杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A. salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A. salmonicida subsp. masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5 µL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5 µL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检     

水产动物气单胞菌鉴定方法研究进展

<正>气单胞菌属于γ-变形菌纲、气单胞菌目、气单胞菌科、气单胞菌属(Aeromonas),该属包括嗜水气单胞菌(A.hydrophila)、温和气单胞菌(A.sobria)、豚鼠气单胞菌(A.caviae)、维氏气单胞菌(A.veronii)和杀鲑气单胞菌(A.salmonicida)等20个种,其中嗜水气单胞菌和杀鲑气单胞菌又分别包括5个亚种[1]。气单胞菌广泛分布于自然生态系统     

绿鳍马面鲀与许氏平鲉杀鲑气单胞菌病原的分离和鉴定

2018年和2019年,山东省烟台市蓬莱市一养殖场工厂化养殖的绿鳍马面鲀(Thamnaconus septentrionalis)和许氏平鲉(Sebastes schlegeli)发病死亡,主要症状为嘴部溃疡、红肿和出血。从发病鱼内脏中均可分离到大量形态一致的优势菌,分别命名为2018TS-1和2019SS-1,分离菌株经16S rRNA测序、生理生化鉴定和vapA基因分析确定为杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种(Aeromonas salmonicida subsp. masoucida)。人工感染结果显示,2018TS-1和2019SS-1分别能引起绿鳍马面鲀和许氏平鲉的死亡,被感染鱼呈嘴部红肿症状,与自然发病症状一致,其半数致死量分别为1.78×105和0.89×105 CFU/尾。本研究首次报道了国内工厂化养殖绿鳍马面鲀和许氏平鲉感染杀鲑气单胞菌的病例,是目前人工养殖绿鳍马面鲀的首个疾病报道,也是继大西洋鲑(Salmo salar)、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和裸盖鱼(Anoplopoma fimbria)等品种后,在山东省海水养殖鱼类中再次发现杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的感染。本研究结果丰富了杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的感染宿主范围,也为绿鳍马面鲀和许氏平鲉养殖的病害防控提供依据。     

美洲红点鲑溃烂病的病原菌研究

对从患病美洲红点鲑(Salvelinus fontinalis)体表患病部位和肾脏分离到菌株进行了鉴定及药物筛选。结果显示:人工感染试验证实为病原菌,该菌革兰氏染色阴性,菌体呈短杆状。综合该菌形态、生理生化分析结果初步鉴定两株菌均为杀鲑气单胞菌(American salvelinus)杀鲑亚种。用引物AP1和AP2对纯化后的细菌进行PCR扩增,结果扩增出长度为550 bp的DNA片段,对扩增片段进行测序,用NCBI BLAST在GenBank中搜寻相似序列,结果与杀鲑气单胞菌各株A层蛋白部分编码基因有99%以上的序列同源性。进一步证明了鉴定结果。该菌对强力霉素、左氟沙星、氟罗沙星、庆大霉素等13种药物均敏感。     

杀鲑气单胞菌一新亚种的生物学特性及系统发育学分析

从石鲽（Kareius bicoloratus L．）细菌性败血感染症的病鱼（濒死及死亡不久）中分离到相应病原菌，进行形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定及代表菌株DNA中G＋Ct001％的测定。同时，选择代表菌株进行16S rRNA基因的分子鉴定，测定16S rRNA基因序列、分析相关细菌相应序列的同源性，构建系统发生树。结果表明，分离鉴定的60株菌为杀鲑气单胞菌的一个新亚种（subsp．nov．），定名为杀鲑气单胞菌杀鲽亚种（Aeromonas salmonicida subsp．flounderacia subsp．nov．）。代表菌株HQ010320-1及HQ010320-5的16S rRNA基因序列与GenBank数据库中的杀鲑气单胞菌的同源性在99％和100％。     

亚东鲑细菌性鳃病病原菌的分离鉴定

2020年9月西藏自治区日喀则市亚东县某养殖基地的亚东鲑出现鳃病症状，主要临床症状为鳃盖打开、鳃丝充血、病鱼离群及呼吸困难。为探究此次疾病的病因，寻找其治疗方法，自患有鳃病症状的亚东鲑鳃组织中分离到1株优势菌YDX-1,采用常规细菌分析、16S rRNA基因序列比对分析和人工感染试验等方法对此株优势菌进行鉴定，同时查明菌株YDX-1的耐药性。试验结果表明，菌株YDX-1为革兰氏阴性菌，在16S rRNA基因序列比对构建的系统发育树中，其与杀鲑气单胞菌聚为一支，相似度达99%以上，结合该菌的形态学特征、生化特性和测序鉴定结果，综合鉴定菌株YDX-1为杀鲑气单胞菌。通过人工感染试验发现，杀鲑气单胞菌YDX-1对亚东鲑的致死率较高，且该菌具有传染性。药敏试验结果显示，杀鲑气单胞菌YDX-1对使用的6类(21种)药物普遍敏感，仅对复方新诺明中介。试验结果对西藏地区亚东鲑细菌性鳃病的防治具有指导意义。     

实时荧光定量PCR扩增特异性vapA基因检测杀鲑气单胞菌

为实现杀鲑气单胞菌早期快速准确定量检测,研究旨在建立杀鲑气单胞菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测方法。根据GenBank中杀鲑气单胞菌毒力阵列蛋白基因(vapA)保守序列设计并合成一对特异性引物,对其特异性、灵敏度、可重复性和应用性进行评价。结果显示,研究设计的引物具有良好的种间特异性,仅对杀鲑气单胞菌及其亚种有阳性扩增,与其他细菌不发生交叉反应。构建的Real-time PCR标准曲线质粒拷贝数与循环阈值呈良好的线性关系,扩增所得标准曲线分别为y=–4.8345x+42.535,相关系数R~2为0.998,最低检测限为34拷贝/μL,较常规PCR的灵敏度高出约1000倍。应用建立的方法检测人工感染的虹鳟病样,15个被检样品呈阳性反应,与细菌常规鉴定方法结果一致。研究表明,所建立的基于实时荧光定量PCR技术的杀鲑气单胞菌检测方法快速、特异、灵敏,可用于临床诊断和疫病监测。     

虹鳟皮肤溃烂病的病原菌研究

从患皮肤溃烂病的虹鳟鱼体中分离到多株细菌 ,其中两株经人工感染证实为病原菌。通过形态、生理、生化特性测定 ,鉴定为豚鼠气单胞菌和杀鲑气单胞菌杀鲑亚种。两株菌生长适温分别为 2 5～ 35℃、10～ 30℃。pH值分别为 6 5～ 8 5、 6 5～ 9 0。对氯霉素、环丙沙星、庆大霉素、复方新诺明等药物均高度敏感     

2株亚东鲑源气单胞菌的鉴定及其致病性与药敏特性分析

亚东鲑(Salmo trutta fario)是西藏地区重要的冷水性经济鱼类之一。为明确亚东鲑暴发性死亡的原因, 对从患病亚东鲑体内分离得到的 2 株优势细菌 B1、A3-2 进行种类鉴定、毒力基因检测、动物回归感染、耐药基因检测和药敏试验。结果显示, 2 株优势细菌鉴定为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) B1 和温和气单胞菌(Aeromonas sobria) A3-2。杀鲑气单胞菌 B1 对亚东鲑具有较强的致病性, 而温和气单胞菌 A3-2 对亚东鲑未表现出致病性。杀鲑气单胞菌 B1 携带有 10 种毒力基因: 外毒素(AerA、Act 和 hly 基因)、胞外酶(gcat、ahyB 和 Lip 基因)、Ⅲ型分泌系统(aexT、aopP 和 ascF-G 基因)、鞭毛(Fla 基因); 温和气单胞菌 A3-2 携带有 5 种毒力基因: 外毒素(Act 和 Alt 基因)、胞外酶(gcat 基因)、Ⅲ型分泌系统(aexT 和 aopP 基因)。杀鲑气单胞菌 B1 对头孢曲松、阿莫西林、氟苯尼考、环丙沙星、四环素、链霉素等 21 种抗菌药物敏感, 仅对万古霉素耐药; 温和气单胞菌 A3-2 对头孢曲松、氟苯尼考、环丙沙星、吡哌酸、四环素、链霉素等 17 种抗菌药物敏感, 对青霉素、阿莫西林、磺胺异噁唑、复方新诺明、万古霉素等 6 种药物耐药。杀鲑气单胞菌 B1 含有 AmpC、gyrA 和 parC 等 3 种耐药基因; 温和气单胞菌 A3-2 含有 AmpC、gyrA、parC 和 tetE 等 4 种耐药基因, 2 种气单胞菌的耐药基因检出结果与耐药表型基本一致。杀鲑气单胞菌 B1 是引起亚东鲑暴发性死亡的重要病原菌, 本研究为亚东鲑养殖过程中杀鲑气单胞菌的感染特征、疫苗研制和疾病防控提供了基础数据。     

大西洋鲑杀鲑气单胞菌的分离鉴定

从皮肤溃烂的大西洋鲑(Salmon salar)肌肉、肝、肾分离到一致病性的菌株(AB080226),经人工感染实验证实其为该病的病原菌,研究了该菌的形态、生理生化特征并对其16SrDNA序列进行了在线Classifer和Blast分析。结果显示:该菌为革兰氏阴性杆菌,葡萄糖氧化发酵阳性,氧化酶检测阳性,0%NaCl生长;能利用甘露醇,不具运动性,能发酵麦芽糖,葡萄糖产酸阳性,精氨酸双水解酶阳性,苯丙氨酸脱氨酶阴性;该菌属于气单胞菌属的细菌,在系统发育树上与杀鲑气单胞菌形成一个簇群,同源性高达99.9%以上。综合形态学、生理生化特征及16SrDNA序列鉴定其为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)。     

斑点叉尾■溃烂症的病原鉴定和致病特性

为探明斑点叉尾[鱼回](Ictalunes punctatus)溃烂症的病因,从4尾患鱼肝脾中分离纯化出4株优势菌株,并进行病原鉴定、毒力基因检测、动物回归感染和药敏试验。4株优势菌经鉴定并命名为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp achromogenes)X-G1,杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.s subsp salmonicida)X-P2、X-P3和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)X-P4。15℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代时间(约14 min)均小于嗜水气单胞菌X-P4(约20 min);25℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3株的世代时间(约20 min)均大于嗜水气单胞菌X-P4株(约16 min)。X-G1株可检到弹性蛋白酶、溶血素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等3种毒力基因;X-P2株仅可检到弹性蛋白酶1种毒力基因;X-P3株可检测到弹性蛋白酶、溶血素、细胞毒性肠毒素、丝氨酸蛋白酶、酯酶、气溶素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等7种毒力基因;X-P4株可检测到鞭毛、弹性蛋白酶、气溶素、细胞毒性肠毒素、热不稳定性肠毒素、丝氨酸蛋白酶和溶血素等7种毒力基因。分离株X-G1、X-P2、X-P3和X-P4在15~17℃水温下腹腔注射攻毒的半数致死浓度(LD 50)依次为0.49×10^4、0.78×10^4、0.53×10^4、3.84×10^4 CFU/g;而在23~26℃水温下测得的LD 50依次为1.48×10^4、1.80×10^4、0.82×10^4、0.68×10^4 CFU/g。分离株混合感染比单一株感染均表现出更强的致死能力。分离菌株对多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考均敏感,但因患病鱼不能摄食药饵而导致治疗失败。     

波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌致腐性及TorA还原酶差异比较

为了研究冷藏海产品中腐败菌希瓦氏菌和气单胞菌的致腐性差异，本实验比较分析了大黄鱼源波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌在28℃和4℃下的生长及三甲胺（TMA）、生物胺和挥发性盐基氮（TVB-N）的生成；通过PCR技术扩增2种腐败菌的氧化三甲胺还原酶基因（torA），利用生物信息学比较TorA蛋白的相似性、理化特性和蛋白空间结构。结果显示，杀鲑气单胞菌在28℃生长较快，而波罗的海希瓦氏菌在4℃生长更快。相对于杀鲑气单胞菌形成较高的尸胺，波罗的海希瓦氏菌产生更多TMA和腐胺，在冷藏鱼汁中积累更高TVB-N。同时在波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌中分别扩增出2 490和1 959 bp的torA基因，2种TorA蛋白与同属菌相似性高于97%，而二者相似性仅为36.90%。波罗的海希瓦氏菌TorA蛋白的分子量和等电点分别为92.3 ku和6.52，甘氨酸含量最高，而杀鲑气单胞菌中TorA蛋白的分子量和等电点分别为90.6 ku和6.74，丙氨酸含量最高，蛋白结构差异明显。且希瓦氏菌中torA 和鸟氨酸脱羧酶（DOC）基因表达量分别为气单胞菌的1.26和19.04倍。可见，波罗的海希瓦氏菌和杀鲑气单胞菌为海产品嗜冷腐败菌，其中希瓦氏菌胺类代谢能力更强，与其TorA特定理化特性和高表达量相关。本研究为揭示海产品微生物的致腐机制提供理论支持。     

杀鲑气单胞菌的实时定量PCR检测方法的建立和应用

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和探针.以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线.通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct＝-3.1574lgX 43.6841(相关系数R2=0.992).实时定量PCR的检测限为6个细菌.建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应.杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值.     

杀鲑气单胞菌对大西洋鲑游泳行为和血细胞数量的影响

为探讨利用鱼类行为及血细胞数量变化预警杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)病害发生的可行性,监测了生产中感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑(Salmo salar L.)的游泳行为,以及杀鲑气单胞菌攻毒后大西洋鲑血细胞数量的变化。实验采用同一养殖基地和同一批次的大西洋鲑,其中现场实验鱼选自生产车间健康的和感染杀鲑气单胞菌的养殖鱼,攻毒实验中处理组实验鱼每尾背肌注射100μL、浓度为3.05×107CFU/m L的菌液,对照组注射等体积灭菌生理盐水。现场实验表明,感染杀鲑气单胞菌的大西洋鲑临界游泳速度较健康鱼低26.7%(P0.05),摆尾频率与游泳速度的线性回归方程的斜率也存在显著差异(P0.05)。攻毒实验表明,从攻毒的第4天开始,处理组大西洋鲑白细胞、淋巴细胞、单核细胞和粒细胞数量较对照组均发生显著变化,其中第6天的变化最为显著,白细胞总数、粒细胞数分别降低了2.8%和43.9%(P0.05),淋巴细胞数及单核细胞数分别升高了63.3%和23.9%(P0.05),且处理组4种血细胞数随时间呈现显著的线性变化(P0.05)。研究结果表明通过监测大西洋鲑游泳行为(临界游泳速度和摆尾频率)以及血细胞相关指标的变化可快速判断其健康状况,为病害的早期预警提供依据。     

云南省养殖虹鳟病原菌的分离鉴定及药物敏感性分析

<正>杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)属于气单胞菌属的一种细菌,在淡水和海水中均有分布。杀鲑气单胞菌能够使虹鳟患上疖疮病,给当地的虹鳟养殖产业带来非常大的冲击。近些年来发现,杀鲑气单胞菌还可以和常见的嗜水气单胞菌等细菌引发鱼类的混合感染。云南省昆明市寻甸某虹鳟养殖场虹鳟幼鱼从2018年6月初开始发病,取患病虹鳟分离病原菌并鉴定,同时对分离的病原菌进行药敏试验,指导养殖户用药,得到了良好的治疗效果。     

杀鲑气单胞菌对鱼类致病性的研究

正气单胞菌属属于弧菌科,广泛分布于自然界中,可从土壤、淡海水、生活污水中分离,常引起人类腹泻,脑膜炎等疾病。基于16sr RNA系统进化树鉴定发现共31种,杀鲑气单胞菌是嗜冷无动力群的代表种。杀鲑气单胞菌属气单胞菌科、气单胞菌属,是一种不能运动,兼性厌氧的革兰氏阴性菌,广泛分布于自然界中。其是气单胞菌属中最早被鉴定的致病菌,疫苗是目前防     

不同来源杀鲑气单胞菌毒力因子的比较基因组学研究

自凡纳滨对虾养殖水体中分离得到1株杀鲑气单胞菌YK-48,为确定YK-48与在鞍山养殖场金鱼体内分离出来的AS.17和烟台大西洋鲑体内分离出来的S68和S121等不同来源的杀鲑气单胞菌的毒力基因特征之间是否存在差异,对YK-48的形态、生理生化特征和药物敏感性进行分析,随后进行全基因组测序,对4株杀鲑气单胞菌进行基因组...     

大黄鱼源气单胞菌的分离鉴定及致腐表型

为鉴别大黄鱼腐败菌气单胞菌的致腐能力,采用生理生化和分子方法(16S r RNA)鉴定冷藏大黄鱼货架期终点不产H2S的菌株。分析菌株在体外培养条件下的生长、胞外酶活性、三甲胺(TMA)和生物胺形成的腐败表型,将菌株接种在灭菌鱼汁中测定其致腐能力。结果显示,分离株AE03和AE04在0~37°C及0~60的盐度下生长良好,在4和25°C条件下AE03菌株的生长速率显著高于AE04菌株。2株细菌不产H2S,能还原氧化三甲胺(TMAO),分解尿素和液化明胶,氧化酶、赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸水解酶等都呈阳性,能利用葡萄糖。结合16S r RNA鉴定发现分离株AE03为杀鲑气单胞菌,AE04为软体动物气单胞菌。在体外培养中,2种气单胞菌均能产生蛋白酶、形成TMA和生物被膜,其中AE03菌株生成各指标的能力高于AE04菌株,同时AE03菌株还具有脂酶活性,产生生物胺,其中尸胺含量较高。气单胞菌AE03在灭菌鱼汁中产生的挥发性盐基氮(TVB-N)显著高于AE04。通过紫色杆菌CV026和根癌农杆菌A136 2种报告菌检测发现,2株气单胞菌是高丝氨酸内酯(AHLs)产生菌,其中AE03菌株产生的AHLs含量显著高于AE04菌株。研究表明,杀鲑气单胞菌AE03为冷藏大黄鱼的强致腐菌,且能分泌高含量的AHLs,研究为从群体感应角度阐明气单胞菌的致腐机理奠定了良好的基础。     

患病细鳞鱼杀鲑气单胞菌的分离与鉴定

从患病细鳞鱼(Brachymystax lenok)的病变组织处分离到1株致病菌,经过分离培养,生化鉴定,16 S rRNA序列分析和人工感染实验确定该病原菌为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp.achromogenes)。采用20种药物进行药敏分析,结果显示:分离菌株对阿米卡星、哌拉西林、恩诺沙星等9种抗生素敏感;对环丙沙星、诺氟沙星等4种抗生素中度敏感;对卡那霉素、青霉素、氨苄西林等7种抗生素耐药。     

迟钝爱德华菌环介导等温扩增检测方法研究

为了建立一套用于实验室及室外现场检测迟钝爱德华菌(Edwardsiella tarda, Et)的环介导等温扩增方法(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)，以迟钝爱德华菌的毒力基因fimA为靶基因设计特异性引物，以基因组DNA为模板，进行环介导恒温扩增，并对其特异性、灵敏性和临床检测进行了试验。结果显示，迟钝爱德华菌阳性样本反应呈现为荧光绿色，阴性样本不变色。该LAMP方法的最适反应温度为63℃；特异性试验表明仅迟钝爱德华菌样本发生反应，而杀鲑气单胞菌、嗜水气单胞菌、温气单胞菌和豚鼠气单胞菌均不发生反应；敏感性试验表明，该LAMP方法可检出浓度为2.16×10^-5mg/L的迟钝爱德华菌的核酸。