通过圆二色谱研究蛋白激发子PeaT1的耐热性

PeaT1是来自于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)的一种具有耐热特性的蛋白激发子,包含一个初生多肽聚合复合物(nascent polypeptide associated complex,NAC)的结构域.为了研究PeaT1的耐热性机理,将其进行原核表达,经过亲和层析、离子交换层析和分子筛纯化后得到高纯度的PeaT1,通过同步辐射真空紫外圆二色谱(SRCD)对PeaT1的二级结构在不同温度下的变化进行了检测,温度从4℃经25℃、55℃升高到85℃,随后又经55℃、25℃回落到4℃.结果表明,在此过程中,α螺旋、转角结构比例先减少后增加;无规则卷曲比例先增加后减少,最后都基本恢复为原来的水平;而β折叠比例则变化不大.结合PeaT1的结构域信息,说明PeaT1主要是靠由β折叠组成的NAC结构域形成二聚体维持其热稳定性.     

棉铃虫幼虫取食转HaHR3基因烟草后中肠组织的病理变化

<正>通过植物介导的RNAi能够沉默棉铃虫蜕皮调节转录因子Ha HR3基因。棉铃虫取食含有dsRNAs的转基因烟草后,其Ha HR3基因的转录水平及蛋白表达水平均被有效抑制,导致棉铃虫幼虫生长发育畸形或死亡(尹富仕等,2010;Xiong et al.,2013)。本研究利用透射电镜观察棉铃虫取食转Ha HR3基     

棉铃虫HaHR3基因的克隆及其植物RNA干扰载体的构建

采用RT-PCR方法克隆了棉铃虫蜕皮调节转录因子HaHR3基因,该基因含有1671 bp的完整开放阅读框。序列分析表明,HaHR3与多种昆虫蜕皮调节转录因子高度同源。利用生物信息学方法对HaHR3的结构特征进行分析发现,HaHR3具有蜕皮调节转录因子超家族的典型特征,包括两个锌指结构和一个DNA结合结构域,不存在信号肽序列和N糖基化位点。选择HaHR3基因的部分片段构建了RNAi中间载体pRNAi1017-HaHR3sa,再将HaHR3正反向序列亚克隆至植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS,成功构建了由35s启动子调控的HaHR3基因的正反向RNA干扰载体pCAM-RNAi-HaHR3。这一载体的成功构建为下一步通过植物介导的RNA干扰技术防治棉铃虫打下了坚实的基础。     

激活蛋白PeaT1诱导烟草对TMV的系统抗性

枯斑三生烟草(Samsun-NN)经激活蛋白PeaT1诱导后接种烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV),对TMV产生了明显的系统获得抗性,枯斑抑制率达54.15%,枯斑大小也受到一定程度的限制。研究结果表明,PeaT1处理烟草植株下位三片叶不同时间后,其上部叶片中PPO、POD和PAL 3种抗病防御酶活性均比对照提高,第4 d酶活性达到最高值。实时荧光定量PCR检测结果显示,经PeaT1诱导4 d后烟草叶片中抗病相关基因PR1a、PR1b、NPR1在转录表达水平上较未诱导对照都有不同程度的上调。由以上结果我们推测PeaT1诱导烟草产生了系统获得抗性,本研究为进一步阐明PeaT1诱导植物抗病的信号传导途径奠定了基础。     

微生物蛋白激发子PeaT1的获得及诱导水稻抗旱性的初步研究

PeaT1是来源于极细链格胞菌（Alternaria tenuissima）的一种蛋白激发子,具有促进植物生长和提高抗逆性的功能。为了进一步研究该激发子的功能,构建了表达该蛋白质的原核表达载体pET28a-peaT1,诱导表达获得大量目的蛋白质。利用AKTA蛋白质纯化系统,通过亲和层析、离子交换层析和分子筛等纯化技术,获得高纯度的PeaT1蛋白。用不同浓度的纯化蛋白处理水稻,进行抗旱性检测,结果表明PeaT1可明显提高水稻的抗旱性。     

链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA酵母表达文库的构建

为了解链格孢菌（Alternaria tenuissima）遗传学背景,克隆及研究该菌功能基因,根据Gateway技术构建了既能在酵母细胞中表达外源基因又能在原核细胞大量复制的酵母表达载体pRS-DEST42,构建了细极链格孢菌（A. tenuissima）cDNA酵母表达文库。经检测,该文库的平均滴度为2.44×106（cfu/ml）,文库总容量为2.44×107,阳性克性率为100%,平均插入片段约为1.38kb。细极链格孢菌（A. tenuissima）cDNA酵母表达文库是一个质量较高的表达文库,为克隆与分离全长目的基因及其功能奠定了坚实的基础。     

细极链格孢菌Hog1 MAPK(酵母)同源基因AtHOG1的克隆与功能分析

为阐明高渗透压甘油激酶在链格孢菌中的功能,通过遗传学手段,构建了细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)cDNA酵母表达文库,并对其进行筛选而获得细极链格孢菌高渗透压甘油蛋白激酶AtHOG1基因,该基因全长1 539 bp,编码355个氨基酸.AtHog1p含有MAPK保守的激酶激活区域"TGY",与来源于烟曲霉(Aspergillus fumigatus)AfOsm1p(XP-752664)、稻瘟菌(M.grisea)MG01822(XP-363896)及酿酒酵母(S.cerevisiae)ScHog1p(AAB67558)高度同源,相似性分别为94%,90%和80%.在高渗环境下,AtHOG1基因与ScHOG1基因功能相同.链格孢菌中存在HOG通路信号途径,AtHOG1基因可能与链格孢菌的逆境适应性调节密切相关.     

链格孢菌（Alternaria tenuissima）cDNA酵母表达文库的构建

为了解细极链格孢菌(Alternaria tenuissima)遗传学背景,克隆及研究该菌功能基因,根据Gateway技术构建了既能在酵母细胞中表达外源基因又能在原核细胞大量复制的酵母表达载体pRS-DEST42,构建了细极链格孢菌(A.tenuissima)cDNA酵母表达文库.经检测,文库的平均滴度为2.44×106 cfu/ml,文库总容量为2.44×107 cfu(colony-forming unit),阳性克隆率为100%,平均插入片段约为1.38 kb.细极链格孢菌cDNA酵母表达文库是一个质量较高的表达文库,为克隆与分离全长目的基因及其功能奠定了坚实的基础.     

水稻品种日本晴粳稻组培培养基的筛选及转稻瘟菌蛋白激发子基因植株的获得

采用B6、MS和NB 3种培养基,以粳稻(Oryza sativa ssp.japonica)品种日本晴的成熟胚为受体材料进行组织培养,比较了3种培养基的效果.结果表明,在3种培养基中,NB培养基对愈伤组织的诱导效果最好,转化效率最高,最适合于日本晴成熟胚的组织培养.在此基础上,通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)导转化法将稻瘟菌蛋白激发子基因pcmG1导人日本晴基因组,获得了转基因水稻植株.PCR、Northern blot和Western blot分别证实了pcmG1基因的整合、转录和表达.遗传分析表明,外源基因在转基因日本晴后代中的分离符合3:1的理论比例.