云南省养殖虹鳟病原菌的分离鉴定及药物敏感性分析

<正>杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)属于气单胞菌属的一种细菌,在淡水和海水中均有分布。杀鲑气单胞菌能够使虹鳟患上疖疮病,给当地的虹鳟养殖产业带来非常大的冲击。近些年来发现,杀鲑气单胞菌还可以和常见的嗜水气单胞菌等细菌引发鱼类的混合感染。云南省昆明市寻甸某虹鳟养殖场虹鳟幼鱼从2018年6月初开始发病,取患病虹鳟分离病原菌并鉴定,同时对分离的病原菌进行药敏试验,指导养殖户用药,得到了良好的治疗效果。     

杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种PCR检测方法的建立

杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)是一种重要的鱼类致病菌,可以感染多种海淡水鱼类。杀鲑气单胞菌包括5个亚种,目前常用的生理生化特征和16S rDNA序列分析方法很难实现亚种的快速精确区分。为实现杀鲑气单胞菌亚种的快速鉴定和检测,针对我国常见的杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A. salmonicida subsp. salmonicida)和杀日本鲑亚种(A. salmonicida subsp. masoucida),本研究开发了其特异性的PCR检测方法。根据Gene Bank已公布的杀鲑气单胞菌基因组信息,选择杀鲑亚种phoB基因和杀日本鲑亚种LOC111476736基因作为目标基因,根据其序列设计特异性引物,进一步对PCR反应的退火温度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和酶浓度5个方面进行了优化,并测试了该方法的特异性、敏感性和应用效果。结果显示,2对引物分别可以扩增出杀鲑气单胞菌杀鲑亚种522 bp的phoB特异性基因片段和杀日本鲑亚种515 bp的LOC111476736特异性基因片段。杀鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为1.5、2、1.5和0.5 µL。杀日本鲑亚种特异性引物最适退火温度为64 ℃,10 µmol/L引物、2 mmol/L dNTPs、25 mmol/L MgSO4和1 U/µL KOD酶的最适添加量分别为0.75、1、1.5和0.5 µL。以鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)、杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)、杀鲑气单胞菌其他亚种等14种其他水产病原菌或常见环境菌为模板进行PCR检测,均无特异性条带。该方法对杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的检测灵敏度为12.8 CFU/反应(菌体)或17.6 fg/反应(DNA),对杀鲑气单胞菌杀日本鲑亚种的检测灵敏度为23.8 CFU/反应(菌体)或27.2 fg/反应(DNA)。利用杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种分别对大菱鲆(Scophthalmus maximus)进行人工感染实验,感染后取病鱼组织进行PCR检测,结果显示,本方法可以从感染后的大菱鲆中分别检测到相应病原。综上所述,本研究建立了杀鲑气单胞菌杀鲑亚种和杀日本鲑亚种的特异性PCR检     

斑点叉尾■溃烂症的病原鉴定和致病特性

为探明斑点叉尾[鱼回](Ictalunes punctatus)溃烂症的病因,从4尾患鱼肝脾中分离纯化出4株优势菌株,并进行病原鉴定、毒力基因检测、动物回归感染和药敏试验。4株优势菌经鉴定并命名为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp achromogenes)X-G1,杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.s subsp salmonicida)X-P2、X-P3和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)X-P4。15℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代时间(约14 min)均小于嗜水气单胞菌X-P4(约20 min);25℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3株的世代时间(约20 min)均大于嗜水气单胞菌X-P4株(约16 min)。X-G1株可检到弹性蛋白酶、溶血素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等3种毒力基因;X-P2株仅可检到弹性蛋白酶1种毒力基因;X-P3株可检测到弹性蛋白酶、溶血素、细胞毒性肠毒素、丝氨酸蛋白酶、酯酶、气溶素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等7种毒力基因;X-P4株可检测到鞭毛、弹性蛋白酶、气溶素、细胞毒性肠毒素、热不稳定性肠毒素、丝氨酸蛋白酶和溶血素等7种毒力基因。分离株X-G1、X-P2、X-P3和X-P4在15~17℃水温下腹腔注射攻毒的半数致死浓度(LD 50)依次为0.49×10^4、0.78×10^4、0.53×10^4、3.84×10^4 CFU/g;而在23~26℃水温下测得的LD 50依次为1.48×10^4、1.80×10^4、0.82×10^4、0.68×10^4 CFU/g。分离株混合感染比单一株感染均表现出更强的致死能力。分离菌株对多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考均敏感,但因患病鱼不能摄食药饵而导致治疗失败。     

乌江网箱养殖中患病花鲈的细菌分离与分子鉴定

利用微生物学常用的细菌分离、纯化方法从患病花鲈(Lateolabrax japonicus)分离出9个菌株,编号分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ.对9个菌株的16SrRNA基因序列进行PCR扩增,均得到约600bp的片段.将扩增结果进行测序,结果输入到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中,用BLAST工具对序列进行同源性比对分析.结果表明,Ⅰ为杀鲑气单胞菌,同源性98%;Ⅱ为不动菌属,同源性97%;Ⅲ为肺炎克雷伯氏杆菌,同源性98%;Ⅳ为嗜水气单胞菌,同源性99%;Ⅴ为希瓦氏菌,同源性99%;Ⅵ为腐生葡萄球菌,同源性99%;Ⅶ为枯草芽孢杆菌,同源性99%;Ⅷ为沙雷氏菌属,同源性95%;Ⅸ为杀鲑气单胞菌,同源性97%.     

乌江网箱养殖中患病花鲈的细菌分离与分子鉴定

利用微生物学常用的细菌分离、纯化方法从患病花鲈(Lateolabrax japonicus)分离出9个菌株,编号分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ。对9个菌株的16SrRNA基因序列进行PCR扩增,均得到约600bp的片段。将扩增结果进行测序,结果输入到NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中,用BLAST工具对序列进行同源性比对分析。结果表明,Ⅰ为杀鲑气单胞菌,同源性98%;Ⅱ为不动菌属,同源性97%;Ⅲ为肺炎克雷伯氏杆菌,同源性98%;Ⅳ为嗜水气单胞菌,同源性99%;Ⅴ为希瓦氏菌,同源性99%;Ⅵ为腐生葡萄球菌,同源性99%;Ⅶ为枯草芽孢杆菌,同源性99%;Ⅷ为沙雷氏菌属,同源性95%;Ⅸ为杀鲑气单胞菌,同源性97%。     

气单胞菌对水生动物的危害及噬菌体防控研究进展

<正>气单胞菌属(Aeromonas)是一类革兰氏阴性兼性厌氧杆菌,它们广泛分布于自然界,不仅存在于淡水河流、沿海等地,还存在于自来水中,是一种人-鱼-兽共患的条件致病菌。目前共有1个科名,1个属名以及27个种名或亚种名。根据生长发育所需温度范围及是否拥有运动能力分为2大类:(1)嗜温有动力气单胞菌,如嗜水气单胞菌(A. hydrophila)、维氏气单胞菌(A. veronii)和温和气单胞菌(A. so-     

杀鲑气单胞菌灭活疫苗的制备及免疫效果评价

正杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida, As)属于气单胞菌属,形态为短杆菌,革兰氏染色阴性,其在淡水与海水环境中广泛存在,之前研究认为其不能在37℃生长,是嗜冷无动力型气单胞菌,但近期的一些山羊和人类的病例表明其可能为人-畜-鱼共患病原菌。目前已发现多个亚种,即典型亚种1种(杀鲑亚种),不典型亚种4种(无色亚种、杀日本鲑亚种、产果胶亚种及史氏亚种)。该菌最早由德国     

杀鲑气单胞菌对鱼类致病性的研究

正气单胞菌属属于弧菌科,广泛分布于自然界中,可从土壤、淡海水、生活污水中分离,常引起人类腹泻,脑膜炎等疾病。基于16sr RNA系统进化树鉴定发现共31种,杀鲑气单胞菌是嗜冷无动力群的代表种。杀鲑气单胞菌属气单胞菌科、气单胞菌属,是一种不能运动,兼性厌氧的革兰氏阴性菌,广泛分布于自然界中。其是气单胞菌属中最早被鉴定的致病菌,疫苗是目前防     

2株亚东鲑源气单胞菌的鉴定及其致病性与药敏特性分析

亚东鲑(Salmo trutta fario)是西藏地区重要的冷水性经济鱼类之一。为明确亚东鲑暴发性死亡的原因, 对从患病亚东鲑体内分离得到的 2 株优势细菌 B1、A3-2 进行种类鉴定、毒力基因检测、动物回归感染、耐药基因检测和药敏试验。结果显示, 2 株优势细菌鉴定为杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida) B1 和温和气单胞菌(Aeromonas sobria) A3-2。杀鲑气单胞菌 B1 对亚东鲑具有较强的致病性, 而温和气单胞菌 A3-2 对亚东鲑未表现出致病性。杀鲑气单胞菌 B1 携带有 10 种毒力基因: 外毒素(AerA、Act 和 hly 基因)、胞外酶(gcat、ahyB 和 Lip 基因)、Ⅲ型分泌系统(aexT、aopP 和 ascF-G 基因)、鞭毛(Fla 基因); 温和气单胞菌 A3-2 携带有 5 种毒力基因: 外毒素(Act 和 Alt 基因)、胞外酶(gcat 基因)、Ⅲ型分泌系统(aexT 和 aopP 基因)。杀鲑气单胞菌 B1 对头孢曲松、阿莫西林、氟苯尼考、环丙沙星、四环素、链霉素等 21 种抗菌药物敏感, 仅对万古霉素耐药; 温和气单胞菌 A3-2 对头孢曲松、氟苯尼考、环丙沙星、吡哌酸、四环素、链霉素等 17 种抗菌药物敏感, 对青霉素、阿莫西林、磺胺异噁唑、复方新诺明、万古霉素等 6 种药物耐药。杀鲑气单胞菌 B1 含有 AmpC、gyrA 和 parC 等 3 种耐药基因; 温和气单胞菌 A3-2 含有 AmpC、gyrA、parC 和 tetE 等 4 种耐药基因, 2 种气单胞菌的耐药基因检出结果与耐药表型基本一致。杀鲑气单胞菌 B1 是引起亚东鲑暴发性死亡的重要病原菌, 本研究为亚东鲑养殖过程中杀鲑气单胞菌的感染特征、疫苗研制和疾病防控提供了基础数据。     

杀鲑气单胞菌的实时定量PCR检测方法的建立和应用

选取杀鲑气单胞菌A层A蛋白(VapA)保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和探针.以ATCC标准株10倍系列稀释,通过血球计数板计数后进行实时定量PCR,制作标准曲线.通过SDS软件获得细菌数量(X)与Ct值的关系为:Ct＝-3.1574lgX 43.6841(相关系数R2=0.992).实时定量PCR的检测限为6个细菌.建立的方法对杀鲑气单胞菌典型株和非典型株具有较好的特异性,与其他细菌没有交叉反应.杀鲑气单胞菌实时定量PCR方法的建立,对于快速口岸检疫、临床诊断和疫病监测具有重要的应用价值.