海参纲线粒体基因组特征分析及分子标记探讨

通过常规PCR和长PCR扩增获得仿刺参的线粒体DNA,进而采用鸟枪法测序、序列拼接获得仿刺参的线粒体基因组全序列.结合瓜参、拟刺参、海参及另外一个仿刺参的线粒体基因组,初步揭示了海参纲线粒体基因组的基本特征.檐手目的3个物种(仿刺参、拟刺参和海参)线粒体基因组的基因排列完全一致,且与海胆纲物种线粒体基因组的基因排列相同.隶属于枝手目的瓜参线粒体基因组的基因排列与其他海参线粒体基因组相比,发生6个tRNA基因的易位.海参纲线粒体基因组主编码基因的变异特征分析揭示了在海参类线粒体基因组所有的主编码基因中,coxl基因多态位点的比例最低,仅为29.46%;nad2、nad4、nad5三个基因的多态位点不仅比例较高,而且基因的长度较长,从而拥有最多的多态位点.因此,nad2、nad4和nad5基因可以coxl基因辅助的分子标记.     

长臂虾科线粒体基因组特征分析及分子标记探讨

通过常规PCR和长PCR扩增获得脊尾白虾的线粒体DNA,采用鸟枪法测序、序列组装获得脊尾白虾的线粒体基因组全序列.结合罗氏沼虾和沼虾的线粒体基因组,分析了长臂虾线粒体基因组的基本特征、基因排列、蛋白质编码基因和基因变异程度等.与泛甲壳动物线粒体基因组的原始排列相比,2个沼虾的线粒体基因组的基因排列完全一致;而脊尾白虾线粒体基因组却存在2个tRNA基因的易位.长臂虾科线粒体基因组主编码基因的变异特征分析揭示了coxl基因多态位点的比例最低,仅为25.5%;而3个基因(nad2、nad4和nad5)不仅多态位点的比例较高,而且基因的长度较长,从而拥有最丰富的多态位点.因此,nad2、nad4和nad5基因可以作为分子标记,用于分析长臂虾不同群体之间的遗传多样性,为长臂虾生物多样性的保护及合理利用其生物资源提供更多保障.     

对虾科线粒体基因组特征及基因差异位点分析

通过长PCR扩增获得凡纳滨对虾和中国明对虾的线粒体DNA,进而采用步移测序、序列拼接获得2个对虾类线粒体基因组的全序列.结合斑节对虾、日本囊对虾、细角滨对虾和加州美对虾的线粒体基因组,初步揭示了对虾科线粒体基因组的基本特征.6个对虾类线粒体基因组的基因排列与泛甲壳动物线粒体基因组的原始排列完全一致.对虾类线粒体基因组所有的主编码基因中,变异程度最高的是nad2和nad6基因.因此,nad2和nad6基因可以作为coxl基因辅助的分子标记,为对虾类生物多样性的保护及对虾类生物资源合理、高效利用等诸多方面提供参考.     

中华鳖与砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因序列的比较分析和分子鉴定标记

对中华鳖和砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因进行了引物设计、PCR扩增、序列测定和PCR-RbLP分析。研究结果表明：中华鳖、砂鳖线粒体DNA 12S rRNA基因片段的碱基序列长度相同，均为562bp，其A、T、C、G含量相似，分别为209个(37．2％)、121个(21．5％)、145个(25．8％)、87个(15．5％)和207个(36．8％)、120个(21．4％)、145个(25．8％)、90个(16％)。两序列间共有13处碱基不同，序列差异率为2．3l％，中华鳖与砂鳖各自个体间的平均核苷酸序列差异率分别为0．53％和0．36％，种间差异显著；用内切酶MspⅠ酶切两种鳖的12S rRNA基因片段，在砂鳖中可得到大小为519bp和43bp两个片段，而中华鳖无此酶切位点，这可作为准确鉴别中华鳖和砂鳖的分子鉴定标记。从两种鳖线粒体DNA 12S rRNA基因片段碱基的显著差异和MspⅠ酶切位点的变化，可以进一步证明砂鳖是不同于中华鳖的鳖属一新种。     

磷虾类线粒体基因组的特征和基因排列比较

利用长PCR扩增获得太平洋磷虾的线粒体DNA,结合鸟枪法和引物步移法测定太平洋磷虾的线粒体基因组。结果表明,太平洋磷虾线粒体基因组全长为16898bp,在最大非编码区中存在一个串联重复区域(4.7×154bp)。在15个主编码基因中,变异位点数最多的是nad5基因(319～321个),其次为nad4基因(284～285个)和cox1基因(232～233个)。因此,nad5基因和nad4基因可以作为候选的分子标记,用于分析磷虾类不同的物种和群体之间的生物多样性。对比泛甲壳动物的原始排列,太平洋磷虾和南极磷虾线粒体基因组共享3个转运RNA基因(tRNALeu(CUN)、tRNALeu(UUR)和tRNATrp)的易位。与太平洋磷虾线粒体基因组相比,南极磷虾线粒体基因组存在1个转运RNA基因(tRNAAsn)的重复和1个转运RNA基因(tRNAIle)的易位。太平洋磷虾和南极磷虾之间的基因排列并不完全一致,说明在磷虾类内部线粒体基因组的基因排列顺序并不保守。     

剑尾鱼线粒体DNA D-环及侧翼tRNA↑（thr）和tRNA↑（pro）序列与结构分析

采用PCR方法从剑尾鱼(Xiphophorus helleri)线粒体基因组中扩增到1段约15．5kb的片段，测定了其中627个碱基的序列。经测序分析表明，该扩增片段包括486bp的D—环的部分序列以及D—环5端的tRNA^trh和tRNA^pro基因的完整序列。其中486bpD环序列包含3段保守的终止相关序列TAS、与TAS互补的序列以及类似其他鱼类线粒体CSB序列。tRNA^trh由线粒体DNA的H链编码，长度为72bp。tRNA^pro由线粒体DNA的L链编码，长度为69bp。并绘制了这2种tRNA的二级结构图。本研究所测定的基因序列已登录国际GenBank数据库，序号为AF489918。     

暗纹东方鲀线粒体细胞色素b及其侧翼tRNA基因的克隆与序列分析

以暗纹东方纯（Takifugu fasciatus）肝脏的线粒体DNA为模板，按照红鳍东方豚（Takifugu rubripes）线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增，克隆并测定线粒体细胞色素b（Cyt b）及其侧翼tRNA基因的全序列，结果显示，克隆的暗纹东方纯Cyt b基因（1137bp）及其5’端上游的tRNA^Glu基因和3’端下游的tRNA^Thr基因序列共1327 bp。用DNA分析软件对暗纹东方纯与GenBank中10个目13种鱼类的Cyt b序列进行比较分析，显示暗纹东方纯与这些鱼类的Cyt b基因具有较高的同源性，与同属红鳍东方纯的同源性最高，为96．1％；与同目不同科的矛尾翻车纯（Masturus lanceolatus）和翻车纯（Mola mola）的同源性分别为74．1％和74．8％。tRNA^Glu基因由69个碱基组成，tRNA^Thr基因由72个碱基组成，与红鳍东方纯相应tRNA的碱基组成完全相同。推定的这两种tRNA的二级结构都具有典型的三叶草型结构，各臂的碱基配对率高，稳定性好。根据暗纹东方纯与其他13种鱼的Cyt b基因序列同源性所建立的进化树比较，结果与传统的分类地位基本吻合。     

仿刺参线粒体全基因组序列结构及比较研究

利用已构建的仿刺参cDNA文库得到的线粒体DNA(mtDNA)相关基因序列设计扩增引物,测定了大连仿刺参线粒体基因组全序列,并对其进行了基因构成和进化分析。仿刺参线粒体基因组序列长16 109bp,其基因构成与其他后口动物基本一致,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和3个主要的非编码区。在其37个基因中,ND6、tRNASer(AGN)、tRNAGln、tRNAAla、tRNAVal、TrnaAsp位于L链上,其余均位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除ND1的起始密码子为GTG外,其余均以ATG作为起始密码子;除Cytb以"T"作为终止密码子外,其他蛋白质基因均具有完全的终止密码子,且在已知的棘皮动物线粒体蛋白质基因中,部分基因的起始和终止密码子表现出一定的纲内特异性。比较分析了大连、青岛、威海仿刺参线粒体基因组,三者的基因组成和排列相同,碱基组成相近,蛋白质编码基因的起始和终止密码子完全一致,但存在核苷酸和氨基酸序列的差异。三者的控制区序列存在多个插入/缺失和SNP位点。根据COI、Cytb和ND4计算了三者之间的遗传距离为0.006～0.018,遗传距离分析和系统进化关系分析都显示青岛仿刺参和威海仿刺参的关系较大连仿刺参更近。     

星虫动物线粒体基因组全序列的基因排列和特征比较

综合利用通用引物PCR和长PCR扩增,获得可口革囊星虫的线粒体DNA,结合鸟枪法和引物步移法获得可口革囊星虫的线粒体基因组。比较可口革囊星虫与方格星虫线粒体基因组,所有的37个基因均在同一条链上编码。2个星虫动物线粒体基因组蛋白质编码基因的起始、终止密码子及氨基酸长度存在差异。2个星虫动物的线粒体基因组,存在6个保守的基因区块:(1)nad6-cob-P-S2-C-M,(2)I-K-nad3-F,(3)nad4L-nad4-L2,(4)nad1-W-atp6,(5)nad5-S1及(6)nad2-cox1。去除转运RNA而仅比较蛋白质编码基因和核糖体RNA,则2个星虫动物线粒体基因组主编码基因的基因排列完全一致,均为:cox1-cox2-atp8-cox3-nad6-cob-srRNA-lrRNA-nad3-nad4L-nad4-nad1-atp6-nad5-nad2。星虫动物、环节动物和螠虫动物线粒体基因组共有5个保守区块:(1)cox1-cox2-atp8,(2)nad4L-nad4,(3)srRNA-lrRNA,(4)cox3-nad6-cob,(5)atp6-nad5。在15个主编码基因中,nad5基因和nad4基因变异位点数最多,因此可作为备选的分子标记,用于分析星虫动物不同物种和群体之间的生物多样性。     

卵形鲳!线粒体１６ＳｒＲＮＡ基因全长序列的克隆与分析

根据近源物种线粒体序列的同源比对，在16S rRNA基因上下游保守区域设计一对通用引物。PCR扩增获得特异的DNA片段，经克隆、测序和比对证实该片段包含了卵形鲳鲹线粒体16S rRNA全长序列1725bp。对5个个体分别测序后比对，发现卵形鲳鲹16S rRNA基因在钦州湾种群个体间存在至少7个变异位点，使5个个体分别具有5种不同的单倍型。将卵形鲳鲹和鲹科其它物种的16S rRNA序列进行比，根据比对结果构建的鲳鲹科各物种的系统进化树，支持鲹科下设四个亚科(鲹亚科，鰤亚科，鲳鲹亚科，鰆鲹亚科)的分类系统。综上所述，16S rRNA基因既可用于卵形鲳鲹种群遗传多样性分析，又适用于鲹科鱼类的系统进化分析。     

辽东湾斑海豹线粒体ND4、tRNAArg、ND4L和ND3基因序列分析

用PCR产物直接测序法,测定渤海辽东湾斑海豹15个个体线粒体的一段从ND3到ND4基因长度为625 bp的DNA序列。其中的1~118 bp是ND3基因的后部分,120~188 bp是tRNAArg基因完整序列,189~485 bp是ND4L基因完整序列,479~625 bp是ND4基因的前部分。在ND4L和ND4之间,有7个碱基是重叠编码的。15个序列间,只有ND4L基因中有一个位点发生C/T碱基转换。与GenBank中的斑海豹序列比较,tRNAArg基因序列完全一致,而ND4L基因序列则有两处发生转换。利用从GenBank中下载的22个海豹科动物的ND4L基因序列的系统发生分析表明,海豹科动物分为南半球和北半球两大类群,斑海豹与港海豹为北半球种类,亲缘关系最近。     

中华绒螯蟹与日本绒螯蟹线粒体DNA12SrRNA序列的比较

参考果蝇和蚤状Ｚａｏ的线粒体ＤＮＡ １２Ｓ ｒＲＮＡ序列进行了中华绒螯蟹与日本绒螯蟹的线粒体ＤＮＡ１２ＳｒＲＮＡ基因片段的引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定。两种的碱基序列长度相同，为４５７ｂｐ，其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量相似，分别为１５９ｂｐ（３４．７９％）、１７７ｂｐ（３８．７３％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（１５．３２％）和１５９ｂｐ（３４．７９％）、１７８ｂｐ（３８．９５％）５０ｂｐ（１０．９４％）、７０ｂｐ（１５．３２％）。中华绒螯蟹与日本绒螯蟹间有５处碱基序列差异，在９８ｂｐ、１５１ｂｐ、３１７ｂｐ和４１７ｂｐ碱基处为碱基转移，在２９４ｂｐ碱基处为碱基颠换。     

大黄鱼mtDNA ND5和Cytb基因的克隆与序列分析

2004年4月，将采自浙江省象山港海区网箱养殖的大黄鱼样本，提取总DNA，通过设计特异性引物对大黄鱼线粒体DNA（mtDNA）的辅酶5（ND5）和细胞色素b（Cytb）基因进行PCR扩增。扩增产物经琼脂糖电泳检测、纯化后直接测序。得到ND5的序列1839 bp和Cytb基因序列382 bp。应用primer premier5和MEGA3软件包所作的系统发育分析表明：依据大黄鱼ND5序列所作的进化树总体支持传统的分类地位，大黄鱼更接近塘鳢鱼科。而基于Cytb基因所作的分析表明，黑鳃梅童鱼是大黄鱼在石首鱼科中是遗传距离最小的。     

中华绒螯蟹线粒体DNA l2S rRNA基因片段的序列研究

首次进行了中华绒螯蟹（ Ｅｒｉｏｃｈｅｉｒ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）线粒体 ＤＮＡ １２ＳｒＲＮＡ的序列分析。参考果蝇、蚤状溞序列对中华绒螯蟹线粒体ＤＮＡ １２ＳｒＲＮＡ基因片段做了引物设计、ＰＣＲ扩增及序列测定，结果得到 ４５７ ｂｐ的碱基序列，其Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ含量分别为 １５９ｂｐ（３４．７９％）、１７７ｂｐ（３８．７３％）、５１ｂｐ（１１．１６％）、７０ｂｐ（ １５． ３２％），与果蝇、蚤状溞的相同基因片段的序列含量基本相似。     

基于12SrRNA和ND3基因序列分析巨[鱼丕]遗传多样性及系统进化

为从分子水平研究巨[鱼丕](Bagarius yarrelli Sykes)的遗传多样性和系统进化关系,本实验对采集于怒江、澜沧江、元江3河流5种群中的60个个体进行12S rRNA和ND3基因序列的PCR扩增,同时与红河河口群体12个个体的12S rRNA和ND3基因序列进行比对分析,采用Mega5.02软件对碱基组成、Kimura-2 parameter遗传距离、可变位点等进行分析。应用DnaSP软件进行遗传多样性相关参数的计算。结果显示:12S rRNA和ND3基因序列长度分别为954 bp和346 bp(349 bp),分别定义了51个单倍型和42个单倍型,12S rRNA和ND3序列中的碱基平均含量分别为:T为20.8%、C为25.7%、A为32.1%、G为21.4%和T为29.5%、C为28.2%、A为28.1%、G为14.1%,表现出明显的A+T偏倚性;6个群体的群体内和群体间的遗传距离分别为0.003~0.284(12S rRNA),0.009~0.059(ND3)和0.004~1.062(12S rRNA),0.008~0.143(ND3);12S rRNA基因的51个单倍型和ND3基因的42个单倍型序列总的单倍型多样性(Hd)、核苷酸多样性(Pi)及核苷酸平均差异数(K)分别为0.972和0.937、0.035和0.079、31.414和27.176,均显示出丰富的遗传多样性。结合从GenBank中下载的12S rRNA和ND3基因同源序列的[鱼丕]科9属10种鱼类进行系统发育树的构建,结果表明巨[鱼丕]独自汇聚成一大单系群,怒江潞江坝群体、怒江三江口群体及澜沧江临沧群体间关系较近,澜沧江景洪群体可单独构成一个单系种群,红河河口群体、红河曼耗群体与其它巨[鱼丕]构成一单系种群后再同澜沧江景洪群体汇聚成一支。     

欧、美中华绒螯蟹源于中国长江水系中华绒螯蟹的遗传证据

用包括Z2和Opp17两个10碱基随机引物在内的10个引物,对来自荷兰斯科克莱（Skodely)、美国加州圣何塞（San Jose)的中华绒螯蟹群体与中国长江水系中华绒螯蟹群体进行RAPD遗传比较分析。结果发现：（1）中华绒螯蟹群体特有的Z2引物扩增的700bp标记带（Z2^700bp）,在荷兰与美国2个中华绒螯蟹群体中同时出现,而不出现日本绒螯蟹南流江种群中特有的880bp标记带（Z2^880bp）,表明欧洲、美国中华绒螯蟹与中国中华绒螯蟹为同种Eriocheir sinensis,而非日本绒螯蟹Eriocheir japonicus;（2）Opp17引物扩增的947bp片段在中国长江、荷兰及美国3个中华绒螯蟹群体内的出现频率均达100%。结合Z2引物扩增结果,欧洲与美国中华绒螯蟹群体极可能是从中国长江水系中华绒螯蟹引入繁衍的。     

中华绒螯蟹核糖体DNA全序列分析

核糖体DNA通常被选作系统发育研究的分子标记,核糖体DNA中IGS部分序列的变异在一定程度上影响着生物的生长。报道了中华绒螯蟹核糖体DNA全序列的分离和序列特征。中华绒螯蟹核糖体DNA全长11660bp,包括18S(1873bp),ITS1(317bp),5.8S(163bp),ITS2(614bp),28S(4461bp)和IGS(4240bp);不同部分AT含量在40.1%～48.6%之间,低于果蝇(55.8%～80.0%),高于鲤(22.0%～43.7%)。平均100个核苷酸含简单重复序列(SSR)数由高到低依次为ITS2(0.98%),IGS(0.49%),28S(0.38%),ITS1(0.32%),18S(0.21%),5.8S(0%)。个体内差异分析结果表明,中华绒螯蟹个体内存在两类ITS2序列,其中一类在405nt处有一12bp(CGCAGGACCACC)插入序列。中华绒螯蟹rDNA的IGS部分长4240bp,AT含量为42.6%。IGS部分包含一个有约7个连续136～139bp单元组成的重复序列区,重复序列单元中存在XhoⅠ内切酶位点,为河蟹特有的重复序列;重复序列区后有一个由182个碱基对...     

鳀科鱼类线粒体全基因组序列结构特征及系统发育信息分析

为了解鳀科鱼类的线粒体全基因组序列结构特征及系统发育信息,以期为进化遗传学研究和分子标记的选取提供参考依据,对已知的10种鳀科鱼类的线粒体全基因组进行分析。结果显示:1)鳀科线粒体基因组全序列长度在16 660 bp到17 069 bp之间,基因组的结构和基因排列顺序与其它硬骨鱼类一致。2)比对后获得一致序列长度为15 704 bp(不含D-loop),其中变异位点5 570个,占所有位点数的35.5%。在编码基因中,序列变异程度和Kimura双参数遗传距离最大的是ND6基因(分别是47.5%和0.276),最小的是tRNA拼接序列(分别为18.7%和0.072)。3)基于Ka-Ks的Z检验和Tajima’s D检验表明蛋白质编码基因主要受到净化选择(即负选择,purifying selection)的作用;其中12个蛋白质编码基因(ND6除外)有强烈的净化选择(Ka/Ks<1),而ND6基因受正选择(positive selection)影响较大(Ka/Ks>1)。4)ND4、ND2和Cytb是进行鳀科鱼类系统发育分析的较为理想的分子标记。     

三疣梭子蟹14-3-3基因的克隆及其在低盐和病原胁迫后的表达分析

本研究利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 14-3-3基因(Pt14-3-3)。Pt14-3-3基因cDNA序列全长为2510 bp，包含开放阅读框741 bp，编码由247个氨基酸组成的蛋白，分子量为27.98 kDa。序列比对结果显示，Pt14-3-3基因与中华绒螯蟹14-3-3基因同源性最高(100%)。系统进化树分析表明，Pt14-3-3氨基酸序列与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)紧密聚为一支。组织表达分析显示，Pt14-3-3基因在肝胰腺、肌肉、鳃、心脏、眼柄、血淋巴中均有表达，其中，在肝胰腺中的表达量最高。低盐胁迫后，Pt14-3-3基因在鳃和肝胰腺中的表达量分别于48 h和12 h显著上调并达到最大值，分别为对照组的1.34倍(P<0.05)和7.54倍 (P<0.05)。人工感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)和白斑综合征病毒(WSSV)后，Pt14-3-3基因在肝胰腺和血细胞中整体均呈显著上调表达，最高上调17.52倍(P<0.05)。本研究结果表明，Pt14-3-3基因可能在三疣梭子蟹低盐适应和免疫反应中发挥重要作用。