牛蒡低聚果糖诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性

在室内条件下,研究了牛蒡低聚果糖对烟草花叶病毒抗性的影响及其影响机制。结果表明,在牛蒡低聚果糖处理叶（第三叶）中,接种烟草花叶病毒24h时对照处理叶片中该病毒含量大约是牛蒡低聚果糖处理叶片中的2.6倍,相对防效达61%;在未处理叶（第四叶）中,接种烟草花叶病毒24h时对照处理叶片可检测到TMV-CP的表达,而牛蒡低聚果糖处理叶则检测不到TMV-CP的表达。通过对抗病相关基因的检测发现,牛蒡低聚果糖处理和接种烟草花叶病毒都可诱导抗病相关基因（包括PR-1a、PR-2、PR-3、PI-1、PI-2和PAL）在烟草局部叶和系统叶中大量表达。这些结果表明,牛蒡低聚果糖可诱导烟草对烟草花叶病毒产生抗性,其作用机制可能在于诱导了抗病相关基因在植株体内的表达,增强了植株的系统抗性。     

dsRNA分解酶PAC 1对4种植物病毒、3种类病毒dsRNA的降解活性检测及转pac 1基因烟草的获得

 将来自粟酒裂殖酵母的pac 1基因,导入原核表达载体pET-5a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导,其表达产物能够降解4种植物病毒Cucumber mosaic virus(CMV)、Tobacco mosaic virus(TMV)、Rice black-streaked dwarf(RBSDV)和Rice dwarf virus(RDV)和3种类病毒Apple scar skin viroid(ASSVd)、Coleus blumei viroid(CBVd)和Hopstunt viroid(HSVd)的dsRNA。将pac 1导入双元载体pBI121,并转入根癌农杆菌LBA4404,以烟草(品种NC89)组培苗的叶片为受体材料进行转化,经过诱导愈伤、分化、再生和筛选培养,获得了50株Kan抗性植株,收获T₁种子分别播种,对这些转基因植株进行分子生物学检测。PCR、PCR-Southern和RT-PCR检测结果表明,pac 1基因已整合到受体基因组中。     

枯草芽孢杆菌OKB105产生的surfactin防治烟草花叶病毒病及其机理研究

本文研究枯草芽孢杆菌产生的脂肽化合物表面活性素surfactin对烟草花叶病毒病的防治效果,并检测烟草防卫相关基因的表达情况以解析抗病机理。利用6 mol/LHCl沉淀枯草芽孢杆菌OKB105的去细胞培养液,通过甲醇抽提,Sephadex LH20层析柱获得脂肽纯化物。经MALDI-TOF-MS和血平板溶血试验检测表明,纯化物中仅含有表面活性素surfactin。将表面活性素配成0.01 g/L溶液,处理烟草并接种TMV。结果表明, surfactin对烟草花叶病毒病有显著的防治效果,病斑抑制率为70.9%。通过Real-time PCR检测烟草的防卫相关基因的表达情况结果发现,烟草SA信号通路的PR1、PR3和PR5,以及ET通路的ETR1表达量显著提高,说明surfactin诱导了烟草依赖于SA和ET信号通路的诱导系统抗性（induced systemic resistance, ISR）反应。     

半夏凝集素基因的克隆及转基因烟草对蚜虫的抑制作用

采用同源序列克隆方法,通过设计特异性引物从甘肃西和半夏叶片基因组DNA中克隆到1条1 069 bp的半夏凝集素基因pta,与以同科内植物的mRNA为模板扩增得到的凝集素基因序列的同源性很高,达到98%以上,功能区完整,具有1条信号肽和3个甘露糖结合区,GenBank登录号AY725425。用该基因替换pBI121载体的GUS基因,正向插入35S启动子之下,构建了植物表达载体pBI-pta。通过农杆菌介导法转化烟草,从20株Kan抗性植株中得到PCR检测阳性植株14株,证明pta已整合到烟草基因组中。对随机挑取的7株PCR阳性植株进行了抗蚜虫(Myzus persicae)筛选试验,结果表明:不同株系蚜口密度抑制率在22.5%~89.4%,平均蚜口密度抑制率56.2%。     

激活蛋白PeaT1诱导烟草对TMV的系统抗性

枯斑三生烟草(Samsun-NN)经激活蛋白PeaT1诱导后接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),对TMV产生了明显的系统获得抗性,枯斑抑制率达54.15%,枯斑大小也受到一定程度的限制。研究结果表明,PeaT1处理烟草植株下位三片叶不同时间后,其上部叶片中PPO、POD和PAL 3种抗病防御酶活性均比对照提高,第4 d酶活性达到最高值。实时荧光定量PCR检测结果显示,经PeaT1诱导4 d后烟草叶片中抗病相关基因PR1a、PR1b、NPR1在转录表达水平上较未诱导对照都有不同程度的上调。由以上结果我们推测PeaT1诱导烟草产生了系统获得抗性,本研究为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的信号传导途径奠定了基础。     

β-氨基丁酸诱导烟草产生PR蛋白及对TMV的抑制作用

 本文研究了β-氨基丁酸(BABA)诱导系统侵染寄主烟草NC89产生PR蛋白及其对TMV的抑制作用。用5mmol/LBABA对抗性烟和非抗性烟进行叶面喷施处理均可以抑制烟草叶片中TMV的产生,平均抑制率分别达到59%和49%。BABA和SA处理均可以诱导2种烟草叶片中PR1、PR2和PR5基因的表达,其中对PR1的诱导作用相对较强。分别用BABA和SA处理非抗性烟草,在处理后的不同时间内2种药剂对PR1基因的诱导规律基本相同。用BABA和SA分别预处理非抗性烟草2d后接种TMV,2种药剂对烟草叶片中PR1基因的影响是完全不同的,其中,BABA处理后接种TMV抑制PR1基因的表达,在接种后第72h已经检测不到PR1基因的存在,SA处理后接种TMV对PR1基因的影响呈现弱-强-弱的变化趋势,在接种后第24hPR1的表达量达到最强,以后逐渐减弱。试验结果表明:BABA能够提高非抗性烟草对TMV的抗性,但是BABA诱导烟草产生抗TMV的作用机制可能是一种不同于目前普遍公认的SA的作用机制。     

利用RNA介导的抗病性获得高度抗马铃薯Y病毒的转基因烟草

 以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY^N)的RNA为模板,应用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,扩增出长度为801 bp的非翻译的马铃薯Y病毒外壳蛋白基因。将扩增的片段克隆到pBSK的BamHI和KpnI之间并进行了序列测定。用BamHI和KpnI从重组克隆载体上切下该基因并插入到质粒pROKII内得到植物表达载体pPVYCP。通过根癌农杆菌(LBA4404)介导的方法转化烟草NC89,经卡那霉素抗性筛选、PCR和Southern blot检测,获得82株转基因植株。Northern blot和Western blot分析表明,转基因植株只在RNA水平上得到了表达。抗病性试验表明转基因植株之间抗性水平存在着差异,其中有7株是对PVY^N高度抗病性的植株。转基因植株抗病特异性试验初步表明,对PVY^N表现高度抗病的植株对PVY^O也具有高度抗病性。     

丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒的诱导作用初探

为探讨植物源化合物丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的诱导作用,初步研究了丁香酚对接种TMV的烟草叶片中叶绿素和丙二醛(MDA)含量,防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物岐化酶(SOD)活性,以及病程相关蛋白基因 PR-1 、PR-3 、PR-5 表达的影响。结果表明:丁香酚处理可促进叶绿素的合成,减轻烟草体内MDA的积累,提高PAL、POD和SOD的活性,增强 PR-1 、PR-3 、PR-5 基因的表达。表明丁香酚可提高植物的诱导抗病性,进而减轻TMV对烟草的危害。     

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

 通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotiana benthamiana),并对转基因烟草T₀和T₁代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、赤星病菌(Alternaria alternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。     

葡萄病毒B CP基因植物表达载体构建及烟草遗传转化

葡萄病毒B Grapevine virus B(GVB)是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原,为开展抗GVB转基因研究,本研究利用RT-PCR技术克隆GVB外壳蛋白(coat protein,CP)基因,与植物表达载体pRI 101-AN连接构建植物表达载体pRI-GVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRI-GVB CP导入农杆菌LBA4404,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B’。共获得16个烟草再生株系,PCR检测其中3个株系为阳性,阳性株系播种获得的64株T_1代植株中有30株扩增到目的条带,阳性率为46.9%,表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T_1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定,其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。     

拟南芥诱导型启动子rd29A的克隆及其功能鉴定

以改善作物抗旱性为目的,采用PCR方法从拟南芥中克隆了诱导型启动子rd29A,序列分析发现克隆的rd29A启动子与已发表的rd29A启动子序列(D13044)的同源性为99.47%。利用DNA重组技术成功构建了rd29A启动子驱动GUS基因的植物表达载体p BI121-rd29-GUS,并通过农杆菌介导法转化烟草,转基因烟草叶片中GUS酶活性的组织化学检测结果表明,rd29A启动子能驱动目的基因的有效表达。因此,可以在后续的马铃薯抗旱转基因研究中直接应用。     

含双病原物诱导启动子无选择标记转基因烟草的获得

Transgenic plants are controversial for their edible and environmental security. Marker-free transgenic plants can be produced by the construction and transformation of plant expression vectors carrying twin T-DNAs. The construction of plant expression vectors harboring twin T-DNAs and two pathogen-inducible promoters was previously reported. These vector plasmids were introduced into tobacco plants and the transgenic tobacco plants were obtained. In this paper we report that T₁ transgenic tobacco seedlings were produced through classical genetics approach. Analysis of the seedlings demonstrated that some of them were marker-free lines. The segregation of exogenous genes in T₁ transgenic tobacco seedlings was tested by using two methods. Firstly, the ability of resistance to kanamycin was analyzed in T₁ transgenic tobacco seedlings from 14 transgenic plant lines. It was found that the segregation ratio of NPTII genes met well with Mendel’s law in 13 transgenic tobacco lines. So it was deduced that NPTII gene was as a single copy integrated into one of the homologous chromosomes. Then the NPTII genes and uidA genes of 130 T₁ transgenic seedlings were detected from the above 13 tobacco lines. The results showed that uidA genes were only detected in 20.77% of the seedlings, NPTII genes were solely detected in 22.31% of the seedlings, but both exogenous genes were in 53.85% of the seedlings. The segregation ratio of the two genes was consistent with the law of independent assortment (9∶3∶3∶1). These results suggested that the selective marker gene had no linkage with the reporter gene and they were segregated independently in the T₁ transgenic tobacco plants. This method, as compared with traditional backcross, is confirmed a more easy and rapid way to eliminate the antibiotic resistance gene used as a selective marker in transgenic plants.     

瞬时表达靶向TMV外壳蛋白基因的siRNA能干扰病毒侵染

 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是与内源性mRNA编码区某段序列同源的双链RNA导入细胞后,该mRNA发生特异性降解,从而导致该基因表达沉默的现象。小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)作为RNAi途径的重要中介,已被广泛应用于动、植物抗病毒治疗研究。本文以烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)外壳蛋白基因为靶位,设计合成表达小干扰RNA的寡核苷酸,亚克隆到植物双元表达载体pBI121中,直接转化根癌农杆菌。通过根癌农杆菌介导的瞬时表达法,研究了同源于TMV外壳蛋白的siRNA对TMV侵染的干扰作用。结果表明,瞬时表达的siRNA能够特异性干扰TMV侵染。含有重组表达载体pBI121/siRNA的根癌农杆菌渗入普通烟植株,在TMV接种后14d其上部叶片没有表现典型的花叶症状。对这些叶片进行Northern杂交试验也没有检测到TMV病毒的RNA积累或仅有很少量的积累。在枯斑寄主心叶烟上,siRNA的瞬时表达可使TMV侵染后的枯斑数明显减少,甚至不产生枯斑。此外,同源于TMV外壳蛋白的siRNA瞬时表达对非同源的黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)没有抑制作用,表明siRNA的干扰作用具有高度的同源依赖性。     

酵母pac1基因介导对葡萄B病毒的抗性

为明确广谱性抗病毒基因—酵母pac1基因对葡萄B病毒(Grapevine virus B,GVB)的抗性效果,通过农杆菌介导的遗传转化,将pac1基因导入西方烟37B,对转基因植株进行PCR鉴定及Southern blot分析,通过病毒摩擦接种观察症状以及实时荧光定量RT-PCR检测植株体内病毒含量,并对转基因植株抗病性进行初步鉴定。结果表明,目的基因pac1成功导入并整合至西方烟37B基因组,共获得10个转基因株系。不同株系的T1代烟草中阳性植株比例为16.7%~72.7%,表明目的基因可成功遗传到子代。接种病毒后转基因植株普遍延迟发病,但后期症状与非转基因对照相似,其中仅1个转基因株系B6具有不表现典型症状等抗性反应。接种植株病毒含量检测中,所有转基因植株均检测到病毒存在,但表现为抗病的B6株系中病毒含量显著低于非转基因对照,表明该转基因植株虽不能完全抵抗GVB侵染,但对GVB具有耐病性。     

利用RNA干扰介导抗病性获得兼抗四种病毒的转基因马铃薯

为获得兼抗马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)和马铃薯潜隐花叶病毒(Potato virus S,PVS)4种病毒的转基因马铃薯新材料,分别以这4种病毒全长CP基因为模板,通过设计PCR引物和亚克隆获得4种病毒CP基因相对保守区段的基因片段,并将其拼接成融合基因,以载体pHANNIBAL和pBI121为基础,构建RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体,利用农杆菌介导的转基因体系进行马铃薯遗传转化,并对获得的转基因马铃薯进行病毒抗性检测。结果表明,所获得的融合基因片段RH1和RH2,酶切鉴定分别得到长度为1 200 bp的条带,与预期片段相符;构建了含pdk内含子和RH1、RH2融合基因的RNAi植物表达载体,经Bam H I/Sac I双酶切,获得长度约3 200 bp的片段,表明RNAi植物表达载体pBI121-pRH构建成功;转化易感病毒马铃薯品种陇薯11号,PCR检测和PCRSouthern杂交分析表明融合基因已整合到陇薯11号马铃薯基因组中;抗病性检测显示4株转基因马铃薯植株对4种病毒均免疫。表明利用RNAi可筛选出抗多种病毒的转基因马铃薯新种质。     

Exogenous application of melatonin improves plant resistance to virus infection

In this study, melatonin (MEL)-mediated plant resistance to tobacco mosaic virus (TMV) was examined to study local infection in Nicotiana glutinosa and systemic infection in Solanum lycopersicum. Exogenous application of 100 µm MEL increased anti-virus infection activity to 37.4% in virus-infected N. glutinosa plants. The same treatment significantly reduced relative levels of virus RNA analysed by qRT-PCR and virus titres measured by dot-ELISA, and increased the relative expression levels of the PR1 and PR5 genes analysed by qRT-PCR, in virus-infected S. lycopersicum. MEL treatment induced considerable accumulations of salicylic acid (SA) and nitric oxide (NO) but did not significantly affect production of hydrogen peroxide (H₂O₂) in the virus-infected S. lycopersicum plants. Transgenic nahG N. tabacum was used to determine whether MEL-induced TMV resistance was dependent on the SA pathway. The results showed that the relative RNA level of the TMV analysed by qRT-PCR and virus titres analysed by dot-ELISA were not reduced by the MEL treatment in the nahG transgenic N. tabacum seedlings treated twice with 100 µm MEL. The increased relative expression levels of PR1 and PR5 were greatly reduced when cPTIO, an NO scavenger, was included in the MEL treatment. A working model of MEL-mediated plant resistance to TMV is proposed. MEL-mediated plant resistance to viruses provides a new avenue to control plant viral diseases.