暗纹东方鲀线粒体COIII克隆及序列分析

克隆并测定了暗纹东方鲀线粒体基因组(m tDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ(CO III)及其下游70 bp的tRNAG ly序列。CO III基因编码框包含786个核苷酸,编码262个氨基酸的蛋白质。鱼类CO III的序列组成对A T核苷酸的偏倚程度比较低。通过暗纹东方鲀与GenBank中8个目12种鱼类的CO III序列同源性比较,显示暗纹东方鲀与这些鱼类的CO III基因具有较高的同源性。根据暗纹东方鲀与鲀目其他5种鱼的CO III基因序列所建立的进化树,与传统的分类地位相吻合。推定的tR-NA的二级结构具有典型的三叶草型结构。根据CO III序列构建的分子进化树分析,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时,应综合考虑物种遗传变异的特点。     

暗纹东方鲀线粒体细胞色素b及其侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

以暗纹东方纯（Takifugu fasciatus）肝脏的线粒体DNA为模板，按照红鳍东方豚（Takifugu rubripes）线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增，克隆并测定线粒体细胞色素b（Cyt b）及其侧翼tRNA基因的全序列，结果显示，克隆的暗纹东方纯Cyt b基因（1137bp）及其5’端上游的tRNA^Glu基因和3’端下游的tRNA^Thr基因序列共1327 bp。用DNA分析软件对暗纹东方纯与GenBank中10个目13种鱼类的Cyt b序列进行比较分析，显示暗纹东方纯与这些鱼类的Cyt b基因具有较高的同源性，与同属红鳍东方纯的同源性最高，为96．1％；与同目不同科的矛尾翻车纯（Masturus lanceolatus）和翻车纯（Mola mola）的同源性分别为74．1％和74．8％。tRNA^Glu基因由69个碱基组成，tRNA^Thr基因由72个碱基组成，与红鳍东方纯相应tRNA的碱基组成完全相同。推定的这两种tRNA的二级结构都具有典型的三叶草型结构，各臂的碱基配对率高，稳定性好。根据暗纹东方纯与其他13种鱼的Cyt b基因序列同源性所建立的进化树比较，结果与传统的分类地位基本吻合。     

暗纹东方鲀线粒体DNA控制区结构和系统发育分析

以暗纹东方(Takifugu fasciatus)肝脏线粒体DNA为模板,参照GenBank中红鳍东方(Takifugu rubripes)线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,获得了暗纹东方线粒体DNA控制区基因(818 bp)及5′端上游的tR-NAPro基因(71 bp)的全序列。控制区碱基组成为T32.2%,C 19.1%,A35.6%,G13.2%。对照其他已报道的鱼类控制区结构,对暗纹东方控制区的结构进行了分析,识别了其终止序列区、中央保守区和保守序列区,找到了终止相关的序列TAS以及保守序列(CSB1,CSB2,CSB3)。CSB1、CSB2序列相对保守,TAS与其回文基序可形成稳定的茎环结构,成为H-链复制延伸时的终止识别位点。同时运用DNA分析软件对暗纹东方与GenBank中其他10多种鱼类的mtDNA控制区序列进行比对,并选取东方属的7种鱼类mtDNA控制区序列构建分子系统树。结果显示控制区基因较适于科鱼类中同属不同种的系统发育分析。     

鲮β-肌动蛋白基因的分子克隆及其作为分子内标的可靠性分析

β-actin是actin家族的一员，在维持细胞结构、细胞内运动和细胞分裂等细胞生理活动方面发挥着重要的作用。克隆的鲮（Cirrhinus molitorella）β-aetin基因的cDNA全长1 804bp，开放阅读框长1 128bp，编码375个氨基酸，5’和3’末端非翻译区域（UTR）分别为94bp和582bp。RT-PCR结果表明，β-actin在未经LPS刺激的和经LPS刺激的鲮心脏、肾脏、肌肉、肝脏、脾脏、肠、脑和皮肤等8种组织中广谱表达，表达水平没有明显差异，可以作为基因表达调控研究的分子内标。鲮与其他鱼类β-actin基因编码区核苷酸序列同源性在85.9％～99.6％。分子系统进化树分析表明，可将鱼类分成鲤形目，鲈形目，鲑形目和合鳃目4大支，与传统分类一致，β-actin基因核苷酸序列是研究分子进化的一个很好的分子标记。     

实验红鲫线粒体DNA条形码特征分析及应用

为探索建立具有实验红鲫品系特异性的线粒体DNA条形码,对鲫属品种进行鉴定。本研究以实验红鲫和鲫属其他鱼类(洞庭湖鲫、日本白鲫、大眼鲫、兰氏鲫、金鱼、湘军金鱼和湘军花鲫)为测试群体,利用Sanger测序对所有个体的线粒体COⅠ、COⅢ、Cytb这3个基因和D-loop进行测序,同时构建3个基因的拼接序列,并分析它们的序列特征和10种鲫属鱼类分子系统进化的聚类特征。结果显示,COⅠ、COⅢ、Cytb这3个基因的拼接序列和COⅠ基因的进化树聚类能明显地发现10种不同的鲫属鱼类聚成不同的小支,而COⅢ基因和D-loop序列聚类不能同时区分10种鲫属鱼类。研究表明,通过COⅠ基因以及3个基因的拼接序列均能有效地鉴别实验红鲫与鲫属其他鱼类,故该类序列能作为实验红鲫的有效分子标记,同时COⅠ、COⅢ、Cytb和D-loop序列构建的进化树均可以反映10种不同鲫属鱼类之间的进化关系。     

暗纹东方鲀Hepcidin基因的扩增及序列分析

利用聚合酶链式反应,首次从暗纹东方纯基因组DNA中扩增Hepcidin基因的部分序列,序列分析表明,不同鱼类之间的Hepcidin基因DNA序列之间的遗传距离为0.33～1.08,所获得的Hepcidin序列,为进一步研究暗纹东方纯中Hepcidin基因的作用机制提供了基础。     

滁州鲫(Carassius auratus)线粒体全基因组序列分析及系统进化

为探讨天然三倍体滁州鲫的系统进化地位,采用直接测序法获得滁州鲫线粒体基因组。其序列全长为16581 bp,碱基组成为31.6%A、26.2%T、16.1%G和26.1%C,包括13个蛋白质基因、22个t RNA基因、2个r RNA基因和1个非编码区,各基因的位置及组成与已公布的鲤科鱼类一致。除t RNA-Ser(AGY)外,其他21个t RNA的二级结构均具有典型的三叶草结构;13个蛋白编码基因中,除COⅠ起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子;COⅡ、ND3、ND4和Cytb基因的终止密码子为不完整的T,其他9个基因均具有完整的终止密码子TAA或TAG。序列分析表明,滁州鲫与其他鲫属鱼类(方正银鲫A系和D系、鲫、淇河鲫、萍乡肉红鲫、黑鲫、日本白鲫和日本银鲫)在线粒体基因组上均具有较高的序列同源性(94%)。以鲤(Cyprinus carpio haematopterus)为外类群,基于线粒体13个蛋白质基因的核苷酸与氨基酸序列构建上述鲫属鱼类的系统进化树,结果显示,滁州鲫与方正银鲫亲缘关系最近,与黑鲫最远。综合以上研究结果,认为滁州鲫应为银鲫亚种的一个地方种群。     

暗纹东方鲀mtDNA的分离纯化及其细胞素b基因的分子克隆

利用改进的差速离心法和碱裂解法制备并分离纯化了暗纹东方纯mtDNA，测得分子大小为19．4Kb。用线粒体特异染色法跟踪和监测线粒体提取，结果表明，25000-35000g能获得90％以上的高得率。利用制备纯化的mtDNA，已首次克隆了暗纹东方纯细胞色素b基因(cytb)。     

滁州鲫(Carassius auratus)线粒体全基因组序列分析及系统进化

为探讨天然三倍体滁州鲫的系统进化地位,采用直接测序法获得滁州鲫线粒体基因组。其序列全长为16581 bp,碱基组成为31.6% A、26.2% T、16.1% G和26.1% C,包括13个蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个非编码区,各基因的位置及组成与已公布的鲤科鱼类一致。除tRNA-Ser (AGY)外,其他21个tRNA的二级结构均具有典型的三叶草结构;13个蛋白编码基因中,除COⅠ起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子;COⅡ、ND3、ND4和Cytb基因的终止密码子为不完整的T,其他9个基因均具有完整的终止密码子TAA或TAG。序列分析表明,滁州鲫与其他鲫属鱼类(方正银鲫A系和D系、鲫、淇河鲫、萍乡肉红鲫、黑鲫、日本白鲫和日本银鲫)在线粒体基因组上均具有较高的序列同源性(>94%)。以鲤(Cyprinus carpio haematopterus)为外类群,基于线粒体13个蛋白质基因的核苷酸与氨基酸序列构建上述鲫属鱼类的系统进化树,结果显示,滁州鲫与方正银鲫亲缘关系最近,与黑鲫最远。综合以上研究结果,认为滁州鲫应为银鲫亚种的一个地方种群。     

暗纹东方鲀抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体基因的克隆、生物信息学及表达分析

为探究暗纹东方鲀(Takifugu obscures)抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体(anti-Müllerian hormone receptorⅡ,Amhr2)基因的序列和结构信息,初步研究amhr2基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,实验通过设计简并引物扩增及RACE技术,克隆出暗纹东方鲀amhr2完整的CDS区,分析其相应的生物信息学特征及其在不同组织和不同发育期的mRNA表达水平。结果表明:amhr2序列cDNA全长为1 868 bp(NCBI登录号:MH218814),编码513个氨基酸,与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)同源性最高,达99%。氨基酸多重序列比对结果显示,Amhr2氨基酸序列中的近C-末端区域序列较为保守;通过构建系统进化树发现,暗纹东方鲀Amhr2与红鳍东方鲀亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,暗纹东方鲀amhr2仅在性腺中表达,且卵巢中的表达量明显高于精巢;并且在性腺早期发育过程中,amhr2在精巢和卵巢中的表达量均呈现出先降低再迅速升高的表达趋势。研究结果表明,amhr2在暗纹东方鲀中的表达具有组织特异性,且在性别分化和性别维持等过程中发挥重要的作用。     

暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。     

拟腹吸鳅属鱼类线粒体基因组特征与系统发育分析

为了解拟腹吸鳅属(Pseudogastromyzon)鱼类的系统发育特征,对已获得的11种该属鱼类进行线粒体基因组的测序与分析,结果表明,其线粒体基因组的长度在16 560～16 574 bp之间,且基因组成和排列模式与大多数脊椎动物线粒体基因组基本一致;各线粒体基因组序列中A+T的含量均超过50%,并存在反G偏倚现象。通过对11种拟腹吸鳅属鱼类线粒体基因组13个蛋白质编码基因与控制区序列的比较发现：在COⅠ基因中有一段6 bp的碱基插入和缺失;D-loop基因的进化速率介于蛋白质编码基因之间,ND4、ND5、Cyt b和D-loop等基因适合作为本属鱼类种间系统发育研究的分子标记。基于COⅠ基因序列的11种拟腹吸鳅属鱼类种间遗传距离以及基于线粒体基因组序列构建的11个种系统发育树研究表明,九龙江拟腹吸鳅(P.fasciatus jiulongjiangensis)与梅花山拟腹吸鳅(P.meihuashanensis)应为拟腹吸鳅(P.fasciatus fasciatus)的同物异名。9个有效种可以分为两大类：颏部吸附器为品字型的3种属于品唇鳅亚属(Labigastromyzon),...     

草鱼线粒体细胞色素b基因的克隆与序列分析

用DNAExtractionKit提取草鱼(Ctenopharyngodonidella)肝脏的总DNA,合成特异引物,进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳检测、纯化后克隆到pGEM Teasyvectorsystem的T载体上,筛选转化子,提取质粒,酶切鉴定。重组质粒序列测定的结果显示克隆了草鱼线粒体细胞色素b(cytb)基因1140个碱基及两侧部分序列共1254bp。用DNA分析软件VectorNTI6.0比较草鱼与GenBank中18种鱼类cytb的序列,显示草鱼与它们的cytb基因具有较高的同源性;根据草鱼与这18种鱼的cytb基因序列同源性所建立的进化树,与传统的分类地位基本吻合。     

GenBank中裂腹鱼类COI基因序列的分子标记有效性

裂腹鱼类(Schizothoracids)分布有复杂的水系格局, 在形态学鉴定时有些鱼种容易混淆。线粒体细胞色素 C 氧化酶亚基 I(CO I)基因是动物学研究中常用的物种分子条形码, 分析 GenBank 数据库中裂腹鱼类 CO I 作为分子标记的有效性, 可以加深理解和认识前人用这些数据所做的研究工作, 也为今后更合理地使用这些数据提供参考依据。本研究对 GenBank 数据库中裂腹鱼类 CO I 基因的分子标记有效性进行分析评估, 通过同源性比对、参考序列间遗传分歧的估算和系统发育关系重建等方法, 判断 GenBank 数据库中裂腹鱼类 CO I 基因序列的同源性、序列所属鱼种鉴定的准确性, 以及序列信息对系统发育关系的解析力。通过对下载的 1431 条序列进行多重比对发现, 有 3 条序列与其他序列存在显著差异, 同源性存疑, 数据信息经 BLAST 相似性搜索和核查确认为, 以 CO I 基因的互补链形式提交的序列, 比对前应先进行互补链转换。全部序列的比对结果显示, GenBank 数据库中裂腹鱼类的 CO I 基因片段序列均为该基因近 5?端至中部的序列。权衡序列的数量和长度后, 舍弃较短的 35 条序列, 保留长度为 527 bp 的 1396 条序列进行分析, 结果共定义了 228 个单倍型, 在有多条序列的鱼种中, 普遍存在种内共享单倍型, 还有 41 个单倍型为种间共享。裂腹鱼类 CO I 单倍型的平均 p-距离为 9.5%, 与鱼类的属级水平相当, 原始、 特化和高度特化类群各自的平均 p-距离值更低, 体现近期辐射演化的特征, 可能与它们随着青藏高原演化成种的历史较短有关。GenBank 中一些裂腹鱼类 CO I 基因序列的鱼种鉴定存在错误, 在使用时应先与参考序列对比, 或从系统发育分析的角度做出判断。总体来看, CO I 基因序列能够有力解析裂腹鱼类各演化等级裂腹鱼类之间的亲缘关系, 可用于分类和演化的初步分析。结合形态学、生态学、线粒体和核基因的多样性及系统发育关系等进行综合分析, 将有助于更准确地界定裂腹鱼种类, 同时也为深入探讨杂交和成种过程等问题奠定基础。     

暗纹东方纯温棚养殖试验

暗纹东方纯（Takifugu obscurus）隶属鲀形目、鲍科、东方鲍属，俗名称河鲍、气泡鱼、河豚鱼。暗纹东方纯为海产的洄游性鱼类，春末夏初为生殖时期，成群溯河至长江中下游或鄱阳湖水系产卵。幼鱼在江河或通江的湖泊中肥育，至翌年春返至海中，     

圆斑星鲽线粒体基因组全序列结构及其进化

利用圆斑星鲽(Verasper variegatus Temminck et Schlegel)和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出6对扩增引物,通过PCR扩增产物直接测序和引物行走(Primer walking)法测定圆斑星鲽线粒体基因组全序列,并对其进行结构与进化分析。圆斑星鲽线粒体基因组序列长17273 bp,其基因序列及构成都与其他硬骨鱼基本相同,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和2个非编码区(控制区和WANCY区)。在22个tRNA基因中,tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(第2个)、tRNAGlu和tRNAPro的编码基因位于L链上,其余则位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除了COⅠ基因的起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子。蛋白质编码基因包括具有完整TAA终止密码子的ND1,COⅠ,ATP8,ND4L,ND5,而其他蛋白编码基因则具有不完全终止密码子。在L链上,ND6是仅有的一个蛋白质编码基因。圆斑星蝶的控制区包含1个终止相关序列区(ETAS)、6个中央保守序列区(CSB-A、B、C、D、E、F)和3个保守序列区(CSB-1、2、3)以及长串联重复区(Tandemly repeat sequence)。用NJ法和MP法对5个目22种鱼mtDNA的13个蛋白质编码基因的氨基酸序列进行系统分析,结果显示,圆斑星蝶与石鲽关系最近,鲽形目的鲆、鲽类与鲈形目的科(Carangidae)、鲷科(Sparidae)鱼类亲缘关系较近,而同属于鲽形目的塞内加尔鳎(Solea senegalensis)没有和任何目聚在一起,成为一个独立的分支。圆斑星蝶的基因组全序列序列已提交到GenBank,登录号为DQ403797,控制区单元型序列的GenBank登录号为DQ834444~7。     

红鲤4群体间主要组织相容性复合体的差异

应用鱼类主要组织相容性复合体(MIC)基因来探讨鱼类种群间遗传结构,寻找分子遗传标记。根据已报道的鲤鱼MICI类基因序列,设计了一对特异性引物,从兴国红鲤、荷包红鲤、玻璃红鲤及瓯江彩鲤基因组DNA中扩增了编码MICI类分子α2链的基因片段,并进行克隆、测序。结果表明,(1)编码MHC I类分子α2链的基因多态性较为丰富,234bp长度中有106个变异位点,多态位点百分率达45．3％;荷包红鲤的基因序列与其它3群体红鲤有显著差异;(2)由编码MICI类分子α2链的基因和氨基酸序列构建的系统进化树一致,兴国红鲤与团江彩鲤关系较近,属于同一进化支,玻璃红鲤和荷包红鲤分别属于另外两个不同的进化支,荷包红鲤是较为特化的群体;(3)多态性丰富的编码MICI类分子α2链的基因,适宜作为鲤鱼不同群体的分子遗传标记。     

两种黄盖鲽线粒体DNA部分片段比较分析

比较分析了钝吻黄盖鲽（Pleuronectes yokohama）和尖吻黄盖鲽（P. herzensteini）线粒体基因组COI、Cyt b基因以及D-Loop片段总长度为1373 bp的核苷酸序列,两种间共检测到107处核苷酸替换，蛋白质编码基因上的核苷酸替代主要是第三密码子位点上的同义替换。核苷酸组成分析结果表明：三个目的片段的鸟嘌呤（G）含量普遍较低，在两个蛋白编码基因第三密码子位点上表现得尤为明显。两种黄盖鲽在线粒体基因组不同片段上存在明显的遗传分化，核苷酸替代速率最快的是D-Loop，COI和Cyt b核苷酸替代速率基本一致。建议在进行黄盖鲽属鱼类分子系统发育研究时，应该针对不同研究目的选择合适的分子标记。基于Cyt b基因片段序列的分析结果表明：钝吻黄盖鲽和尖吻黄盖鲽两种的分岐时间约为200万年，两种间的分化事件发生在更新世（Pleistocene）。     

基于COⅠ及RAG2基因序列的我国科鱼类分子系统研究

采集了我国近海分布的、细鳞、尖吻、叉牙、四线列牙等5种科鱼类共25尾样品,利用PCR扩增技术对其线粒体基因COⅠ及核基因RAG2序列片段进行扩增测序,得到5种科鱼类COⅠ基因序列651bp及RAG2基因序列729bp,两基因片段均不存在插入与缺失。利用Mega 5.0计算科鱼类两基因碱基组成情况,种内与种间的遗传距离,并基于最大似然法构建了系统进化树。结果显示,系统进化树上,三线最先分化出来,位于进化树的底部,其次是细鳞,也单独形成一支,独立于其他科鱼类聚类分支之外,同属于属的3个种类并没有形成单系,与格纹岛、尖吻聚为一支;叉牙与四线列牙聚成一支,形成姐妹种,显示两者之间有较近的亲缘关系。     

斑点叉尾鲖BPI1基因的原核表达及生物信息学分析

为探究斑点叉尾鲖BPI1抗菌肽基因编码蛋白的结构特征,实验提取斑点叉尾鲖肾脏RNA,根据BPI1基因序列设计引物,利用PCR方法克隆BPI1基因并构建至原核表达载体p TWIN1中。构建成功的重组质粒p TWIN1-BPI1经原核表达,SDS-PAGE检测显示得到约为50 ku的融合蛋白,与预期结果相一致。通过生物信息学软件对BPI1基因编码的蛋白序列进行分析,结果显示,克隆所得斑点叉尾鲖BPI1基因编码一条由223个氨基酸残基组成的多肽,等电点为9.07,属于BPI超家族,是稳定的亲水蛋白。亚细胞定位BPI1分布在线粒体(43.5%)、细胞质(30.4%)和细胞核(26.1%)中,表明BPI1可能在嘌呤和嘧啶合成以及能量代谢等过程中发挥信号转导、促进生长等重要作用。二级结构以α-螺旋和β-折叠为主,三级结构呈棒状。同源性及进化树分析表明,实验所得BPI1基因序列与斑点叉尾鲖BPI抗菌肽基因的同源性最高,序列一致性为99.1%,进化树聚为一支,表明BPI1基因编码的蛋白序列在相同物种中的突变率较低,保守性较高,相同物种中其生物活性与个体间的差异关系较小。