油菜菌核病生防芽孢杆菌的分离鉴定及其脂肽化合物分析

采用平板拮抗筛选,分别从西藏日喀则地区和拉萨地区杂草根围土壤中筛选到2个对油菜菌核病菌有显著拮抗活性的芽孢杆菌菌株RJGP16和YBWC43。通过生理生化鉴定、16S rDNA序列分析和BOX-PCR指纹图谱分析,鉴定菌株RJGP16为萎缩芽孢杆菌Bacillus atrophaeus, 菌株YBWC43为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens。离体叶片试验结果显示,菌株RJGP16和YBWC43对油菜菌核病菌防治效果分别为50.24%和100.00%。脂肽化合物种类分析显示,菌株RJGP16产生脂肽化合物表面活性素和芬枯草菌素,菌株YBWC43产生杆菌霉素D和芬枯草菌素。表明菌株RJGP16和YBWC43对油菜菌核病的防治效果与其产生的脂肽化合物有关。     

枯草芽孢杆菌OKB105产生的surfactin防治烟草花叶病毒病及其机理研究

本文研究枯草芽孢杆菌产生的脂肽化合物表面活性素surfactin对烟草花叶病毒病的防治效果,并检测烟草防卫相关基因的表达情况以解析抗病机理。利用6 mol/LHCl沉淀枯草芽孢杆菌OKB105的去细胞培养液,通过甲醇抽提,Sephadex LH20层析柱获得脂肽纯化物。经MALDI-TOF-MS和血平板溶血试验检测表明,纯化物中仅含有表面活性素surfactin。将表面活性素配成0.01 g/L溶液,处理烟草并接种TMV。结果表明, surfactin对烟草花叶病毒病有显著的防治效果,病斑抑制率为70.9%。通过Real-time PCR检测烟草的防卫相关基因的表达情况结果发现,烟草SA信号通路的PR1、PR3和PR5,以及ET通路的ETR1表达量显著提高,说明surfactin诱导了烟草依赖于SA和ET信号通路的诱导系统抗性（induced systemic resistance, ISR）反应。     

丁香假单胞大豆致病变种harpin编码基因的克隆表达与功能研究

采用PCR方法从丁香假单胞大豆致病变种(Pseudomonas syringae pv.glycinea)A1和S1菌株中分别克隆到大小为1 026和1 038 bp的hrpZ基因(hrpZPsgA1和hrpZPsgS1),对该基因进行了原核表达和功能研究。SDS-PAGE显示其表达产物为相对分子质量62×103的融合蛋白,harpinZPsgA1和harpinZPsgS1的相对分子质量约为35×103。harpinZPsgS1的粗提蛋白经GSTrap FF纯化后质量浓度可达1.1 mg.mL-1。生物活性检测表明,该蛋白对热稳定,对蛋白酶K敏感,可以在非寄主植物烟草上激发过敏反应,过敏反应可以被真核生物代谢抑制剂抑制,并且对烟草有明显的促生作用。序列比对发现,来自丁香假单胞大豆致病变种的hrpZ基因可分为2类,一类以hrpZPsgA1为代表,包括hrpZPsg12,另一类以hrpZPsgS1为代表,包括来自r0和Race4菌株的hrpZ基因。这2类hrpZ基因的核苷酸同源性为79%,氨基酸同源性为77%,均富含甘氨酸,不含半胱氨酸,与假单胞菌属以外的其他革兰氏阴性植物病原细菌harpin编码基因不存在相似性。     

载HarpinXooc蛋白纳米粒的制备及生物学效应测定

为了评价载HarpinXooc蛋白纳米粒的性状及其在农业领域的应用效果,利用静电聚合原理,以壳聚糖为载体,多聚磷酸钠为交联剂制备载HarpinXooc蛋白纳米粒,测定其粒径、zeta电位、包封率、载药量和释放情况,考察振荡时间对纳米粒的影响.结果显示:载HarpinXooc蛋白纳米粒形态均一,粒径、zeta电位、包封率和载药量分别为(270.0±3.0)nm、(16.5±0.9)mV、62.7%±1.8%和12.6%±2.4%,具有缓释效应,可以诱导烟草产生过敏性反应和更好地促进植物生长.表明:此方法制备条件缓和,工艺简单,包封率较高,制得的载HarpinXooc蛋白纳米粒生物学效应好.     

生防假单胞菌Pf-5对秀丽隐杆线虫的毒性及其作用机制

[目的]本文旨在研究生防假单胞菌(Pseudomonas protegens) Pf-5菌株的杀线虫活性,以及鉴定其产生的主要杀线虫活性物质。[方法]采用基于sac B基因的蔗糖致死无标记突变体系,构建Pf-5菌株的相关突变体;以模式线虫秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)为作用对象,利用绿色荧光蛋白基因对菌株进行标记,研究菌株对秀丽隐杆线虫的致死效果;利用扫描和透射电镜研究Pf-5菌株杀线虫物质的作用机制。[结果]Pf-5菌株对秀丽隐杆线虫具有很强的致死活性,用不同浓度的Pf-5菌液处理线虫,48 h对秀丽隐杆线虫的致死中浓度(LC50)为4.92×10~7CFU·mL~(-1),96 h LC_(50)为3.58×10~6CFU·mL~(-1);处理48 h时,野生型Pf-5菌株对秀丽隐杆线虫的致死率达到73.57%,而突变体Pf-5ΔfitD的致死活性显著下降,只有25.04%; Pf-5菌株fitD基因的Delivery结构域和CROPS结构域缺失突变体对线虫的致死活性也显著下降,表明FitD蛋白是Pf-5菌株的主要杀线虫物质。扫描电镜结果表明,Pf-5菌株及其突变体都不会破坏线虫的体壁;透射电镜的结果则表明,Pf-5菌株导致线虫肠道绒毛变薄和脱落,而突变体Pf-5ΔfitD则没有此效果。[结论]生防假单胞菌Pf-5菌株中杀线虫物质为Fit D蛋白,初步表明其作用位点在肠道部位。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

利用转座子TnYLB-1构建枯草芽孢杆菌的突变体文库

为了鉴定枯草芽孢杆菌定殖和促进植物生长相关基因,用携带转座子TnYLB-1的穿梭载体pMarA转化枯草芽孢杆菌OKB105菌株.高温诱变条件下,筛选了2 000个转座子插入突变的单克隆,构建了OKB105菌株的突变体文库.对随机挑选的15个突变体采用PCR及Southern杂交验证,结果表明:转座子TnYLB-1以单拷贝、随机方式插入到OKB105菌株的染色体上.     

芽孢杆菌对大豆根腐病防治效果研究

选择20株从西藏地区植物根际土壤分离鉴定的具有生防潜力的芽孢杆菌,通过平板抑菌试验,筛选出对大豆根腐病病原菌尖孢镰刀菌嗜管专化型(Fusarium oxysporumf.sp.tracheiphilum)拮抗效果好的菌株11株,并利用这些菌株的发酵液作为活性成分,添加一定比例的各种助剂,制备出生物种衣剂.室内沙培试验结...     

西藏低温适生芽孢杆菌的分离鉴定及其抗菌和促生作用

从西藏拉萨色拉寺杂草根围土壤中分离到1株低温适生芽孢杆菌LSSC3,对该菌株进行了形态学、生理生化和分子生物学鉴定及抗菌和促生作用研究。菌株LSSC3细胞短杆状,芽孢圆形,10℃条件下生长良好。生理生化特征显示,该菌株与巨大芽孢杆菌Bacillus megaterium特征一致,但ERIC-PCR指纹图谱分析表明其与B. megaterium模式菌株存在显著差异。16SrRNA基因序列分析结果显示,菌株LSSC3与B. subtilis和B. atrophaeus的系统发育相似性均很高。进一步通过gyrB基因测序和比对,其同源性与B. atrophaeus达到100%,没有找到与B. subtilis的同源性关系。据此,将其鉴定为B. atrophaeus。菌株LSSC3对植物病原真菌和细菌均具有很强的抑制作用,同时对拟南芥有良好的促生长作用。该菌具有耐低温和生防的双重特点,具有在农业生产上应用的潜力。     

水稻白叶枯病菌hrf2基因表达的His-Harpin_(Xooc)蛋白的纯化及分析

利用已构建的工程菌表达His-HarpinXooc蛋白,分析His-HarpinXooc蛋白的纯化条件、产量、等电点和生物活性等。结果表明:1)在使用HisTrap HP Kit进行纯化时,咪唑浓度对于蛋白纯度影响最大,其中150mM咪唑最适合于洗脱His-HarpinXooc蛋白,缓冲液、洗脱次数等对纯化的影响不大;2)每升菌液可获得高纯度的HisHarpinXooc蛋白为20mg,其等电点约为4.7;3)纯化所得His-HarpinXooc蛋白与不含His标签的HarpinXooc生物活性一致,具有Harpin蛋白诱导烟草产生过敏反应的典型特征。此为His-HarpinXooc蛋白的应用奠定基础。