肠埃希菌的分离率最高,为66.67%;从大罐奶样中也分离出大肠埃希菌。药敏试验结果表明,大肠埃希菌对氨苄青霉素、阿莫西林、头孢噻吩、杆菌肽、红霉素均存在不同程度的耐药,耐药率为29%~100%;对诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、头孢哌酮等药物敏感。说明此次牛场临床型乳房炎的主要病原菌是大肠埃希菌、葡萄球菌和芽胞杆菌,而且分离的大肠埃希菌具有多重耐药性。根据检测分析结果,给奶牛场提出针对性的防控措施,临床型乳房炎的发病率下降,病情得以控制。     

猪葡萄球菌临床分离株感染仔猪渗出性皮炎模型的建立

为建立研究仔猪渗出性皮炎发病机制及治疗制剂的动物模型,本研究采用PCR及BLAST序列比对方法对猪葡萄球菌437-2株毒素基因型进行鉴定,采用纸片扩散法检测其耐药性,通过不同浓度菌液人工感染仔猪试验分析该菌株的临床致病力、最小致病浓度、发病周期及组织病理学变化。结果显示,该分离菌株为ExhD毒素基因型,其毒素基因与德国分离株（GenBank登录号：AM94662.1）和俄罗斯分离株（GenBank登录号：AM950188.1）的ExhD基因同源性达99%;药敏试验结果显示,该菌株为多重耐药菌株,对青霉素、磺胺异噁唑、链霉素、阿奇霉素、红霉素、四环素、杆菌肽及诺氟沙星耐药;仔猪致病性试验结果显示,低剂量组在整个试验周期内仅注射部位表现出皮炎症状,而中、高剂量组在耳后皮下注射2 d后均出现显著的渗出性皮炎症状,病猪表现为耳后出现油皮,全身被毛粗糙,皮肤呈深褐色厚皮痂,有大片蜕皮和黄色液体渗出;感染仔猪的脏器和皮肤病理切片结果显示,低剂量组仔猪脏器无异常,耳部皮肤角质层角化过度,炎性细胞浸润,无棘皮层细胞分离,而中、高剂量组感染仔猪脏器具有一定程度的损伤,皮肤表皮棘细胞层出现明显的细胞分离。上述试验结果说明,利用猪葡萄球菌437-2株可成功建立仔猪渗出性皮炎模型,所需的最小攻菌浓度为1×10⁹ CFU/mL。     

Effects of Lactobacillus reuteri Supplementation on Inhibition of Pathogenic Escherichia coli in Kunming Mice

This study was aimed to explore the effect,dose of Lactobacillus reuteri on inhibition of pathogenic Escherichia coli infection on Kunming mice as well as its potential mechanism. 96 Kunming mice were randomly allocated into four groups with 4 replicates per group and 6 mice per replicate,which were control group,low dose group,middle dose group and high dose group. All of the mice feed commercial basal feedstuff,meanwhile the mice in control group drank tap-water,three treatments were supplemented with 1.0×10⁶,1.0×10⁷ and 1.0×10⁸ CFU/mL Lactobacillus reuteri in water. The feeding period was 28 days. All the mice were weighted, and the ADFI,ADG and F/G were calculated at the end of experiment.At the day of 28,pathogenic Escherichia coli (4.98×10⁹ CFU/mL) were irrigated to study the mortality. The indexes of intestinotoxin and antioxidation in serum and cecal microbacteria were inspected.The results indicated that supplemented with middle dose of Lactobacillus reuteri could significantly improve the final body weight,ADG compared with the control (P<0.05). The mortality, serum intestinotoxin level and MDA concentration,Escherichia coli and Staphylococcus were significantly lower than control group (P<0.05),while the T-SOD,T-AOC,GSH-Px,Lacobacillus and Bifidobacterium were significantly improved (P<0.05).In conclusion,with Lactobacillus reuteri supplementation,the growth performance was improved and antioxidant capacity and cecal microbacteria were enhanced after pathogenic Escherichia coli infected, mouse mortality caused by the pathogenic Escherichia coli was effectively reduced,and the effect of 1.0×10⁷ CFU/mL Lactobacillus reuteri was the best.     

Effects of Recombinant E. coli Expressing Heat-stable Enterotoxin on Intestinal Morphology and Antioxidant Capacity in Seven Days old Piglets

This experiment was conducted to investigate the effects of recombinant E.coli expressing heat-stable enterotoxin(STa) on intestinal absorption and barrier function, intestinal morphology and antioxidant capacity of 7 days old piglets. Twenty-four 7 days old piglets were allotted to four treatments:control group (artificial milk), STa group (artificial milk +2×10⁹ CFU E.coli LMG194-pBAD-STa), LMG194 group (artificial milk +2×10⁹ CFU E.coli LMG194), and K88 group (artificial milk +2×10⁹ CFU E.coli K88).The pigs were treated with E.coli on the 5th day and slaughtered on the 7th day. The results showed that, compared with the control group, villus height in jejunum, ileum and duodenum, crypt depth and villus height/crypt depth in duodenum, and small intestine villi surface area were significantly decreased in STa group (P<0.05). The activities of catalase (CAT) in ileum and colon, total nitric oxide synthase (TNOS) in serum, ileum, jejunum and colon, inducible nitric oxide synthase (iNOS) in colon were significantly decreased in STa group (P<0.05). STa group also had a higher levels of malondialdehyde (MDA) and hydrogen peroxide (H₂O₂) in serum (P<0.05). These results suggested that recombinant E.coli expressing STa could lead to intestinal injury and oxidative stress of 7 days old piglets.     

鸡源大肠杆菌和沙门氏菌的分离鉴定及耐药分析

为探究甘肃省民勤县某饲养场肉仔鸡腹泻的病原及复方中草药制剂和抗生素分别对分离病原的抑菌效果,对7日龄病死肉鸡进行解剖，通过采集死亡肉仔鸡肝脏、脾脏、心脏进行病原菌分离培养、形态观察、16S rDNA分子鉴定，最终鉴定该病死肉仔鸡为大肠杆菌与沙门氏菌混合感染。抑菌结果显示，复方中草药对分离得到的大肠杆菌、鸡白痢沙门氏菌、鸡副伤寒沙门氏菌均有良好的抑菌效果。10种抗生素药敏试验结果显示，此三株菌同时对氨苄西林、环丙沙星、四环素、恩诺沙星四种药物耐药；鸡大肠杆菌对庆大霉素、阿米卡星敏感，鸡白痢沙门氏菌对链霉素、氟苯尼考、头孢噻肟敏感，鸡副伤寒沙门氏菌对头孢曲松、链霉素、头孢噻肟敏感。上述研究结果为肉仔鸡大肠杆菌与沙门氏菌混合感染的分离鉴定以及科学指导用药提供参考。     

1株鹅源类志贺邻单胞菌的分离鉴定及致病性研究

【目的】 查明江苏某鹅场鹅发病及死亡原因。【方法】 剖检病死鹅，运用细菌分离纯化、染色观察、生化试验、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）鉴定、16S rDNA测定方法进行病原菌分离鉴定，通过药敏试验和小鼠致病性试验探究分离菌株的特性。【结果】 从患病鹅肝脏分离到1株革兰氏阴性短杆状细菌；生化试验结果显示，此菌株可发酵葡萄糖、麦芽糖、枸橼酸盐、尿素；MALDI-TOF MS鉴定结果显示，此菌株为类志贺邻单胞菌；16S rDNA序列对比分析发现，分离菌与类志贺邻单胞菌相似性最高，达98%以上；药敏试验结果显示，分离菌对左氧氟沙星、美罗培南、头孢西丁、庆大霉素等10种抗菌药敏感，对四环素、头孢吡肟、头孢他啶、头孢唑林表现为中介，对阿奇霉素、复方新诺明、氨苄西林等6种药物表现为耐药，是典型的多重耐药菌；小鼠致病性试验结果显示，分离菌对小鼠的半数致死量为5.0×10^6.5 CFU。【结论】 本试验首次报道了从鹅体内分离到致病性类志贺邻单胞菌，通过药敏试验筛选了左氧氟沙星、美罗培南、头孢西丁等有效的临床常用抗菌药，分离株对小鼠致病性较强，提示其带来的潜在风险不可忽视。     

鸡源大肠杆菌的耐药性监测及生物学特性研究

从山东省诸城地区6个集约化养鸡场采集50只病死鸡病料,从中分离鉴定得到32株大肠杆菌,对其进行了12种常规药敏试验,发现分离的菌株有不同程度的耐药性。对14株优势血清型菌株进行了质粒DNA提取分析,然后用Hind Ⅲ限制性内切酶对质粒进行了酶切。结果表明,质粒的得率为100%,来源相同的菌株具有相同或相似的质粒图谱,也就是说它们有共同的起源;来源不同的菌株的质粒图谱一般不同,即有不同的起源。将血清型和质粒图谱比较,结果发现,同一血清型可以有不同的质粒图谱,不同血清型可以有相似的质粒图谱,血清型与质粒图谱没有直接的联系。     

Antimicrobial resistance of Escherichia coli isolated from chickens

Faecal Escherichia coli isolated from healthy farm chickens, from farm chickens with avian influenza, and from chickens with diarrhoea were more resistant to antimicrobial agents (94-100%) than those isolated from healthy domestic chickens (20%). Transfer of drug resistance was readily achieved from strains isolated from both healthy and sick farm chickens, and from diarrhoeic chickens; it was more difficult to demonstrate in strains from domestic chickens. Resistant E. coli showing serotypes suspected to be enteropathogenic for man, i.e 0126:K71(B16), 044:K74 (L) and 0119:K69(B14), were isolated from faecal samples of healthy and sick farm chickens, but not from healthy domestic birds.     

环介导等温扩增法检测牛奶中结核分枝杆菌条件的优化

为优化环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,LAMP）法检测牛奶中结核分枝杆菌的条件,以结核分枝杆菌高度保守的16S rRNA基因为靶基因设计3对特异性引物（F3-B3、FIP-BIP、FLP-BLP）进行试验。比较改良后的CATB/NaCl法、细菌基因组DNA提取试剂盒及热裂解法提取其DNA的效率,确定最佳的提取方法。用灭菌处理过的牛奶对结核分枝杆菌悬液进行倍比稀释以确定该检测方法的敏感度。以牛奶中常见的布鲁氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、巴氏杆菌、沙门氏菌为对照,对该方法进行特异性测试。结果表明,改良后的CTAB/NaCl法对牛奶中结核分枝杆菌DNA的提取效果要优于其他两种方法。LAMP法检测结核分枝杆菌的灵敏度为3×10⁰ CFU/mL,对人工阳性乳中结核分枝杆菌检测的灵敏度为3×10¹ CFU/mL。     

动物源性大肠杆菌耐药性分析

目的:对吉林省长春市伊通地区分离出的113株动物源性大肠杆菌耐药性进行分析,了解猪源和鸡源大肠杆菌耐药程度及其耐药谱。方法:采用K-B纸片扩散法对大肠杆菌耐药性初步定性分析,并从中选出十株耐药谱不同的大肠杆菌测定其抗生素的最小抑菌浓度(MIC)。结果:113株均表现出不同程度的耐药,耐药谱广,且多表现为多重耐药。结论:动物源性大肠杆菌对抗生素的耐药性以多重耐药为主。113株对喹诺酮类、磺胺类、利福平耐药率达到90%以上,其中鸡源、猪源大肠杆菌耐药情况各不相同,二者均对丁胺卡那霉素、先锋必/舒巴坦较敏感,耐药率低于15%,可知丁胺卡那霉素、先锋必/舒巴坦可作为这些地区防治致病性大肠杆菌的首选药物。本实验结果对临床科学合理用药有重要指导意义。     

潍坊地区鸡大肠杆菌病的流行病学调查

通过对鸡大肠杆菌临床发病的问卷调查及笔者所在门诊2006年-2008年三年中鸡大肠杆菌确诊病例的统计,对山东潍坊地区鸡大肠杆菌的感染及发病情况进行了调查,在此基础上对某些发病鸡群进行了细菌的分离鉴定和血清型分型。结果显示:潍坊地区鸡大肠杆菌的感染具有较高的比例,O78、O2、O15为该地区的主要优势血清型。该研究为指导潍坊地区鸡大肠杆菌的防治提供了一定的依据。     

鸡传染性支气管炎病毒CQ/01/2004株的分离与鉴定

2004年从重庆某肉用鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集病料，按常规处理后接种9～10日龄鸡胚，通过鸡胚连续传代培养3代，并对该分离毒株的鸡胚致病性、血凝性和NDV的干扰特性进行检测．同时进行了动物回归试验。结果表明，该分离株具有IBV感染特征，可使鸡胚胚体出血、蜷缩、矮化；该分离毒株无直接血凝性，对NDV有明显的干扰作用；动物回归试验中有75％的感染鸡在10d内发病或死亡。剖检病死鸡可见肾苍白、肿胀，肾小管内充塞大量尿酸盐，支气管有出血点、有大量粘液。采用反转录．聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对CQ／01／2004的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定，结果表明该基因具有IBVSl基因的共有分子特征，将测序结果提交GenBank进行同源性检索，发现分离株CQ／01／2004和J株S1的同源性最高，核苷酸同源性为94％，氨基酸同源性为89．4％，与M41的核苷酸同源性为80．6％，氨基酸同源性为78．0％。试验结果表明，分离的病毒株CQ／01／2004为鸡传染性支气管炎病毒。     

Population of Salmonella serovar typhimurium in the cecum of gnotobiotic chickens with Escherichia coli and intestinal bacteria.

To test the interaction between various species of bacteria and Salmonella serovar typhimurium (S. typhimurium), the population of S. typhimurium was measured in the cecum of gnotobiotic chickens in the presence of Escherichia coli (E. coli) and one of the four intestinal bacteria; Lactobacillus acidophilus. Clostridium perfringens, Bifidobacterium thermophilum and Bacteroides vulgatus. Competitive exclusion of S. typhimurium by di-flora chicken was not demonstrated. But the population of S. typhimurium was temporarily suppressed in di-flora chickens with E. coli and L. acidophilus. In penta-flora chickens with E. coli and these four intestinal bacteria, the population of S. typhimurium was suppressed for only 2 days. In normalized chickens, the population of S. typhimurium was markedly suppressed.     

原场鸡大肠埃希氏菌多价灭活苗的制备及应用效果观察

用从豫北地区一家大型个体养鸡场分离到的致鸡大肠埃希氏菌病8个血清型菌株O1、O2、O78、O36、O11、O88和O50以及未知菌株的培养物,经0.4%的福尔马林灭活48h,制成原场大肠埃希氏菌多价灭活苗,含菌量为150亿/ml。分别免疫批10日龄鸡只,剂量0.2ml/只,使鸡只获得对原场大肠埃希氏菌株比较高的免疫力。该灭活苗的安全性和免疫原性良好,对同型菌株攻毒后对鸡只的保护率达90%以上,对鸡大肠埃希氏菌病有较强的预防作用。