辽东湾斑海豹线粒体苏氨酸和脯氨酸及控制区部分序列分析

通过PCR产物测序法,测定了46只辽东湾斑海豹线粒体DNA的一段包括部分苏氨酸和脯氨酸tRNA基因及部分控制区的717 bp序列,得到17个序列单元型。与港海豹相比,所有辽东湾斑海豹17个单元型在控制区序列中都有2处缺失,是区分港海豹和斑海豹的种间分子标记。与日本海和鄂霍次克海区斑海豹m tDNA相同片段进行比较研究,发现辽东湾斑海豹的线粒体控制区DNA的单元型比例相对较少,遗传多样性水平相对较低。辽东湾斑海豹m tDNA的16296位点即苏氨酸tRNA基因序列的最后一位有1个C碱基的插入,16607位点存在T/C转换,这两个变异位点是鉴别辽东湾斑海豹与日本及鄂霍次克海区斑海豹的重要分子标记。初步表明,辽东湾斑海豹与日本海、鄂霍次克海斑海豹是属于不同的地理种群,或者辽东湾斑海豹同这两个海区斑海豹未发生基因交流或者雌性个体的相互交流。     

斑海豹线粒体基因组序列分析及比较研究

本研究采用LA-PCR扩增和引物步移相结合的方法对我国辽东湾斑海豹的线粒体基因组全序列进行了测定,并完成了基因组成和系统发生学分析。辽东湾斑海豹线粒体基因组长为16 754bp,其基因构成与其他海洋哺乳动物基本一致,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和1个控制区。在其37个基因中,ND6、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(UCN)、tRNAGlu、tRNAPro位于L链上,其余均位于H链上。对我国辽东湾、韩国和美国阿拉斯加斑海豹线粒体基因组进行了比较分析,结果显示,三者线粒体基因组长度略有不同,差异主要体现在以重复片段形式存在的控制区序列中。值得注意的是,在编码区中,3个目标群体的线粒体ND5基因核苷酸差异最为显著,共检测到了18个突变位点,造成4处氨基酸序列变异。斑海豹线粒体基因组蛋白编码基因的变异分析及海豹科系统进化分析结果显示,我国辽东湾和韩国斑海豹的序列同源性显著高于美国阿拉斯加斑海豹,说明辽东湾和韩国斑海豹很可能来自同一个种群。     

基于12SrRNA和ND3基因序列分析巨[鱼丕]遗传多样性及系统进化

为从分子水平研究巨[鱼丕](Bagarius yarrelli Sykes)的遗传多样性和系统进化关系,本实验对采集于怒江、澜沧江、元江3河流5种群中的60个个体进行12S rRNA和ND3基因序列的PCR扩增,同时与红河河口群体12个个体的12S rRNA和ND3基因序列进行比对分析,采用Mega5.02软件对碱基组成、Kimura-2 parameter遗传距离、可变位点等进行分析。应用DnaSP软件进行遗传多样性相关参数的计算。结果显示:12S rRNA和ND3基因序列长度分别为954 bp和346 bp(349 bp),分别定义了51个单倍型和42个单倍型,12S rRNA和ND3序列中的碱基平均含量分别为:T为20.8%、C为25.7%、A为32.1%、G为21.4%和T为29.5%、C为28.2%、A为28.1%、G为14.1%,表现出明显的A+T偏倚性;6个群体的群体内和群体间的遗传距离分别为0.003~0.284(12S rRNA),0.009~0.059(ND3)和0.004~1.062(12S rRNA),0.008~0.143(ND3);12S rRNA基因的51个单倍型和ND3基因的42个单倍型序列总的单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)及核苷酸平均差异数(K)分别为0.972和0.937、0.035和0.079、31.414和27.176,均显示出丰富的遗传多样性。结合从GenBank中下载的12S rRNA和ND3基因同源序列的[鱼丕]科9属10种鱼类进行系统发育树的构建,结果表明巨[鱼丕]独自汇聚成一大单系群,怒江潞江坝群体、怒江三江口群体及澜沧江临沧群体间关系较近,澜沧江景洪群体可单独构成一个单系种群,红河河口群体、红河曼耗群体与其它巨[鱼丕]构成一单系种群后再同澜沧江景洪群体汇聚成一支。     

圆斑星鲽线粒体基因组全序列结构及其进化

利用圆斑星鲽(Verasper variegatus Temminck et Schlegel)和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出6对扩增引物,通过PCR扩增产物直接测序和引物行走(Primer walking)法测定圆斑星鲽线粒体基因组全序列,并对其进行结构与进化分析。圆斑星鲽线粒体基因组序列长17273 bp,其基因序列及构成都与其他硬骨鱼基本相同,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和2个非编码区(控制区和WANCY区)。在22个tRNA基因中,tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(第2个)、tRNAGlu和tRNAPro的编码基因位于L链上,其余则位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除了COⅠ基因的起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子。蛋白质编码基因包括具有完整TAA终止密码子的ND1,COⅠ,ATP8,ND4L,ND5,而其他蛋白编码基因则具有不完全终止密码子。在L链上,ND6是仅有的一个蛋白质编码基因。圆斑星蝶的控制区包含1个终止相关序列区(ETAS)、6个中央保守序列区(CSB-A、B、C、D、E、F)和3个保守序列区(CSB-1、2、3)以及长串联重复区(Tandemly repeat sequence)。用NJ法和MP法对5个目22种鱼mtDNA的13个蛋白质编码基因的氨基酸序列进行系统分析,结果显示,圆斑星蝶与石鲽关系最近,鲽形目的鲆、鲽类与鲈形目的科(Carangidae)、鲷科(Sparidae)鱼类亲缘关系较近,而同属于鲽形目的塞内加尔鳎(Solea senegalensis)没有和任何目聚在一起,成为一个独立的分支。圆斑星蝶的基因组全序列序列已提交到GenBank,登录号为DQ403797,控制区单元型序列的GenBank登录号为DQ834444~7。     

剑尾鱼线粒体DNA D-环及侧翼tRNA↑（thr）和tRNA↑（pro）序列与结构分析

采用PCR方法从剑尾鱼(Xiphophorus helleri)线粒体基因组中扩增到1段约15．5kb的片段，测定了其中627个碱基的序列。经测序分析表明，该扩增片段包括486bp的D—环的部分序列以及D—环5端的tRNA^trh和tRNA^pro基因的完整序列。其中486bpD环序列包含3段保守的终止相关序列TAS、与TAS互补的序列以及类似其他鱼类线粒体CSB序列。tRNA^trh由线粒体DNA的H链编码，长度为72bp。tRNA^pro由线粒体DNA的L链编码，长度为69bp。并绘制了这2种tRNA的二级结构图。本研究所测定的基因序列已登录国际GenBank数据库，序号为AF489918。     

2种虾虎鱼细胞色素b基因全序列克隆与分析

测定了矛尾刺虾虎鱼（Acanthogobius hasta）和红狼牙虾虎鱼（Odontamblyopus rubicundus）的线粒体细胞色素b（Cytb）基因全序列。2种虾虎鱼Cytb基因序列全长均为1141bp,通过序列比对,检测到266个变异位点,序列中碱基转换频率高于颠换,碱基替换主要发生在密码子第3位。结合GenBank中的虾虎鱼科其他物种的细胞色素b基因全序列,利用Kimura-双参数模型分析遗传距离表明,10种虾虎鱼科鱼类的遗传差异在0.118~0.330之间,大头新虾虎鱼（Neogobius kessleri）与同属的裸喉新虾虎鱼（N.gymnotrachelus）遗传距离最小,为0.118;大头新虾虎鱼和矛尾刺虾虎鱼遗传距离最大,为0.330。以Cytb基因全序列构建的NJ进化树分析表明,10种虾虎鱼分为3个主要类群,红狼牙虾虎鱼和矛尾刺虾虎鱼聚为1支,且与其余8种虾虎鱼类遗传距离较远。     

硬骨鱼类线粒体基因系统发育信息效率分析

采用PCR产物直接测序法获得圆斑星鲽（Verasper variegatus）和条斑星鲽（V．moseri）线粒体基因组的全部基因序列，并从GenBank中下载已知分类地位相关鱼类的线粒体基因的核苷酸序列和蛋白质氨基酸序列，用蛙、鸡、牛做外群，采用NJ和MP法，重建鱼类的系统发育树。通过计算各个基因在重建系统发育树时的准确率，估算该基因所含有的系统发育信息。结果表明，从氨基酸序列和核苷酸序列以及在目、科、属综合分析，这些基因的系统发育信息大致分为好（16S rRNA、ND2、ND4、12S rRNA、ND6、ND5）、中（Cytb、COII、COIII、ND1、COI）和差（ND3、ND4L、ATP6、ATP8）3个组。在目阶元，当用核苷酸序列分析时，12SrRNA、16SrRNA、COII、ND4、ND5和ND6最好，COI、COIII、Cytb、ND1和ND2为中等，而ND3、ATPase6、ATPase8和ND4L最差。当用氨基酸序列分析时，ND4和ND5最好，ND1、ND2、Cytb、ND6、COI、COII和ND4L为中等，ND3、ATPase6、COIII和ATPase8最差。在科阶元，当用核苷酸序列时，12SrRNA、16SrRNA、ND2和ND6系统发育信息最好；用氨基酸序列时，Cytb和ND2最好。在属阶元，所有基因的核苷酸序列都具有很好的系统发育信息，而COII、ND4L、ND1和ND3的氨基酸序列系统发育信息最差。本研究结果有助于进一步利用线粒体基因研究分析鱼类系统进化关系。     

引入养殖俄罗斯红参线粒体全序列结构与分析

本研究通过高通量测序技术对引入养殖的俄罗斯红参(Apostichopus japonicus)线粒体全基因组进行随机测序并分析，结果显示，俄罗斯红参线粒体基因组全长为16111 bp，共含有37个基因，包括22个tRNA、2个rRNA (l-rRNA和s-rRNA)和13个蛋白编码基因。全序列共存在24处基因间隔和5处基因重叠区。蛋白编码基因与全序列的碱基使用均表现出A、T偏倚。13个蛋白编码基因的密码子完整，除ND1以GTG为起始密码子外，其他均以ATN为起始密码子；终止密码子都是完整密码子，除ND2与ND4的终止密码子分别为TTG与TAG外，其他终止密码子以TAA为主；氨基酸频率最高为丝氨酸Ser(S)，其次为亮氨酸Leu(L)。22个tRNA长度范围为66~72 bp，2个基因存在重复，且21个基因能预测其三叶草结构。l-rRNA与s-rRNA的长度与位置不同，对碱基的使用相似。蛋白编码基因的基因排列与海参纲(Holothuroidea)、海胆纲(Echinoidea)排列顺序相同，并与海星纲(Asteroidea)及蛇尾纲(Ophiuroidea)共享基因模块。BLAST分析表明，俄罗斯红参与仿刺参(Apostichopus japonicus)同源性最高。不同海参遗传距离分析发现，俄罗斯红参与3个海域仿刺参最为接近。基于最大似然法分别根据氨基酸与核苷酸序列构建的系统发生树显示，基于核苷酸序列的建树结果更符合亲缘关系较近的海参种类间的分析。引入养殖俄罗斯红参线粒体全序列结构与分析可为后续俄罗斯红参的遗传研究及种质应用提供支持。     

大黄鱼mtDNA ND5和Cytb基因的克隆与序列分析

2004年4月，将采自浙江省象山港海区网箱养殖的大黄鱼样本，提取总DNA，通过设计特异性引物对大黄鱼线粒体DNA（mtDNA）的辅酶5（ND5）和细胞色素b（Cytb）基因进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳检测、纯化后直接测序。得到ND5的序列1839 bp和Cytb基因序列382 bp。应用primer premier5和MEGA3软件包所作的系统发育分析表明：依据大黄鱼ND5序列所作的进化树总体支持传统的分类地位，大黄鱼更接近塘鳢鱼科。而基于Cytb基因所作的分析表明，黑鳃梅童鱼是大黄鱼在石首鱼科中是遗传距离最小的。     

鳀科鱼类线粒体全基因组序列结构特征及系统发育信息分析

为了解鳀科鱼类的线粒体全基因组序列结构特征及系统发育信息,以期为进化遗传学研究和分子标记的选取提供参考依据,对已知的10种鳀科鱼类的线粒体全基因组进行分析。结果显示:1)鳀科线粒体基因组全序列长度在16 660 bp到17 069 bp之间,基因组的结构和基因排列顺序与其它硬骨鱼类一致。2)比对后获得一致序列长度为15 704 bp(不含D-loop),其中变异位点5 570个,占所有位点数的35.5%。在编码基因中,序列变异程度和Kimura双参数遗传距离最大的是ND6基因(分别是47.5%和0.276),最小的是tRNA拼接序列(分别为18.7%和0.072)。3)基于Ka-Ks的Z检验和Tajima’s D检验表明蛋白质编码基因主要受到净化选择(即负选择,purifying selection)的作用;其中12个蛋白质编码基因(ND6除外)有强烈的净化选择(Ka/Ks<1),而ND6基因受正选择(positive selection)影响较大(Ka/Ks>1)。4)ND4、ND2和Cytb是进行鳀科鱼类系统发育分析的较为理想的分子标记。     

日本绒螯蟹ND2基因全序列测定与分析

动物线粒体DNA（mtDNA）具有比核DNA的进化速率快等特点，而被广泛地应用于生物的起源、演化和种群遗传学研究。完整的线粒体基因组包括37个基因：13个编码疏水性蛋白质亚基基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因。各基因排列紧密，不含内含子，且有些基因区域出现重叠。     

暗纹东方鲀线粒体细胞色素b及其侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

以暗纹东方纯（Takifugu fasciatus）肝脏的线粒体DNA为模板，按照红鳍东方豚（Takifugu rubripes）线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增，克隆并测定线粒体细胞色素b（Cyt b）及其侧翼tRNA基因的全序列，结果显示，克隆的暗纹东方纯Cyt b基因（1137bp）及其5’端上游的tRNA^Glu基因和3’端下游的tRNA^Thr基因序列共1327 bp。用DNA分析软件对暗纹东方纯与GenBank中10个目13种鱼类的Cyt b序列进行比较分析，显示暗纹东方纯与这些鱼类的Cyt b基因具有较高的同源性，与同属红鳍东方纯的同源性最高，为96．1％；与同目不同科的矛尾翻车纯（Masturus lanceolatus）和翻车纯（Mola mola）的同源性分别为74．1％和74．8％。tRNA^Glu基因由69个碱基组成，tRNA^Thr基因由72个碱基组成，与红鳍东方纯相应tRNA的碱基组成完全相同。推定的这两种tRNA的二级结构都具有典型的三叶草型结构，各臂的碱基配对率高，稳定性好。根据暗纹东方纯与其他13种鱼的Cyt b基因序列同源性所建立的进化树比较，结果与传统的分类地位基本吻合。     

海带配子体碳酸酐酶(CA)基因的克隆及其特征分析

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该EST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆得到一条长2 804 bp的cDNA序列(GenBank登录号:JF827608),其中5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长166 bp,3′-UTR长1 765 bp,且具有明显的polyA尾巴,ORF长873 bp。它编码一个由290个氨基酸组成的前体蛋白,预测在20 Gly-21 Val处有一个典型的信号肽酶切位点,酶切后的成熟蛋白由270个氨基酸组成,具有3个锌结合的His残基所构成的催化活性中心,其分子量为30.44 ku,等电点为5.06。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体CA基因都没有差异,且无内含子。Southern-blotting杂交结果显示,海带配子体CA基因为单拷贝基因。蛋白同源性搜索,发现该基因的编码蛋白与掌状海带的α-CA蛋白有87%的同源性。基于36个CA蛋白的氨基酸序列所构建的邻接(Neighbor-Joining)系统进化树显示,自海带配子体中所克隆的CA基因位于α-CA蛋白所组成的一支,推测它可能为α-型,因而不在线粒体中起作用。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)结果表明,在增加CO₂浓度的条件下,CA基因在海带雌、雄配子体中的日表达量均较未增加的条件下有所增加,由此推测该CA基因不属于胞外CA;基于海带配子体CA蛋白仅具有一个信号肽,可以推测它是定位于叶绿体外膜上,以泵的方式为叶绿体光合作用提供充足的CO₂。     

利用线粒体DNA序列进行斑海豹鉴定的研究

通过对待鉴定的血液样品中线粒体控制区扩增和序列测定,并与基因库中序列比对分析,成功地对斑海豹进行了种类鉴定。本研究所用方法在野生珍稀动物的种类鉴定中有很好的应用价值。     

渤海虎平岛周围海域的斑海豹种群动态初步调查

在2005年4月和2006年3—5月,分别对大连虎平岛周围海域的斑海豹栖息地及斑海豹资源进行了调查,斑海豹的数量调查采用领地计数法;调查发现2005年春季在此处的斑海豹日最多为54头,2006年春季日最多为67头。在风浪较小,晴好天气,斑海豹在该海域出现的几率多;通过斑海豹数量的脉冲式变化推测每一批斑海豹在本调查海域不做长时间的停留。     

青鱼线粒体ND4L的SNP筛选及在两种体色群体中的分布

为了分析青鱼线粒体蛋白编码基因与体色性状的相关性,从而筛选出与体色相关的SNP分子标记。本研究选取了5尾广东佛山灰色青鱼和5尾扬州邗江正常体色黑色青鱼群体的皮肤组织,通过qPCR检测13个线粒体蛋白质编码基因在两种颜色群体皮肤组织中的表达量,并进行显著性分析。对表达差异最明显的蛋白编码基因CDS区序列设计引物,并选取78尾佛山灰色青鱼样本和92尾邗江黑色青鱼样本进行测序,根据测序峰图筛选出SNP位点。结果发现：13个线粒体蛋白质编码基因中COII基因表达量最高,ND5基因表达量最低,ND4L基因在两种体色青鱼中的表达差异最为明显。在对170尾青鱼样本的线粒体ND4L基因上共检测到了2个SNP位点,位于编码区,且都为同义突变。卡方检验表明,252bp(C/T)处的SNP位点在两种体色青鱼群体中的等位基因频率和基因型频率都有极显著的差异(p＜0.01),243bp(A/G)处的SNP位点在两种体色青鱼群体中的等位基因频率和基因型频率差异不显著(p＞0.05),因此线粒体ND4L基因中的SNP位点C252T与青鱼体色显著相关。本研究中成功找到一个与青鱼体色相关的SNP分子标记,可以在青鱼的养殖和育种中提供理论分子层面的指导和帮助。     

盘丽鱼属鱼类线粒体DNA细胞色素b基因序列和亲缘关系分析

通过测定盘丽鱼属鱼类绿盘丽鱼(S.aequifasciataaequifasciata)、褐盘丽鱼(S.aequifasciataaxelrodi)和盘丽鱼(S.discus)线粒体DNA细胞色素b(mtDNAcytb)基因全序列,结合对GenBank中蓝盘丽鱼(S.aequifasciataharaldi)该序列的比较分析,共检测到23个变异位点,占全序列的2.02%,其中22个为转换,1个为颠换,碱基替换多发生在密码子的第三位点。盘丽鱼与其它3种盘丽鱼属鱼类的遗传距离在0.005～0.01之间,而绿盘丽鱼、褐盘丽鱼和蓝盘丽鱼彼此间的遗传距离在0.012～0.014之间,由此推测盘丽鱼似还没有分化到种的水平;本文还在绿盘丽鱼、褐盘丽鱼、蓝盘丽鱼和盘丽鱼4种盘丽鱼属鱼类的cytb基因比较分析的基础上构建了系统进化树。     

基于线粒体COII和ND4基因序列的塔里木裂腹鱼群体遗传多样性分析

为探究塔里木裂腹鱼群体的遗传多样性和遗传分化现状,选用车尔臣河、克孜勒河和阿克苏河3个不同地理种群的塔里木裂腹鱼共计126尾样本,进行线粒体DNA COII和ND4基因序列的对比分析,探讨了2种标记对塔里木裂腹鱼遗传多样性分析结果的差异和关系。结果显示,塔里木裂腹鱼线粒体DNA COII和ND4基因序列的A+T含量均高于G+C含量,碱基组成具有偏倚性。基于线粒体DNA COII和ND4基因序列分析,126个样本中分别确定了6个和23个单倍型,其中线粒体DNA COII基因序列中3个群体存在共享单倍型现象,线粒体DNA ND4基因序列中未发现3个群体间存在共享单倍型。2种标记下群体的单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.738±0.019/0.904±0.014和0.02129±0.00298/0.04876±0.00149,呈现出高单倍型多态性和高核苷酸多态性的特征。2种标记的分子方差分析（AMOVA）均表明,在所有群体中遗传变异主要来源于群体间,且车尔臣河群体的塔里木裂腹鱼与其他2个群体的遗传分化均达到显著水平（P<0.05）。贝叶斯法（BI）构建的BI树与单倍型网络图结构一致,塔里木裂腹鱼形成了2个分支。COII和ND4基因序列的岐点分布图均呈现双峰型,表明塔里木裂腹鱼现在的分布是先前分化种群发生二次交流的结果。种群结构分析结果亦表明塔里木裂腹鱼已分化出2个明显的地理种群,故建议将车尔臣河群体作为塔里木裂腹鱼的亚种。