表达MDV—gB基因的重组鸡痘病毒免疫效果观察

将马立克氏病病毒（MDV）gB基因插入鸡痘病毒中，构建了含有MDV－gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV)，用rFPV、火鸡疱疹病毒（HVT）冻干疫苗、rFPV HVT二联疫苗分别免疫1日龄AA肉用雏鸡，8日龄攻毒后观察免疫保护效果。结果表明，3种疫苗均诱导了免疫应答，免疫保护率分别为69％、69％和85％。该重组病毒疫苗的免疫效果与HVT疫苗的免疫效果相当，二者联用具有免疫协同作用。     

表达马立克氏病病毒CV1988／Rispens株糖蛋白B基因的重组鸡痘病毒疫苗的免疫保护研究

用鸡痘病毒载体表达马立克氏病病毒（MDV）糖蛋白B（gB)基因构建成重组鸡痘病毒（rF-PV)。以MDV GA或Md5和RBIB混合攻毒，在不同品种的鸡中评价rFPV-gB/R单价苗和与火鸡疱疹病毒（HVT）组成的二价苗的免疫保护效力。试验结果表明，MDV疫苗和FPV母源抗体阴性的SPF鸡和母源抗体阳性的商品鸡中，rFDV-gB/R均能提供免疫保护作用，且其中一种商品蛋鸡中rFPV-gB/R与HVT液氮苗或HVT冻干苗结合使用，均有显著的免疫协同保护作用。免疫学研究指出，rFPV-gB/R与常规疫苗一样，可显著地降低疫苗免疫攻毒鸡的病毒血症和羽囊排毒。     

鸡马立克氏病重组鸡痘病毒与火鸡疱疹病毒二价冻干疫苗免疫效力试验

本文对高效表达鸡马立克氏病(MD)血清Ⅰ型疫苗毒株CVI988／Kispem gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV—gB/R)和火鸡疱疹病毒(HVT)组成MD二价冻干疫苗时MD超强毒株(vvMDV)Md5和RB1B攻击后的免疫保护效果，实验室免疫效力试验的结果表明，HVT rFPV—gB／R二价冻千苗时超强毒株Md5和RB1B攻击时的免疫保护效果明显优于HVT冻干苗，接近CVI988／Rfispens的水平，本研究证明HVT rFPV—gB／R二价冻干疫苗是一种安全、方便、高效的疫苗。     

表达马立克氏病病毒CVI988/Rispens糖蛋白B重组鸡痘病毒的免疫性及安全性

用表达马立克氏病病毒(MDV)Ⅰ型疫苗株CVI988/Rispens 糖蛋白B(gB)基因的重组鸡痘病毒(rF-PV-gB/R)和鸡痘病毒(FPV)疫苗株282E4 免疫1 日龄不同品种的鸡,来评价2 种病毒株的安全性及免疫性。试验结果表明,rFPV gB/R和FPV 282E4 免疫鸡后对FPV 强毒攻击均可提供100% 的保护,对有FPV母源抗体的商品蛋鸡安全无毒性,而对无母源抗体的SPF鸡的毒性则不同。斑点杂交和Southern 杂交证实,rFPV-gB/R 中无氨苄青霉素的抗性基因。     

表达MDV gB和/或鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒免疫效力试验

将表达鸡γ干扰素基因、表达MDV gB基因、共表达MDV gB和鸡γ干扰素基因的重组鸡痘病毒进行组合免疫观察在SPF鸡、狼山鸡中的免疫保护作用。在狼山鸡中随rFPV-gB剂量的减少，保护效力逐渐下降，而在SPF鸡中10^4与10^6PFU的rFPV-gB提供相同的保护效力，但存在减缓增重的副反应；在所有的疫苗组合中，由10^6PFU的rFPV-gB、10^5PFU的rFPV-IFN-Ⅱ和4000PFU HVT组成三价疫苗的保护效力最高且不影响增重，表明鸡γ干扰素既或降低重组鸡痘病毒的减缓增重的副反应，又具有免疫佐剂作用，与重组鸡痘病毒及HVT配合成疫苗是预防MD有效的冻干制剂。     

表达鸡马立克氏病病毒gB基因的重组鸡痘病毒与火鸡疱疹病毒二价冻干疫苗的免疫效力

对高效表达鸡马立克氏病(MD)血清型疫苗毒株CVI998/Rispens gB基因的重组鸡痘病毒(rFPV-gB/R)和火鸡疱疹病毒(HVT)组成MD二价冻干疫苗时2种病毒的最适剂量配比进行了研究。试验表明,以对MD易感、MD和鸡痘病毒(FPV)抗体阴性SPF鸡为试验动物进行的试验中,不同免疫剂量的rFPV-gB/R(1×106、1×105、1×104PFU)同HVT组成的二价苗产生的免疫效力相当;以对MD易感、MD和FPV抗体阳性的狼山鸡进行的试验中,不同免疫剂量的rFPV-gB/R同HVT组成的二价苗产生的免疫力随rFPV-gB/R免疫剂量的降低而降低;所有的rFPV-gB/R+HVT的二价苗组均有一定的免疫保护作用。     

抗禽流感或传染性喉气管炎两种重组鸡痘病毒疫苗联合免疫的相互影响

“表达H5N1禽流感病毒HA和NA基因的重组鸡痘病毒（rFPV—AI）疫苗”以及“表达传染性喉气管炎病毒gB基因的重组鸡痘病毒（rFPV—ILT）疫苗”均已在实现商业化生产。由于两种疫苗使用了相同的载体病毒,如何使用才能减少相互干扰而产生最好的免疫效果。本研究设计了三个试验组：1）免疫rFPV—AI后间隔4周接种rFPV—ILT;2）rFPV—AI和rFPV—ILT混合后接种;3）将rFPV—AI和rFPV—ILT分别在两个翅膀同时免疫。结果表明,试验鸡接种rFPV—AI后4周接种rFPV—ILT,对传染性喉气管炎病毒WG株攻击的保护率为60％（6／10）,低于rFPV—ILT单独免疫组的保护率（100％,10／10）;rFPV—AI和rFPV—ILT混合后免疫组对禽流感病毒强毒攻击的保护率为80％（8／10）,对传染性喉气管炎病毒强毒攻击的保护率为70％（7／10）,而rFPV—AI和rFPV—ILT分两点同时接种对两种病毒攻击均能产生完全保护。本试验结果建议将这两种相同载体的重组病毒疫苗分两点同时接种以避免相互之间的干扰。     

超强马立克病病毒株的致病性研究

拟对一株超强马立克病病毒(MDV)SD2012-1株的致病性进行研究。将60只SPF鸡平均分成未免组、HVT免疫组和CVI988疫苗免疫组3组。于1日龄时对其进行马立克病(MD)疫苗免疫,于10日龄时进行SD2012-1攻毒;每天观察攻毒鸡临床症状,对病死鸡进行病理剖检和组织学观察;用PCR反应对感染鸡进行MDV跟踪监测。病理学研究结果显示:攻毒后第2周,试验鸡有轻微组织病变;攻毒后第6周,试验鸡有眼观病变,镜检有散在的肿瘤细胞团块;攻毒后第9周,试验鸡有明显的眼观肿瘤病变,镜检有大量肿瘤细胞聚集;SD2012-1可以突破CVI988疫苗免疫,引起高达30%的鸡发病。PCR跟踪监测结果显示:攻毒后第5天,未免组和HVT免疫组可检出MDV;攻毒后第10天,未免组和HVT免疫组阳性检出率均为100%,CVI988免疫组阳性检出率为30%;攻毒后第20天,3组试验鸡阳性检出率均为100%;用PCR检测病死鸡的肝、肾、肌胃、肠系膜、十二指肠、心和法氏囊样品的结果均为MDV阳性;攻毒300d后,健康存活鸡的羽髓PCR检测结果均为MDV阳性。结果表明,HVT疫苗对于SD2012-1株几乎无保护作用,超强马立克病病毒SD2012-1株能够长期在免疫鸡体内存在,突破免疫保护,引起发病,这对国内防控鸡马立克病提出了严峻挑战。     

MDV—gB重组病苗病毒诱导免疫的检测及保护性

用MDV-gB重组痘苗病毒RVV-gB、HVT冻干疫苗、痘苗病毒WR株分别按试验程序对细胞免疫及体液免疫检测试验中的1日龄SPF鸡进行免疫接种，并于15日龄时对试验各组鸡用GA株强毒攻击，经IFA抗体检测，及以PHA为有丝分裂原的淋巴细胞转化检测，结果表明，重组病毒和HVT冻干疫苗免疫鸡均获得了较高保护，体液免疫效果差异不显著；细胞免疫效果在攻毒有差异不显著，但攻毒后第2d开始，RVV-gB免疫组鸡的淋巴细胞转化率明显高于HVT冻干疫苗免疫组鸡。     

鸡传染性支气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗对异源LTJ95Ⅰ株病毒攻击的免疫保护

将共表达鸡传染性支气管炎病毒（mv）S1基因和鸡干扰素-γ基因的重组鸡痘病毒（rFPV—IFN-γ S1）接种4周龄SPF鸡,免疫3周后用同源（LX4株）及异源强毒株（LTJ95I）攻毒,评价重组疫苗对异源病毒的保护作用。结果显示,重组疫苗接种1周后,免疫鸡产生抗IBV的抗体;而且外周血中CD4^＋和CD8^＋T淋巴细胞的含量略高于非免疫对照组;攻毒后,异源强毒株攻毒的免疫组CD4^＋T淋巴细胞呈下降趋势,并且该组低水平CD4^＋的状态一直持续到试验结束,而其他组CD4^＋T淋巴细胞均迅速上升,峰值达到14．5％;同源强毒株攻毒的免疫组CD8^＋T淋巴细胞呈高水平的表达,而其他组攻毒后均无明显变化;保护率结果显示,同源强毒株攻毒免疫组的发病率和死亡率为21．43％和0％,与其他各组相比均有显著差异;另外同源强毒株攻毒的免疫组病理损伤与异源强毒株攻毒的试验组相比明显减轻,其排毒时间和排毒量也均有所减少;强毒攻毒后所有试验组体重无显著差异。以上结果可以说明,重组疫苗能对同源强毒株产生较好的免疫保护,但不能对遗传关系较远的强毒株产生有效的免疫应答。     

表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因重组鸡痘病毒疫苗免疫持续期试验

用表达传染性喉气管炎病毒gB基因和新城疫病毒F基因的重组鸡痘病毒（rFPV～gB—F）制备的疫苗免疫4周龄SPF鸡，免疫后的7、14、21、30、60、90、120、150、180d分别采血，分离血清，检测抗FPV和gB的抗体。结果表明重组疫苗免疫后14d，免疫鸡血清抗体已经全部阳转，免疫后的21d血清抗FPV的抗体出现峰值；此后便开始回落，到免疫后的6个月抗体水平已经接近阴性对照的水平。抗gB的抗体在免疫后的第二周达到阳性，之后的六个月都为阳性。在免疫后的每个月将免疫鸡取20只再分成两组。分别用新城疫强毒与传染性喉气管炎强毒的攻击。在免疫后的第一个月对新城疫的保护率为8／10，第2个月对新城疫的保护为7／10，第3个月为2／10，因此对新城疫的免疫保护期为2个月。在免疫后的5个月内可以使免疫鸡对传染性喉气管炎强毒攻击的保护率达到8／10以上，免疫后的6个月对ILT为8／13．因此rF—PV-gB—F对传染性喉气管炎的免疫保护期为5个月。     

鸡IFN-γ重组鸡痘病毒对鸡传染性腔上囊炎MB43弱毒疫苗免疫鸡免疫应答的影响

将重组鸡痘病毒（rFPV—IFN-γ）与IBDMB43弱毒疫苗联合接种SPF鸡，研究重组鸡IFN-γ对IBD疫苗免疫效果的影响。结果显示，rFPV—IFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组（MB43＋rFPV-IFN-）＂）及rlFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组（MB43＋rIFN-γ）在免疫后第2周即可检出ELISA抗体，比MB43疫苗单独免疫组早1周。用IBDVGx株攻击后，MB43＋rFPV-IFN-γ组和MB43＋rIFN-γ组免疫鸡的脾只有个别淋巴细胞核浓缩、核崩解，少数滤泡萎缩变性坏死；胸腺损伤程度轻于MB43疫苗单独免疫组和非免疫对照组。免疫后1周，3个免疫组外周血CD8^＋T淋巴细胞含量均显著高于非免疫对照组，CD4^＋T淋巴细胞含量变化不明显；攻毒后第2周，3个疫苗免疫组CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量均显著升高，各组之间CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量无明显差异。证实，rFPV—IFN-γ和rIFN-γ可加强疫苗的细胞免疫和体液免疫应答。     

重组鸡痘病毒表达的鸡IL-1β、IL-2和髓细胞生长因子对新城疫La Sota疫苗免疫效果影响

为研究在新城疫La Sota疫苗免疫不全的情况下，重组鸡痘病毒（rFPV）表达的鸡白细胞介素1β（IL-1β）、白细胞介素2（IL-2）和髓细胞生长因子（MGF）是否具有免疫增强作用。10日龄SPF鸡随机分成8组（I～VIII），每组18只，每只接种1个半数保护剂量（PD50）的LaSota疫苗，同时免疫不同剂量的表达鸡IL-1β、IL-2或cMGF的rFPV（rFPV-IL-1β、IL-2、cMGF）。结果：rFPV表达的IL-1β、IL-2或cMGF可以消除鸡痘病毒在免疫早期对雏鸡体重增长的影响；一定剂量的IL-1β和IL-2可使鸡脾脏中CD4^＋T细胞和CD8^＋T细胞的总体水平提高；免疫21d后用新城疫的F48E8强毒经肌肉攻毒。一定剂量的IL．1B和IL一2（I和III组）能提高La Sota疫苗的免疫保护率，而cMGF却没有表现出这种作用。本研究表明rFPV表达的IL-1β和IL-2在一定的剂量下可以增强La Sota疫苗的免疫效果，具有免疫增强作用。     

单表达和共表达NDVF和HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的免疫效力比较试验

为评价母源抗体对抗新城疫病毒(NDV)重组鸡痘病毒(rFPV)活疫苗免疫效力的影响,本研究用单表达、共表达NDV基因VII型病毒ZJ1株F、HN基因的rFPV活疫苗rFPV-12LSF、rFPV-12LSHN、rFPV-12LSFHN和油乳剂灭活疫苗分别免疫14日龄商品蛋鸡,rFPV疫苗的免疫剂量均为2×104pfu,免疫后21d分别用106ELD50NDV不同强毒株攻毒。其中F48E8株攻毒的免疫保护率分别为30.3%、73.2%、41.1%;而ZJ1株攻毒的免疫保护率分别为89.3%和35.8%、67.9%、78.6%、100%。用表达鸡IL-2基因的rFPV-12LSIL-2与rFPV-12LSHN联合免疫没有提高rFPV-12LSHN疫苗的免疫保护力。试验结果表明,单表达NDV HN基因的rFPV-12LSHN可作为NDV活疫苗候选株,为NDV重组鸡痘病毒活疫苗的进一步应用性开发奠定了基础。     

重组鸡痘病毒vFV282活疫苗最小免疫剂量及攻毒保护试验

将重组鸡痘病毒vFV282疫苗用生理盐水作10^-1，10^-2，10^-3，10^-4系列稀释，分别免疫7天龄鸡，于免疫后21d，分别用NDV、IBDV和FPV攻毒，观察其保护率，结果除NDV攻毒在10^-4组保护率为40％（4／10），其余各组均为100％（10／10）保护。表明该疫苗的最小免疫剂量≤10^-3TCID50/0.02mL。     

鸡传染性喉气管炎病毒gD基因与ChIL-2重组禽痘病毒的构建及其免疫效力试验

将鸡传染性喉气管炎病毒（ILTV）gD基因和鸡白细胞介素2（ChIL-2）基因通过同源重组法重组禽痘病毒转移载体,构建含ILTVgD基因和ChIL-2基因的重组禽痘病毒转移载体rFPVIL2ILTV—gD,蓝色蚀斑纯化法纯化重组病毒,用IFA检测重组病毒中ILTVgD基因的表达和用ELISA试剂盒检测ChIL-2的表达。重组病毒rFPV—IL2-ILTV-gD免疫试验鸡,间接ELISA测定血清中ILTV抗体效价,动物试验用构建的ILTV强毒以滴鼻方式攻击各组试验鸡,结果表明,外源基因在重组禽疽病毒中得到了稳定表达;ELISA检测结果表明在免疫7d后能够检测到血清抗体,免疫21d后血清抗体达到高峰,此后便开始逐渐下降,符合疫苗免疫的消长规律;攻毒后每组鸡的发病情况可以看出重组病毒rFPV-IL2-ILTV-gD组和疫苗对照组对ILTV强毒攻击的保护率分别为96％和92％,而空白对照组为8％。说明构建的重组病毒rFPV-IL2-ILTV—gD免疫效力稍优于弱毒疫苗,能够较好的保护免疫鸡群。     

传染性支气管炎重组鸡痘病毒免疫鸡对LHLJ04X I株病毒攻击的免疫保护作用

将表达鸡IFN-γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒（rFPV-IFN-γ S1）接种SPF鸡后,用与S1基因亲本毒株具有相同致病型且遗传关系较近的现地分离株LHLJ04XI病毒进行攻击．评价重组疫苗对现地分离病毒的保护效果。结果显示,重组病毒在免疫后1周即可检出ELISA抗体,并且免疫组外周血CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量均有显著上升。当用LHLJ04XI株病毒及亲本毒LX4攻击后,免疫鸡的肝脏、肾脏、脾脏及肺脏等脏器的病理损伤程度明显轻于非免疫对照组,排毒时间缩短,攻毒后现地分离株攻击的免疫组的发病率为27.3％（3／11）,死亡率为9．1％（1／11）,亲本毒攻击的免疫组发病率为26．67％（4／15）,死亡率为6．67％（1／15）,两者没有明显差异,而非免疫对照组的发病率和死亡率分别为100％（11／11）和45．5％（5／11）,与免疫组相比差异显著,说明重组疫苗对免疫鸡具有较好的保护效果。体重测定结果表明,攻毒前重组疫苗免疫组和非免疫对照组的体重差异不显著（P〉0．05）,攻毒以后免疫组体重的增加幅度高于非免疫对照组。以上结果表明,共表达鸡IFN-^γ基因和传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒活载体疫苗能对异源现地分离株的攻击产生较好的免疫保护,同时也减轻了重组疫苗对体重增长的抑制作用。     

抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗同居感染试验

疫苗的接触传播是疫苗免疫接种需要考虑的重要因素,为了检测重组鸡痘病毒载体疫苗水平传播的能力,对隔离条件下饲养的SPF鸡用重组鸡痘病毒基因工程疫苗接种,同时设立非免疫对照鸡,饲养期间特意延长清粪时间以增加感染的机会,1个月之后攻击传染性喉气管炎WG株强毒和鸡痘102株强毒,疫苗免疫鸡全部获得保护,而非免疫鸡则全部发病.在试验动物饲养场的自然条件下,将免疫鸡和试验对照两组鸡饲养在同一个鸡舍内,让疫苗毒的传播更接近自然条件.在每个月的攻毒试验中,对照鸡都没有获得对鸡痘和传染性喉气管炎强毒的保护.在疫苗免疫期间进行连续5个月的跟踪检测,同居未免疫鸡没有检测到抗传染性喉气管炎病毒gB抗体.这些实验结果表明抗鸡传染性喉气管炎重组鸡痘病毒基因工程疫苗不能通过接触传播.     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因和鸡Ⅱ型干扰素基因在重组鸡痘病毒中的共表达

将鸡Ⅱ型干扰素（ChIFNγ）基因和鸡传染性支气管炎病毒S1基因同时插人到鸡痘病毒转移载体中，构建含有这2个基因的鸡痘病毒转移载体pSY—ChIFNγS1。采用脂质体法将该质粒转染鸡痘病毒感染的鸡胚成纤维细胞（CEF），经过8轮蓝斑筛选，得到纯化的能够同时表达鸡Ⅱ型干扰素和鸡传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒rFPV—ChIFNγS1。rFPV—ChIFNγS1接种28日龄的SPF鸡1周后，可以检测到针对传染性支气管炎病毒S1基因的ELISA抗体，重组病毒接种鸡的CD4^＋、CD8^＋和γδTCR阳性T淋巴细胞的百分比含量显著高于非免疫对照鸡（P％0．05）；免疫4周后用传染性支气管炎LX4强毒株攻击，rFPV—ChIFNγS1免疫组仅有1只出现轻微的呼吸道症状（1／16），而非免疫对照组则有16只发病（16／16），并有2只出现死亡（2／16），表明rFPV—ChIFNγS1对接种鸡可以产生良好的保护效果。     

马立克病毒感染对鸡体液免疫的影响

为了验证和探讨马立克病毒(MDV)对肉鸡的免疫抑制作用,同时对比研究MDV疫苗和强毒株对机体免疫力的影响,试验通过人工攻毒MDV,建立MD模型,各组SPF鸡于2日龄注射NDV+H9N2 AIV灭活苗,7日龄时以LaSota株NDV弱毒疫苗饮水免疫,在SPF鸡14,21,28,35,42日龄时,各组无菌采血25份,分离血清,利用血凝/血凝抑制试验研究各组ND和H9N2的体液抗体水平。结果表明:在整个试验周期,疫苗对照组和空白对照组NDV和H9N2 AIV抗体水平差异不显著;攻毒组SPF鸡在21~42日龄时,NDV和H9N2 AIV抗体水平显著或极显著低于对照组。