大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒的诱导作用初探

为探讨植物源化合物丁香酚对烟草抗烟草花叶病毒(TMV)的诱导作用,初步研究了丁香酚对接种TMV的烟草叶片中叶绿素和丙二醛(MDA)含量,防御酶苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)和超氧化物岐化酶(SOD)活性,以及病程相关蛋白基因 PR-1 、PR-3 、PR-5 表达的影响。结果表明:丁香酚处理可促进叶绿素的合成,减轻烟草体内MDA的积累,提高PAL、POD和SOD的活性,增强 PR-1 、PR-3 、PR-5 基因的表达。表明丁香酚可提高植物的诱导抗病性,进而减轻TMV对烟草的危害。     

激活蛋白PeaT1诱导烟草对TMV的系统抗性

枯斑三生烟草(Samsun-NN)经激活蛋白PeaT1诱导后接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),对TMV产生了明显的系统获得抗性,枯斑抑制率达54.15%,枯斑大小也受到一定程度的限制。研究结果表明,PeaT1处理烟草植株下位三片叶不同时间后,其上部叶片中PPO、POD和PAL 3种抗病防御酶活性均比对照提高,第4 d酶活性达到最高值。实时荧光定量PCR检测结果显示,经PeaT1诱导4 d后烟草叶片中抗病相关基因PR1a、PR1b、NPR1在转录表达水平上较未诱导对照都有不同程度的上调。由以上结果我们推测PeaT1诱导烟草产生了系统获得抗性,本研究为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的信号传导途径奠定了基础。     

壳寡糖诱导对烟草体内TMV-CP基因表达的抑制作用

 采用实时荧光定量PCR方法, 研究了壳寡糖诱导对烟草体内TMV-CP基因表达量的影响。结果表明, 壳寡糖诱导后烟草表达了对TMV侵染的系统获得抗病性, 植株显症推迟4~7 d, 症状减轻, 平均严重度比对照降低了82.9%。同时烟草叶片中CP基因的表达量显著降低。壳寡糖诱导处理的植株在接种病毒时(0 h), CP基因的表达量(拷贝数/2μL)为0.918, 接种后168 h增加到167.730。而在不诱导对照植株内, CP基因的表达量在0 h为1.218, 接种后168 h猛增到648.623。换言之, 不处理对照的表达量在此期间增长了532.53倍, 而壳寡糖诱导处理植株中仅增长了182.71倍。试验证明壳寡糖诱导的系统获得抗病性强烈抑制了烟草体内TMV-CP基因的表达。     

真核表达产物Y3诱导烟草对烟草花叶病毒的抗性研究

从毛头鬼伞Coprinus comatus中提取的碱性糖蛋白Y3可以降低烟草花叶病毒（TMV）的侵染。克隆获得Y3蛋白cDNA后与真核表达载体pPIC-9k连接,重组载体pPIC-9k-Y3成功电转化入毕赤酵母Pichia pastoris后,转化子在28℃、250 r/min培养条件下,使用1.0%甲醇诱导表达6 d,成功实现了Y3蛋白的真核表达。300 μg/mL浓度的Y3蛋白对普通烟进行诱导处理后摩擦接种TMV结果表明,诱导处理后烟草体内除过氧化物酶POD外,多酚氧化酶PPO、苯丙氨酸解氨酶PAL和β-1,3葡聚糖酶活性都有不同程度提高。蛋白处理24 h后植株中PPO活性达到最大,为对照组的2倍。利用实时荧光定量PCR （qRT-PCR）研究抗性相关基因表达情况,Y3诱导后烟草植株碱性病程相关基因1（PR1-b）、病程相关基因非表达子1（NPR1）、PAL在转录水平上均显著上调（P<0.05）。推测真核表达产物Y3蛋白可通过提高水杨酸信号途径相关防御酶活性以及抗病基因转录来诱导烟草对TMV产生系统抗性,为Y3蛋白作为生物农药开发提供理论基础。     

一种新的90 kD胞外蛋白激发子诱导烟草系统获得抗性研究

 就棉疫病菌(Phytophthora boehmeriae Saw.)培养滤液中提纯获得的90 kD胞外蛋白激发子诱发烟草系统获得抗性进行了研究。以10 nmol/L激发子溶液注射处理Samsun NN烟草叶片24 h后,在处理叶片及其上、下各2片叶片接种TMV,结果是处理叶及其上、下各2片叶片上的枯斑数显著少于对照,诱抗防效达40.9%~53.1%;接种TMV7d后处理叶片的枯斑平均直径为1.23mm,显著小于对照叶片上的枯斑直径2.97mm,但是处理叶片的上、下叶片上的枯斑平均直径与对照没有显著差别。以10 nmol/L激发子溶液注射处理Samsun NN烟草叶片分别立即接种或于1、2、4、7、15 d接种TMV,结果证明该激发子诱导烟草对TMV的抗性以处理后第1d至第4 d接种为较好,防效达30.2%~5 0.4%;处理后立即接种和第7d接种TMV诱抗防效仅4%左右,处理叶片上的枯斑数与对照没有显著差别,表明较强的诱导抗性可持续时间<7d。用不同浓度激发子处理烟叶,所测定的0.5~100 nmol/L各浓度均可显著地诱发烟草对TMV产生获得抗性,诱导抗性效果为34.9%~5 8.2%,诱导抗性效果随浓度的降低呈下降趋势。以10 nmol/L激发子溶液注射处理W38烟草叶片,2 d后分别注射接种烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv.tabaci)菌液或喷雾接种烟草赤星病菌(Alternaria alternata)分生孢子,结果是,注射接种烟草野火病菌5d后处理叶片及其上、下叶片上的野火病病斑均显著小于对照;处理叶片上的赤星病病斑数及病斑面积明显小于对照,表明该激发子可诱导烟草对野火病和赤星病产生抗性。上述结果表明,90kD蛋白激发子诱导烟草产生的获得抗性是一种典型的系统获得抗性,该系统获得抗性对病原菌具广谱抗性。     

沼泽红假单胞菌蛋白Rhp-PSP对烟草花叶病毒的系统抗性诱导及互作蛋白筛选

本文研究了蛋白Rhp-PSP诱导烟草抗TMV过程中相关防御酶的活性以及丙二醛（MDA）含量的变化，同时测定了抗病相关基因的表达情况。试验证明，蛋白Rhp-PSP处理烟草后，叶片中苯丙氨酸解氨酶（PAL）、过氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）的活性显著提高，但降低了MDA含量。同时基因PR-1、PR-3、PR-5、PDF1.2表达显著上调，证明了蛋白Rhp-PSP具有诱导烟草产生抗TMV的活性。为阐明诱导抗性机制，利用酵母双杂交系统从烟草cDNA文库进行互作蛋白的筛选并验证，结果表明GPI锚定蛋白、VAN3结合蛋白及叶绿素结合蛋白A与蛋白Rhp-PSP互作。     

茉莉酸对PR-1、PR-2、PR-5和Ta-JA2基因 表达以及小麦白粉病抗性的诱导

 为了探索小麦抗白粉病分子机理,明确茉莉酸对小麦白粉病抗性的诱导作用、对植物抗病性标志基因PR-1、PR-2、PR-5和本实验室克隆的1个新基因Ta-JA2的激活作用,以及抗病性变化与基因表达变化之间的相关性,本研究以感白粉病的小麦品种“中国春”、“濮麦9号” 和“周麦18”为材料,用茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）喷洒小麦幼苗叶片进行诱导,通过离体叶段培养法接种白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici,Bgt）进行抗性鉴定;用实时定量PCR技术检测小麦叶片中PR-1、PR-2、PR-5和Ta-JA2基因的表达变化。结果表明MeJA处理可以显著提高“中国春”、“濮麦9号”和“周麦18”对白粉菌的抗病水平。茉莉酸处理显著激活了PR-1、PR-2、PR-5和Ta-JA2的转录。茉莉酸诱导的抗病性提高与抗病标志基因PR-1、PR-2、PR-5及Ta-JA2的表达增强呈正相关。植物激素茉莉酸是小麦抗白粉病反应的信号分子。     

β-氨基丁酸诱导烟草产生PR蛋白及对TMV的抑制作用

 本文研究了β-氨基丁酸(BABA)诱导系统侵染寄主烟草NC89产生PR蛋白及其对TMV的抑制作用。用5mmol/LBABA对抗性烟和非抗性烟进行叶面喷施处理均可以抑制烟草叶片中TMV的产生,平均抑制率分别达到59%和49%。BABA和SA处理均可以诱导2种烟草叶片中PR1、PR2和PR5基因的表达,其中对PR1的诱导作用相对较强。分别用BABA和SA处理非抗性烟草,在处理后的不同时间内2种药剂对PR1基因的诱导规律基本相同。用BABA和SA分别预处理非抗性烟草2d后接种TMV,2种药剂对烟草叶片中PR1基因的影响是完全不同的,其中,BABA处理后接种TMV抑制PR1基因的表达,在接种后第72h已经检测不到PR1基因的存在,SA处理后接种TMV对PR1基因的影响呈现弱-强-弱的变化趋势,在接种后第24hPR1的表达量达到最强,以后逐渐减弱。试验结果表明:BABA能够提高非抗性烟草对TMV的抗性,但是BABA诱导烟草产生抗TMV的作用机制可能是一种不同于目前普遍公认的SA的作用机制。     

海带多糖对烟草花叶病毒的抑制作用及其对烟草酶活性的影响

为明确海带多糖抗病毒剂对烟草抗烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）病的诱导抗性及其对TMV感染后的保护作用,采用间接酶联免疫吸附法（ELISA）研究0.5 mg/mL海带多糖水剂、0.5 mg/mL香菇多糖水剂、6.25 mg/L氨基寡糖素水剂和0.1 mg/mL盐酸吗啉胍.铜可湿性粉剂对TMV侵染的预防保护作用和对TMV感染植株的治疗作用,并检测施用海带多糖后烟草体内过氧化物酶（POD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及超氧化物歧化酶（SOD）活性的变化和海带多糖对感染TMV后烟草叶绿素含量的影响。接种前喷施0.5 mg/mL海带多糖后,再接种TMV病毒,其抑制率可达42.42%,与喷施6.25 mg/L氨基寡糖素抑制率44.96%的效果相当,预防保护作用较好;但两种药剂处理感病植株的治疗效果较差,其抑制率仅分别为38.93%和40.13%。海带多糖能够系统地诱导烟草体内POD、PAL及SOD活性,从而控制了感染TMV后烟草叶绿素含量下降。说明海带多糖可诱导植物产生抗病性。     

三环己基氯化锡对烟草花叶病毒的抑制作用

以心叶烟为试材,采用活体钝化法测定了三环己基氯化锡对烟草花叶病毒(TMV)的抑制作用,并通过电镜、琼脂糖凝胶电泳及紫外光谱法分别测定了三环己基氯化锡对TMV、TMV-RNA及TMV-外壳蛋白(TMV-CP)的体外作用。活体钝化结果显示:500 μ g/mL的三环己基氯化锡对TMV的抑制率达到75.77%±0.11% (P<0.01);三环己基氯化锡与TMV体外作用30 min,电镜下观察,显示病毒粒体出现断裂现象,粒体结构遭到破坏;琼脂糖凝胶电泳显示,三环己基氯化锡对TMV-RNA具有体外降解作用;紫外光谱法测定结果表明,三环己基氯化锡对TMV-CP的体外聚合过程具有抑制作用。     

青枯劳尔氏菌蛋白PopW表达条件优化及其诱导植物抗病功能

蛋白PopW是从青枯劳尔氏菌ZJ3721中鉴定得到的一种新的Harpin蛋白,为降低成本,我们对诱导剂IPTG的浓度进行了筛选,结果表明,诱导PopW蛋白表达的最适IPTG浓度为0.01 mmol/L。对蛋白PopW在诱导烟草抗TMV防卫反应中最适宜浓度和持效性的研究结果表明,用蛋白PopW处理的烟草在接种TMV后,其叶片上的枯斑数显著少于对照,且PopW浓度为2.5 mg/L时持效性可达8 d。同时,用蛋白PopW预处理的烟草接种TMV后,其叶片中PR-1a的表达量显著高于对照。浓度为2.5 mg/L的蛋白PopW可以分别诱导番茄对叶霉病、水稻对稻曲病的抗病性,防效达80.19%和86.84%。蛋白 PopW对辣椒还有一定的促生作用,田间经2.5 mg/L的PopW蛋白处理后可增产16.89%。     

Control of Tobacco mosaic virus by PopW as a result of induced resistance in tobacco under greenhouse and field conditions

In a previous study, we isolated a new harpin protein, PopW, from the bacterium Ralstonia solanacearum ZJ3721 that can induce a hypersensitive response in tobacco, Nicotiana tabacum, leaves. In the current study, we demonstrate that, in a greenhouse experiment, PopW induced tobacco-acquired resistance against the Tobacco mosaic virus (TMV) with a biocontrol efficacy of 80.9 to 97.4% at a concentration as low as 25 μg/ml in both PopW-treated and neighboring leaves. The resistance induced by PopW is systemic acquired resistance mediated by salicylic acid, which was certified by the development of resistance being accompanied by the expression of the pathogenesis-related-1 gene (PR1) 8 h after PopW was sprayed onto the tobacco leaves. In addition, hydrogen peroxide began to accumulate 10 h after PopW spraying, peaking at 24 h with a maximum concentration of 1.97 μM/g fresh weight. The activities of phenylalanine ammonia lyase (EC4.3.1.5), polyphenoloxidase (EC1.14.18.1), and peroxidase (EC1.11.1.7) also increased, peaking at different times in the PopW-treated tobacco leaves. PopW also reduced the level of TMV disease in field trials with a biocontrol efficacy of 45.2%. Furthermore, PopW both increased tobacco yield (by 30.4 more than in control plants) and improved tobacco foliar quality, with an increase of 50.2% in the number of first-class tobacco leaves from treated compared with untreated plants. All of these results indicate that the new harpin protein PopW has the potential to be an effective biocontrol agent against TMV in tobacco.     

Increased activities of ribonuclease and protease after challenge in tobacco plants with induced systemic resistance

Inoculation of 3-4 lower leaves of tobacco with tobacco mosaic virus (TMV) increased ribonuclease (RNase) and protease activities in inoculated leaves. Little or no increase in the activities were apparent in upper noninoculated leaves prior to challenge. After challenge with TMV or Peronospora tabacina, RNase activities increased more rapidly in the upper leaves of induced plants as compared to those of noninduced plants. Protease activities in the leaves challenged with P. tabacina or TMV also increased after challenge, but little or no differences in the activities were apparent between induced and noninduced plants. The incubation of purified TMV with leaf extracts obtained from induced challenged, noninduced challenged and noninduced unchallenged plants prior to inoculation did not affect the number of local lesions formed on tobacco plants.