猪葡萄球菌临床分离株感染仔猪渗出性皮炎模型的建立

为建立研究仔猪渗出性皮炎发病机制及治疗制剂的动物模型,本研究采用PCR及BLAST序列比对方法对猪葡萄球菌437-2株毒素基因型进行鉴定,采用纸片扩散法检测其耐药性,通过不同浓度菌液人工感染仔猪试验分析该菌株的临床致病力、最小致病浓度、发病周期及组织病理学变化。结果显示,该分离菌株为ExhD毒素基因型,其毒素基因与德国分离株(GenBank登录号:AM94662.1)和俄罗斯分离株(GenBank登录号:AM950188.1)的ExhD基因同源性达99%;药敏试验结果显示,该菌株为多重耐药菌株,对青霉素、磺胺异噁唑、链霉素、阿奇霉素、红霉素、四环素、杆菌肽及诺氟沙星耐药;仔猪致病性试验结果显示,低剂量组在整个试验周期内仅注射部位表现出皮炎症状,而中、高剂量组在耳后皮下注射2 d后均出现显著的渗出性皮炎症状,病猪表现为耳后出现油皮,全身被毛粗糙,皮肤呈深褐色厚皮痂,有大片蜕皮和黄色液体渗出;感染仔猪的脏器和皮肤病理切片结果显示,低剂量组仔猪脏器无异常,耳部皮肤角质层角化过度,炎性细胞浸润,无棘皮层细胞分离,而中、高剂量组感染仔猪脏器具有一定程度的损伤,皮肤表皮棘细胞层出现明显的细胞分离。上述试验结果说明,利用猪葡萄球菌437-2株可成功建立仔猪渗出性皮炎模型,所需的最小攻菌浓度为1×10~9 CFU/mL。     

抗菌肽NZ2114对来源于奶牛乳房炎的无乳链球菌及其生物膜的消杀作用

为探究抗菌肽NZ2114对无乳链球菌的体外抑制效果和相关机制,本试验以无乳链球菌ATCC 13813为研究对象,通过最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）、杀菌动力学、抗生素后效应和电镜学试验对抗菌肽NZ2114杀菌特性和杀菌机制进行评价,并进一步分析其对无乳链球菌生物膜和持留菌的抑制和消除作用。结果显示,NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813的MIC为0.23 μmol/L,对3株奶牛乳腺炎临床分离菌株CAU-FRI 1、2和3的MIC均为0.11 μmol/L,万古霉素对以上4株受试菌株的MIC值均为0.67 μmol/L,因此NZ2114的抗菌活性是万古霉素的2.91和6.09倍。同时,2×MIC、4×MIC浓度的NZ2114可在0.5 h内杀灭99.9%细菌,且持续药效作用可达270 min。扫描电镜结果显示,NZ2114处理后,细菌表面出现皱缩甚至破裂,细菌产生的生物膜消除。NZ2114在2×MIC下,24 h对早期生物膜抑制率为99.9%;在32×MIC下,24 h对成熟生物膜消除率达99.9%。此外,NZ2114在16×MIC时,对生物膜内的菌体具有99.9%以上的杀灭效果;万古霉素无法清除的持留菌经0.5×MIC的NZ2114处理后,也可以达到99%以上的消除率。激光共聚焦结果显示,NZ2114处理后的生物膜厚度从28.48 μm减少到10.32 μm,证明了其强效杀菌和抑制生物膜的作用。上述结果表明,NZ2114对无乳链球菌ATCC 13813杀菌活性高、速度快、抑制/去除生物膜能力强,并对膜内菌及持留菌具有高效杀菌作用,且作用显著高于万古霉素。因此,NZ2114具有开发成为治疗由无乳链球菌引起的奶牛乳房炎新型制剂的潜力。     

噬菌体裂解酶Lysep3的毕赤酵母重组表达和活性分析

试验以突破噬菌体裂解酶Lysep3应用瓶颈为切入点,采用酵母表达系统对其进行重组表达以期降低生产成本,同时初步探究其体外抗菌活性和安全性,以期为临床试验提供数据参考。根据毕赤酵母密码子偏爱性优化并合成Lysep3基因,将其连接至表达载体pPICZαA。经菌落PCR和测序验证后,将线性化重组载体pPICZαA-Lysep3电转化巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris X-33。重组酵母转化子经菌落PCR和摇瓶水平甲醇诱导重组蛋白初筛后,在5 L发酵罐中高密度发酵,发酵上清液经His-trap HPGE纯化柱纯化。通过抑菌试验和浊度试验进行rLysep3的抑菌活性分析,通过测定rLysep3对巨噬细胞RAW264.7细胞毒性和小鼠血红细胞溶血性进行rLysep3的安全性分析。结果显示,重组菌在5 L发酵罐中甲醇诱导120 h后Lysep3的表达量达749.2 mg/L。抑菌活性分析发现,rLysep3对肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌及无乳链球菌均具有抑菌活性,且rLysep3可与EDTA联合作用使肠炎沙门氏菌菌落数下降1.6~1.7个数量级。此外,细胞毒性试验发现,rLysep3在1 024 μg/mL浓度下细胞存活率仍可达78.75%;溶血性分析显示,1 024 μg/mL浓度下溶血率仅为1.58%。上述结果证明,通过毕赤酵母表达系统实现了Lysep3的重组表达,rLysep3具有体外抑菌活性,且具低细胞毒性和低溶血性。从抗菌活性、产业化制备及安全性等方面初步显示出rLysep3具有开发为临床治疗禽肠炎沙门氏菌感染的新型抗菌药物的潜力。     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌细胞膜、基因组和耐药性的影响

本试验以真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114和奶牛乳房炎源金黄色葡萄球菌为研究对象,旨在阐明抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的体外抗菌机制及其阻遏金黄色葡萄球菌耐药性的效果。通过16S rRNA基因鉴定对55份乳房炎奶样中的病原菌进行分离鉴定,采用纸片扩散法检测其耐药性,通过微量稀释法测定抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌的抑菌活性,借助流式细胞术和扫描电镜观察抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌细胞膜完整性及细胞形态的影响,通过凝胶阻滞和圆二色谱分析抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌基因组DNA的影响,将抗菌肽NZ2114与金黄色葡萄球菌共同孵育以研究抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌耐药性的影响,通过PCR进一步分析抗菌肽NZ2114对金黄色葡萄球菌携带的耐药基因的影响。结果表明,共获得10株金黄色葡萄球菌,分离菌对青霉素等9种抗菌药具有耐药性,且50%为多重耐药。抗菌肽NZ2114对10株金黄色葡萄球菌具有强抑菌活性,最小抑菌浓度(MIC)为0.5～1.0μg/mL。抗菌肽NZ2114可导致金黄色葡萄球菌S7细胞皱缩、细胞内容物泄漏,甚至细胞裂解,碘化丙啶(PI)细胞膜穿透率达5%,且抗菌肽NZ2114可与金黄色葡萄球菌S7基因组DNA结合并改变其DNA结构。金黄色葡萄球菌与1/4×MIC抗菌肽NZ2114孵育12 h后发现,除对阿莫西林和磺胺异噁唑的耐药率没有降低外,对其他抗菌药的耐药率均有不同程度的降低(10%～40%),且抗菌肽NZ2114对β-内酰胺类耐药基因(blaZ)及杆菌肽类耐药基因(braRS)的消除率分别达28.57%(2/7)和22.22%(2/9)。上述结果证明,抗菌肽NZ2114对耐药金黄色葡萄球菌具有体外强抑菌活性,其干扰耐药金黄色葡萄球菌细胞膜并结合胞内DNA的作用机制为其低耐药杀菌机制奠定了细胞学基础。同时抗菌肽NZ2114对耐药菌株的耐药性及相关耐药基因均有一定消除作用。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗金黄色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎的抗生素替代品。     

抗菌肽NZ2114对多重耐药2型猪链球菌感染小鼠的治疗效果评价

为探究抗菌肽NZ2114对猪链球菌感染小鼠模型的体内治疗效果,本试验以NZ2114和2型猪链球菌CVCC 3928为研究对象,利用小鼠模型评价NZ2114治疗猪链球菌感染的效果。36只ICR雌鼠随机均分为6组:空白对照组(不感染,腹腔注射0.2mL PBS)、阴性对照组(感染,腹腔注射0.2mL PBS)、试验Ⅰ和Ⅱ组(感染,分别腹腔注射0.2mL 2.5和5.0mg/kg NZ2114)、阳性对照Ⅰ和Ⅱ组(感染,分别腹腔注射0.2mL 7.5和15.0mg/kg头孢曲松钠)。结果显示,空白对照组和5.0mg/kg NZ2114试验组小鼠存活率均为100%,而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组小鼠存活率仅为50%。治疗1d后,5.0mg/kg NZ2114试验组小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降59.41%(P0.01)和69.19%(P0.01);而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组中小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降43.94%(P0.01)和19.60%(P0.05)。与阴性对照组相比,2.5 mg/kg NZ2114治疗组中抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的释放分别下降85.83%(P0.01)和56.20%(P0.05),5.0 mg/kgNZ2114试验组分别降低84.02%(P0.01)和43.86%(P0.05),而15.0mg/kg头孢曲松钠阳性对照组TNF-α及IL-1β的下降率均不显著,分别为24.49%和8.82%。另外,5.0mg/kg NZ2114试验组1d后即可明显减轻小鼠肺组织间质弥漫性炎细胞浸润等炎症症状,抑制肝细胞产生肿胀及空泡性变化,促进脾小结恢复正常;治疗7d后各器官组织临床症状评分基本恢复正常。上述结果表明,NZ2114能有效提高猪链球菌感染小鼠的存活率,显著降低病原菌在小鼠肺脏和肝脏的移位及血清中TNF-α和IL-1β的水平,并有效缓解肝脏、脾脏和肺脏的急性损伤,治疗效果优于头孢曲松钠,具有作为治疗临床猪链球菌病抗生素替代品的潜力。     

天水电脑农业专家系统研制

电脑专家系统是一种计算机系统,它依据存储于计算机中的专家知识和经验,结合用户提供的信息、数据和事实,模仿专家的思维方式进行推理和判断,对用户所提出的问题给予专家水平的解答。天水电脑农业专家系统的研制旨在解决“三农”服务中农业专家、农技人员、农民和农业科技的有效结合问题,通过系统使专家的知识得到最大限度发挥、农技人员的专业水平和知识面得以拓展,服务能力得以提高,农民的生产活动得到专家级的科学指导,使科技真正走进田间地头,转变为生产力,转变为经济效益。     

抗菌肽NZ2114对多重耐药2型猪链球菌感染小鼠的治疗效果评价

为探究抗菌肽NZ2114对猪链球菌感染小鼠模型的体内治疗效果,本试验以NZ2114和2型猪链球菌CVCC 3928为研究对象,利用小鼠模型评价NZ2114治疗猪链球菌感染的效果。36只ICR雌鼠随机均分为6组：空白对照组（不感染,腹腔注射0.2 mL PBS）、阴性对照组（感染,腹腔注射0.2 mL PBS）、试验Ⅰ和Ⅱ组（感染,分别腹腔注射0.2 mL 2.5和5.0 mg/kg NZ2114）、阳性对照Ⅰ和Ⅱ组（感染,分别腹腔注射0.2 mL 7.5和15.0 mg/kg头孢曲松钠）。结果显示,空白对照组和5.0 mg/kg NZ2114试验组小鼠存活率均为100%,而15.0 mg/kg头孢曲松钠阳性对照组小鼠存活率仅为50%。治疗1 d后,5.0 mg/kg NZ2114试验组小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降59.41%（P < 0.01）和69.19%（P < 0.01）;而15.0 mg/kg头孢曲松钠阳性对照组中小鼠肺脏和肝脏荷菌量分别下降43.94%（P < 0.01）和19.60%（P < 0.05）。与阴性对照组相比,2.5 mg/kg NZ2114治疗组中抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的释放分别下降85.83%（P < 0.01）和56.20%（P < 0.05）,5.0 mg/kgNZ2114试验组分别降低84.02%（P < 0.01）和43.86%（P < 0.05）,而15.0 mg/kg头孢曲松钠阳性对照组TNF-α及IL-1β的下降率均不显著,分别为24.49%和8.82%。另外,5.0 mg/kg NZ2114试验组1 d后即可明显减轻小鼠肺组织间质弥漫性炎细胞浸润等炎症症状,抑制肝细胞产生肿胀及空泡性变化,促进脾小结恢复正常;治疗7 d后各器官组织临床症状评分基本恢复正常。上述结果表明,NZ2114能有效提高猪链球菌感染小鼠的存活率,显著降低病原菌在小鼠肺脏和肝脏的移位及血清中TNF-α和IL-1β的水平,并有效缓解肝脏、脾脏和肺脏的急性损伤,治疗效果优于头孢曲松钠,具有作为治疗临床猪链球菌病抗生素替代品的潜力。     

抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的杀菌作用研究

为探究真菌防御素Plectasin衍生肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌的体外杀菌效果及其作用机制,本试验采用微量肉汤稀释法检测停乳链球菌CVCC 3938耐药性,通过NZ2114对停乳链球菌CVCC 3938最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）及在胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth,TSB）培养基和全脂灭菌（ultra-high temperature instantaneous sterilization,UHT）牛奶中的杀菌动力学曲线的测定评价其抗菌特性;借助扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪观察NZ2114作用下的细菌形态变化;使用凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱进一步分析NZ2114对细菌基因组DNA的作用。结果显示,停乳链球菌对氧氟沙星和四环素均产生耐药性,临床分离菌株则呈现多重耐药性,NZ2114对受试停乳链球菌和金黄色葡萄球菌的MIC值为0.11~0.45 μmol/L。抗菌肽在TSB培养基和全脂灭菌牛奶中均具有抑菌活性,且在短时间内（0.5~3 h）可使停乳链球菌菌落数下降3个数量级。扫描电镜、透射电镜和流式细胞仪结果表明,抗菌肽NZ2114能够破坏停乳链球菌细胞膜,导致其内容物泄漏。凝胶阻滞、荧光光谱和圆二色谱证实抗菌肽穿过细胞膜后与细菌基因组结合,破坏了DNA,以此达到杀菌目的。上述结果表明,抗菌肽NZ2114对奶牛乳房炎源停乳链球菌杀菌活性强,其破坏菌体细胞膜后可直接作用于胞内的基因组DNA并改变其二级结构。由此可见,抗菌肽NZ2114是一种极具前景的治疗停乳链球菌引起乳腺炎的抗生素替代品。     

农村信息化服务体系的构建模式

农村信息化服务体系建设包括农村公共信息平台和农村基层站点建设和信息员队伍建设等方面,加强信息技术对本地区农业和农村的全面渗透,为生产者、经营者和管理者提供农业科技成果和有价值的知识信息、技术信息、市场信息、服务信息,同时建立高效的信息应用示范体系和灵活的推广机制,加强基层农村科技人才和信息队伍的培养建设,做好“三农”信息服务工作,解决“信息不对称”和“最后一公里”问题,缩小“数字鸿沟”,提高农业综合生产能力和可持续发展能力,推进农村小康社会建设。     

猪葡萄球菌临床分离株感染仔猪渗出性皮炎模型的建立

为建立研究仔猪渗出性皮炎发病机制及治疗制剂的动物模型,本研究采用PCR及BLAST序列比对方法对猪葡萄球菌437-2株毒素基因型进行鉴定,采用纸片扩散法检测其耐药性,通过不同浓度菌液人工感染仔猪试验分析该菌株的临床致病力、最小致病浓度、发病周期及组织病理学变化。结果显示,该分离菌株为ExhD毒素基因型,其毒素基因与德国分离株（GenBank登录号：AM94662.1）和俄罗斯分离株（GenBank登录号：AM950188.1）的ExhD基因同源性达99%;药敏试验结果显示,该菌株为多重耐药菌株,对青霉素、磺胺异噁唑、链霉素、阿奇霉素、红霉素、四环素、杆菌肽及诺氟沙星耐药;仔猪致病性试验结果显示,低剂量组在整个试验周期内仅注射部位表现出皮炎症状,而中、高剂量组在耳后皮下注射2 d后均出现显著的渗出性皮炎症状,病猪表现为耳后出现油皮,全身被毛粗糙,皮肤呈深褐色厚皮痂,有大片蜕皮和黄色液体渗出;感染仔猪的脏器和皮肤病理切片结果显示,低剂量组仔猪脏器无异常,耳部皮肤角质层角化过度,炎性细胞浸润,无棘皮层细胞分离,而中、高剂量组感染仔猪脏器具有一定程度的损伤,皮肤表皮棘细胞层出现明显的细胞分离。上述试验结果说明,利用猪葡萄球菌437-2株可成功建立仔猪渗出性皮炎模型,所需的最小攻菌浓度为1×10⁹ CFU/mL。