海带配子体碳酸酐酶(CA)基因的克隆及其特征分析

根据海带雄配子体抑制消减cDNA文库2个长为376 bp的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),Blastn搜索发现它们与掌状海带的碳酸酐酶(carbonic anhydrase,CA)基因序列(GenBank登录号:AJ130777)有70%的相似性,结合该EST以及掌状海带CA基因保守序列设计引物,扩增得到海带配子体CA基因部分开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,再以此为基础设计基因特异性引物,然后利用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE),克隆得到一条长2 804 bp的cDNA序列(GenBank登录号:JF827608),其中5′-非翻译区(untranslated region,UTR)长166 bp,3′-UTR长1 765 bp,且具有明显的polyA尾巴,ORF长873 bp。它编码一个由290个氨基酸组成的前体蛋白,预测在20 Gly-21 Val处有一个典型的信号肽酶切位点,酶切后的成熟蛋白由270个氨基酸组成,具有3个锌结合的His残基所构成的催化活性中心,其分子量为30.44 ku,等电点为5.06。无论在cDNA或者DNA序列上,雌、雄配子体CA基因都没有差异,且无内含子。Southern-blotting杂交结果显示,海带配子体CA基因为单拷贝基因。蛋白同源性搜索,发现该基因的编码蛋白与掌状海带的α-CA蛋白有87%的同源性。基于36个CA蛋白的氨基酸序列所构建的邻接(Neighbor-Joining)系统进化树显示,自海带配子体中所克隆的CA基因位于α-CA蛋白所组成的一支,推测它可能为α-型,因而不在线粒体中起作用。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,Q-RT-PCR)结果表明,在增加CO₂浓度的条件下,CA基因在海带雌、雄配子体中的日表达量均较未增加的条件下有所增加,由此推测该CA基因不属于胞外CA;基于海带配子体CA蛋白仅具有一个信号肽,可以推测它是定位于叶绿体外膜上,以泵的方式为叶绿体光合作用提供充足的CO₂。