暗纹东方纯线粒体COⅢ克隆及序列分析

克隆并测定了暗纹东方纯线粒体基因组（mtDNA）含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ（COⅢ）及其下游70bp的tRNA^cly序列。COⅢ基因编码框包含786个核苷酸，编码262个氨基酸的蛋白质。鱼类COⅢ的序列组成对A＋T核苷酸的偏倚程度比较低。通过暗纹东方奎屯与GenBank中8个目12种鱼类的COⅢ序列同源性比较，显示暗纹东方纯与这些鱼类的COⅢ基因具有较高的同源性。根据暗纹东方纯与纯目其他5种鱼的COⅢ基因序列所建立的进化树。与传统的分类地位相吻合。推定的tRNA的二级结构具有典型的三叶草型结构。根据COⅢ序列构建的分子进化树分析，认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时，应综合考虑物种遗传变异的特点。     

暗纹东方鲀线粒体DNA控制区结构和系统发育分析

以暗纹东方(Takifugu fasciatus)肝脏线粒体DNA为模板,参照GenBank中红鳍东方(Takifugu rubripes)线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,获得了暗纹东方线粒体DNA控制区基因(818 bp)及5′端上游的tR-NAPro基因(71 bp)的全序列。控制区碱基组成为T32.2%,C 19.1%,A35.6%,G13.2%。对照其他已报道的鱼类控制区结构,对暗纹东方控制区的结构进行了分析,识别了其终止序列区、中央保守区和保守序列区,找到了终止相关的序列TAS以及保守序列(CSB1,CSB2,CSB3)。CSB1、CSB2序列相对保守,TAS与其回文基序可形成稳定的茎环结构,成为H-链复制延伸时的终止识别位点。同时运用DNA分析软件对暗纹东方与GenBank中其他10多种鱼类的mtDNA控制区序列进行比对,并选取东方属的7种鱼类mtDNA控制区序列构建分子系统树。结果显示控制区基因较适于科鱼类中同属不同种的系统发育分析。     

暗纹东方鲀抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体基因的克隆、生物信息学及表达分析

为探究暗纹东方鲀(Takifugu obscures)抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体(anti-Müllerian hormone receptorⅡ,Amhr2)基因的序列和结构信息,初步研究amhr2基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,实验通过设计简并引物扩增及RACE技术,克隆出暗纹东方鲀amhr2完整的CDS区,分析其相应的生物信息学特征及其在不同组织和不同发育期的mRNA表达水平。结果表明:amhr2序列cDNA全长为1 868 bp(NCBI登录号:MH218814),编码513个氨基酸,与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)同源性最高,达99%。氨基酸多重序列比对结果显示,Amhr2氨基酸序列中的近C-末端区域序列较为保守;通过构建系统进化树发现,暗纹东方鲀Amhr2与红鳍东方鲀亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,暗纹东方鲀amhr2仅在性腺中表达,且卵巢中的表达量明显高于精巢;并且在性腺早期发育过程中,amhr2在精巢和卵巢中的表达量均呈现出先降低再迅速升高的表达趋势。研究结果表明,amhr2在暗纹东方鲀中的表达具有组织特异性,且在性别分化和性别维持等过程中发挥重要的作用。     

暗纹东方鲀线粒体COIII克隆及序列分析

克隆并测定了暗纹东方鲀线粒体基因组(m tDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(CO III)及其下游70 bp的tRNAG ly序列。CO III基因编码框包含786个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质。鱼类CO III的序列组成对A T核苷酸的偏倚程度比较低。通过暗纹东方鲀与GenBank中8个目12种鱼类的CO III序列同源性比较,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的CO III基因具有较高的同源性。根据暗纹东方鲀与鲀目其他5种鱼的CO III基因序列所建立的进化树,与传统的分类地位相吻合。推定的tR-NA的二级结构具有典型的三叶草型结构。根据CO III序列构建的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应综合考虑物种遗传变异的特点。     

暗纹东方鲀Hepcidin基因的扩增及序列分析

利用聚合酶链式反应,首次从暗纹东方纯基因组DNA中扩增Hepcidin基因的部分序列,序列分析表明,不同鱼类之间的Hepcidin基因DNA序列之间的遗传距离为0.33～1.08,所获得的Hepcidin序列,为进一步研究暗纹东方纯中Hepcidin基因的作用机制提供了基础。     

剑尾鱼线粒体DNA D-环及侧翼tRNA↑（thr）和tRNA↑（pro）序列与结构分析

采用PCR方法从剑尾鱼(Xiphophorus helleri)线粒体基因组中扩增到1段约15．5kb的片段，测定了其中627个碱基的序列。经测序分析表明，该扩增片段包括486bp的D—环的部分序列以及D—环5端的tRNA^trh和tRNA^pro基因的完整序列。其中486bpD环序列包含3段保守的终止相关序列TAS、与TAS互补的序列以及类似其他鱼类线粒体CSB序列。tRNA^trh由线粒体DNA的H链编码，长度为72bp。tRNA^pro由线粒体DNA的L链编码，长度为69bp。并绘制了这2种tRNA的二级结构图。本研究所测定的基因序列已登录国际GenBank数据库，序号为AF489918。     

暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。     

暗纹东方鲀mtDNA的分离纯化及其细胞素b基因的分子克隆

利用改进的差速离心法和碱裂解法制备并分离纯化了暗纹东方纯mtDNA，测得分子大小为19．4Kb。用线粒体特异染色法跟踪和监测线粒体提取，结果表明，25000-35000g能获得90％以上的高得率。利用制备纯化的mtDNA，已首次克隆了暗纹东方纯细胞色素b基因(cytb)。     

暗纹东方纯非01霍乱弧菌的鉴定及毒力基因检测

在对养殖暗纹东方纯病害调查中，从呈典型症状病鱼腹腔和肠道粘液中分离到2株（J-1和H-3）菌株，经生化特性和血清型鉴定为非01群霍乱弧菌（Non-01 Vibrio choleroe）。注射、创伤和浸泡3种方式进行人工感染试验表现出较强的致病性，出现症状与自然发病鱼相同。为进一步确认分离菌株的分类地位，使用P1、P2引物，以非01群霍乱弧菌N92001菌株和01群霍乱弧菌N16961菌株为对照，对分离菌株进行阳t扩增，得到451bp的DNA片段。根据现有霍乱弧菌肠毒素ctxA基因序列设计引物P3，P4，以N16961菌株为阳性对照，阳t扩增结果均得到大小为400bp的DNA片段。在对H-3菌株的扩增片段进行纯化、克隆和测序，得到407bp序列，该菌株与N16961菌株中肠毒素ctxA基因序列的完全一致，证实该片段源于ctxA基因。进一步说明从暗纹东方纯体内分离到的J-1和H-3菌株具有霍乱肠毒素ctxA，有一定的致病力。     

南海金线鱼属Nemipterus鱼类COⅠ和Cyt b基因片段的比较分析

基于线粒体细胞色素b(Cyt b)和细胞色素氧化酶Ⅰ基因(COⅠ)片段,运用PCR直接测序法,对采自南海的金线鱼(Nemipterus virgatus)、日本金线鱼(N.japonicus)、深水金线鱼(N.bathybius)、红棘金线鱼(N.nemurus)和苏门答腊金线鱼(N.mesoprion)及GenBank中的六齿金线鱼(N.hexodon)、裴氏金线鱼(N.peronii)及红金线鱼(N.furcosus)的序列进行了分析,并比较分析了它们间的序列差异。Cyt b基因序列片段(425 bp)和COⅠ基因序列片段(507 bp)的分析均显示日本金线鱼和红棘金线鱼之间序列差异和遗传距离均最小,COⅠ基因片段中为分别0.25%和0.003,Cyt b基因片段中为0和0,两者亲缘关系非常近;几种金线鱼之间尚未达到属的水平,裴氏金线鱼仍属于金线鱼属;两目的片段的NJ系统树均显示,日本金线鱼和红棘金线鱼混杂在一起聚为一支,而日本金线鱼和苏门答腊金线鱼属于不同的发育分支;红棘金线鱼和日本金线鱼是最新分化种,金线鱼则是最早分化种;几种金线鱼类的分化时间大约在中更新世时期。比较属间的系统发育关系,旨在为金线鱼属鱼类分类提供依据,进而对鱼类资源的评估与保护措施提供基础参考。     

2种虾虎鱼细胞色素b基因全序列克隆与分析

测定了矛尾刺虾虎鱼（Acanthogobius hasta）和红狼牙虾虎鱼（Odontamblyopus rubicundus）的线粒体细胞色素b（Cytb）基因全序列。2种虾虎鱼Cytb基因序列全长均为1141bp,通过序列比对,检测到266个变异位点,序列中碱基转换频率高于颠换,碱基替换主要发生在密码子第3位。结合GenBank中的虾虎鱼科其他物种的细胞色素b基因全序列,利用Kimura-双参数模型分析遗传距离表明,10种虾虎鱼科鱼类的遗传差异在0.118~0.330之间,大头新虾虎鱼（Neogobius kessleri）与同属的裸喉新虾虎鱼（N.gymnotrachelus）遗传距离最小,为0.118;大头新虾虎鱼和矛尾刺虾虎鱼遗传距离最大,为0.330。以Cytb基因全序列构建的NJ进化树分析表明,10种虾虎鱼分为3个主要类群,红狼牙虾虎鱼和矛尾刺虾虎鱼聚为1支,且与其余8种虾虎鱼类遗传距离较远。     

小鼠生物法和酶联免疫法(ELISA)定量监测沿海5省养殖河豚鱼中的河豚毒素(TTX)

为进一步扩大国内养殖河豚鱼消费市场提供依据,应用小鼠生物法监测了我国辽宁、河北、山东,江苏和福建4种养殖河豚鱼(红鳍东方鲀,菊黄东方鲀,双斑东方鲀和暗纹东方鲀4种组织(皮、肉、肝脏和性腺)中河豚毒素(TTX)含量及周年变化,并用酶联免疫法(ELISA)同步检测了山东红鳍东方鲀的皮,肉和肝脏各组及个别卵巢样品。结果4种养殖河豚鱼的皮,肉和肝脏每组平均含毒量均属无毒(小鼠生物法检测结果小于0.5μg/g,ELISA检测结果小于0.8μg/g)。卵巢发现一强毒例,精巢则全部无毒。通过监测,发现养殖河豚鱼组织器官的毒力呈现一定的周年变化。ELISA法与小鼠生物试验测得的结果相符合。养殖河豚鱼皮,肉和精巢认为可以考虑科学安全的利用,肝脏须谨慎对待,由于养殖河豚鱼上市规格较小,卵巢一般无食用意义,加工过程应注意不要污染可食部分。     

基于CO I和Cytb DNA条形码在鲌属鱼类物种鉴定中的应用

为探究线粒体CO I和Cyt b基因作为DNA条形码在鲌属鱼类鉴定中的可行性,分别扩增达氏鲌(Culter dabryi)、海南鲌(C.recurviceps)、尖头鲌(C.oxycephalus)、蒙古鲌(C.mongolicus)、拟尖头鲌(C.oxycephaloides)和翘嘴鲌(C.alburnus)六种鲌属鱼类线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(Cytochrome C oxidase subunit I,CO I)和细胞色素b(Cytochrome b,Cyt b)的基因片段,并对六种鲌属鱼类同源序列的碱基组成、种内与种间遗传距离以及系统进化分别进行分析。结果表明:长度为645 bp的CO I基因片段中,A、T、G、C4种碱基平均含量分别为25.65%、28.18%、18.33%和27.84%;长度为970 bp的Cyt b序列片段中,A、T、G、C碱基平均含量分别为27.97%、27.93%、14.53%和29.57%。基于CO I基因序列的种间平均遗传距离为3.54%,种内平均遗传距离为0.17%,种间遗传距离为种内遗传距离的20.82倍;基于Cyt b基因序列的种间平均遗传距离为5.92%,种内平均遗传距离为0.18%,种间遗传距离为种内遗传距离的32.89倍。基于CO I基因的系统进化关系显示除尖头鲌与拟尖头鲌外,其余4种鲌均形成独立分支,而基于Cyt b基因的系统发育关系显示六种鲌属均能独立形成分支,鲌属六种鱼能够进行有效区分,将CO I和Cyt b作为DNA条形码进行鲌属鱼类的物种鉴定是可行的,联合使用可以获得更好的鉴定效果。     

辽东湾斑海豹线粒体ND4、tRNAArg、ND4L和ND3基因序列分析

用PCR产物直接测序法,测定渤海辽东湾斑海豹15个个体线粒体的一段从ND3到ND4基因长度为625 bp的DNA序列。其中的1~118 bp是ND3基因的后部分,120~188 bp是tRNAArg基因完整序列,189~485 bp是ND4L基因完整序列,479~625 bp是ND4基因的前部分。在ND4L和ND4之间,有7个碱基是重叠编码的。15个序列间,只有ND4L基因中有一个位点发生C/T碱基转换。与GenBank中的斑海豹序列比较,tRNAArg基因序列完全一致,而ND4L基因序列则有两处发生转换。利用从GenBank中下载的22个海豹科动物的ND4L基因序列的系统发生分析表明,海豹科动物分为南半球和北半球两大类群,斑海豹与港海豹为北半球种类,亲缘关系最近。     

鲤鱼基因组同源框Hoxa3a序列同源性分析与分子进化研究

本文利用生物信息学软件分析了鲤（Cyprinus carpio）基因组中同源框基因Hoxa3a与多种鱼类及其它生物的同源性,构建了分子进化树。结果表明：鲤与斑马鱼（Danio rerio）的序列同源性最高为95%,与大西洋鲑（Salmo salar）等四种鱼类的同源性次之为84%,与米氏叶吻银鲛（Callorhinch...     

鲤鱼基因组同源框Hoxa3a序列同源性分析与分子进化研究

本文利用生物信息学软件分析了鲤（Cyprinus carpio）基因组中同源框基因Hoxa3a与多种鱼类及其它生物的同源性,构建了分子进化树。结果表明：鲤与斑马鱼（Danio rerio）的序列同源性最高为95%,与大西洋鲑（Salmo salar）等四种鱼类的同源性次之为84%,与米氏叶吻银鲛（Callorhinchus milii）和鳐（Leucoraja erinacea）的同源性最低为74.5%,与三种鸟类的同源性为75%左右。这结果也说明,Hox同源框基因序列在进化上高度保守。在序列比较的同时发现了2个鲤的SNP位点,T101C和A213G。上述研究结果,对于保护生物多样性（尤其是遗传多样性）的研究,揭示生物进化历程及机理具有十分重要的意义。     

Cyt b和12S rRNA基因条形码在灯笼鱼科鱼类物种鉴定中的应用

灯笼鱼科鱼类种类繁多, 且同属鱼类形态学相近, 因此利用分子标记对灯笼鱼进行准确的物种鉴定具有重要价值。为探讨线粒体细胞色素 b 基因(Cyt b)和 12S rRNA 基因在灯笼鱼科物种鉴定中的适用性, 对西北太平洋采集的 56 尾灯笼鱼进行扩增, 并进行序列对比与系统发育分析。研究表明, 采集的样本包括 6 种灯笼鱼, 分别为瓦氏角灯鱼(Ceratoscopelus warmingii)、长体标灯鱼(Symbolophorus californiensis)、粗鳞灯笼鱼(Myctophum asperum)、 细泰勒灯鱼(Tarletonbeania crenularis)、日本背灯鱼(Notoscopelus japonicus)以及某背灯鱼属鱼类(Notoscopelus sp.)。 核苷酸多态性分析显示, 基于 Cyt b 基因的种内与种间遗传距离比基于 12S rRNA 基因的更大。比较灯笼鱼科 2 种基因序列的结构特征, 发现 Cyt b 基因的种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的 25 倍, 12S rRNA 基因的种间平均遗传距离是种内平均遗传距离的 26 倍, 均符合作为 DNA 条形码的基本要求。系统进化分析显示, 每种灯笼鱼均能形成独立分支, 2 个基因均能对 6 种灯笼鱼类进行鉴别; 但在 Cyt b 基因构建的进化树中, 每种鱼类能更好与数据库中已有的序列进行聚类。综上所述, Cyt b 和 12S rRNA 作为 DNA 条形码可以有效地对灯笼鱼科鱼类物种进行鉴定, 且 Cyt b 基因在系统进化关系的研究上具有更高的适用性。