暗纹东方鲀Amhr2基因外显子9的SNP7271检测及其与性别相关分析

利用传统PCR和ABI 3730测序技术对暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)Amhr2基因外显子9进行了SNP7271检测和测序分析,并对该SNP位点与暗纹东方鲀性别相关性进行了研究。结果显示,在SNP7271位点发生了G/C碱基突变,产生了CG、CC两种基因型。SNP7271和暗纹东方鲀性别存在显著相关性(P0.01)。基因型为CG的个体生理性别为雄性,基因型CC的个体生理性别为雌性。     

大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子Ⅰ遗传多态性分析

肌肉生长抑制素是控制骨骼肌生长发育的重要细胞因子,采用PCR-SSCP和测序方法分析了大黄鱼肌肉生长抑制素基因外显子I的单核苷酸多态性,结果发现,外显子I有7个多态性位点,分别是270(G→A)、196(C→T)、349(A→T)、51(T→C)、352(G→A)、348(C→T)和264(G→T),但只有349位点和352位点的碱基突变造成错义突变,氨基酸变化分别为T→S和E→K,其他位点均属同义突变。存在7种基因型,它们的频率分别为0.2708、0.0833、0.3333、0.0208、0.1667、0.1047和0.0208,该基因位点的杂合度为0.709。统计分析表明,外显子I无论是基因型水平上的多态性还是氨基酸水平上的突变均与体长和体质量呈显著性相关(P<0.05),但与肌肉脂肪含量无显著相关(P>0.05)。     

青鱼线粒体ND4L的SNP筛选及在两种体色群体中的分布

为了分析青鱼线粒体蛋白编码基因与体色性状的相关性,从而筛选出与体色相关的SNP分子标记。本研究选取了5尾广东佛山灰色青鱼和5尾扬州邗江正常体色黑色青鱼群体的皮肤组织,通过qPCR检测13个线粒体蛋白质编码基因在两种颜色群体皮肤组织中的表达量,并进行显著性分析。对表达差异最明显的蛋白编码基因CDS区序列设计引物,并选取78尾佛山灰色青鱼样本和92尾邗江黑色青鱼样本进行测序,根据测序峰图筛选出SNP位点。结果发现：13个线粒体蛋白质编码基因中COII基因表达量最高,ND5基因表达量最低,ND4L基因在两种体色青鱼中的表达差异最为明显。在对170尾青鱼样本的线粒体ND4L基因上共检测到了2个SNP位点,位于编码区,且都为同义突变。卡方检验表明,252bp(C/T)处的SNP位点在两种体色青鱼群体中的等位基因频率和基因型频率都有极显著的差异(p＜0.01),243bp(A/G)处的SNP位点在两种体色青鱼群体中的等位基因频率和基因型频率差异不显著(p＞0.05),因此线粒体ND4L基因中的SNP位点C252T与青鱼体色显著相关。本研究中成功找到一个与青鱼体色相关的SNP分子标记,可以在青鱼的养殖和育种中提供理论分子层面的指导和帮助。     

刀鲚内皮素1基因SNP多态性及其与颌骨性状相关联分析

为探究刀鲚(Coilia nasus)内皮素1 (endothelin 1, Edn1)基因对刀鲚上颌骨长度的影响,根据此前的基因组重测序结果以及刀鲚基因组数据库,通过PCR扩增得到刀鲚Edn1基因序列,并使用直接测序法筛选并分析单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,分析各位点的基因型,并计算各位点的基本遗传参数、基因型频率和基因频率,将筛选出的SNP位点与刀鲚上颌骨长度性状进行关联分析、连锁不平衡分析和双倍型分析。结果表明,在刀鲚Edn1基因中共挖掘出5个SNP位点,分别为T134C、A418C、G1322A、C1607T、A1636C。G1322A与A1636C两个位点之间处于连锁不平衡状态。关联分析结果显示, T134C位点和A418C位点与上颌骨长度性状之间存在显著相关性;双倍型分析结果显示,T134C位点和A418C位点组成的双倍型中,D3(杂合TC和纯合AA)的上颌骨长度显著长于D1(纯合TT和杂合AC)和D2(纯合TT和纯合CC)。此外,刀鲚开口高度/头长和上颌骨长/头长的皮尔逊相关系数r=0.41,属中等正相关。研...     

草鱼GH基因3''部分序列多态性与生长性状及肌肉成分的相关性分析

为了解草鱼GH基因多态性与早期生长性状及肌肉成分的相关性,实验利用直接测序法从156尾草鱼GH基因的3′部分序列中共筛选到9个变异位点(分别命名为SNP1~SNP9:G2825A、G2914T、T2966G、A3002T、T3022C、A3301G、C3463T、C3547T、C3620T)。卡方检验结果显示,9个位点均未显著偏离Hardy-Weinberg平衡,且均表现为中等多态性(0.25PIC0.5);经连锁不平衡分析发现,SNP3、SNP4和SNP5位点为一组完美连锁不平衡,SNP2、SNP7、SNP9位点为一组完美连锁不平衡;GH基因3′部分序列5个位点单倍型分析共发现6种单倍型,其中Hap1(30.4%)所占的比例最高,Hap6(4.8%)所占比例最低。利用GLM及多重比较对草鱼GH基因中9个SNPs多态性与早期生长性状和肌肉成分进行相关性分析,发现SNP2和SNP3位点的纯合突变型在体质量、体长和粗脂肪性状上均显著高于野生型和杂合突变型;在双倍型分析时得出了相似的结果,同时含有SNP2和SNP3位点纯合突变的双倍型组合在生长和粗脂肪性状上均显著性高于其他组合。研究表明,草鱼GH基因中SNP2和SNP3位点与早期生长性状及肌肉成分存在显著性相关,可作为草鱼生长及肉质改良的候选辅助分子标记,并且为进一步对相关变异位点的功能验证奠定研究基础。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素基因单核苷酸多态与性早熟的关联性分析

该研究以中华绒螯蟹MIH基因编码区序列的10个单核苷酸多态位点(SNPs)为研究目标,采用性状-基因型分析方法研究了MIH基因变异与河蟹性早熟性状之间的相关性。结果表明,位于MIH基因内含子(Intron2)上一个SNP位点(SNP g.2466 CT)与中华绒螯蟹性早熟之间存在着较具统计学意义的相关性(OR=0.459,95%CI 0.223-0.944,P=0.034)。     

文蛤SRBI基因变异与红壳色性状的关联性

为了解文蛤体内类胡萝卜素代谢相关基因清道夫受体B类I(Mm-SRBI)与红壳色形成的关联性,采用直接测序法对基因编码区进行SNP筛查和关联分析,并用免疫荧光、蛋白免疫印迹分析了Mm-SRBI蛋白在红、白壳色文蛤外套膜中的表达差异。结果显示,在Mm-SRBI基因的编码区筛选到15个SNP位点,位于保守序列上的4个突变位点c.647C/T、 c.723A/G、 c.818C/T、 c.1037A/G与红、白壳色存在显著关联,其中c.723A/G位点为非同义突变(异亮氨酸突变为缬氨酸),且4个位点在遗传上存在强连锁性;蛋白免疫印迹与免疫荧光结果表明,Mm-SRBI在红壳中的蛋白表达量显著高于白壳文蛤,主要表达部位为外套膜边缘膜的纤毛处。研究表明,Mm-SRBI基因的高表达与变异可能导致文蛤对类胡萝卜素的代谢产生差异,从而在生长发育过程中导致红壳色的形成。     

凡纳滨对虾α-淀粉酶基因的SNPs检测

利用PCR产物直接测序法,对凡纳滨对虾SPR和SPF 2个品种共40个样本的α-淀粉酶基因(GenBank序列号:AJ133526)的单核苷酸多态性(SNP)进行了研究。找到9个SNPs,分别为:C127T、A138G、T951C、T1083C、C1457T、A2147C、A2226G、A2297G和T2306C。其中1个SNP是第4外显子中的错义突变,2个SNPs分别是第5和第7外显子中的同义突变,6个SNPs是内含子中的突变。这些结果可为凡纳滨对虾的研究提供遗传学依据。     

ENU诱变草鱼家系生长特性及肌肉生长抑制素基因SNP筛选的研究

经过175 d养殖,对4个N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变草鱼家系进行生长对比,采用显著性比较,偏相关分析和因子分析统计方法对草鱼体质量、全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚性状进行分析,进而运用双向测序法对MSTN1、MSTN2基因在具有明显差异家系中进行SNP位点筛选。试验结果显示,家系4的生长速度明显大于家系3,家系4的8个性状明显大于其他3个家系;家系1中体长、尾柄长、体厚与体质量密切相关,家系2中体长、头长、体厚与体质量密切相关,家系3中全长、体长、尾柄高与体质量密切相关,家系4中全长、体长、体厚与体质量密切相关。由此可知,家系4和家系3具有明显的生长差异。对于MSTN1基因,家系3在465位点C/G、467位点G/A,家系4在465位点C/G均发生错义突变;对于MSTN2基因,家系3和4在912位点C/T均发生同义突变,家系3在1027位点G/A、家系4在366位点A/G均产生错义突变,位于非编码区1390位点A/T和1401位点G/A在两个家系均发现SNP位点。试验结果表明,MSTN1、MSTN2基因的不同SNP位点与ENU诱变草鱼的生长性状存在紧密联系。     

长牡蛎酪氨酸酶基因(CgTyr1)SNP多态性与壳色性状的关联

黑色素是一种广泛存在于动物界的生物色素,而酪氨酸酶被认为是一种重要的调控黑色素合成的关键酶。实验以3种壳色的长牡蛎选育品系为材料,使用PCR-SSCP的方法对长牡蛎酪氨酸酶基因CgTyr1进行SNP分型筛选,将突变位点与不同壳色性状进行关联分析。结果显示,酪氨酸酶基因的外显子上存在23个SNP位点,其中11个SNP位点与壳色性状极显著相关;在这11个S N P位点中,检测到有3个S N P位点为有义突变(c.591C/T、c.632G/A和c.1155T/C),分别导致不同的氨基酸突变(Ala122Val、Gly136Ser和Phe310Ser);利用极显著关联的11个SNP位点,为每种壳色群体建立了1种单倍型,并在验证组中得到了确认。研究表明,长牡蛎酪氨酸酶基因的单个碱基突变和以此构建的单倍型与壳色性状存在显著的关联。本研究筛选出的SNP位点和构建的单倍型为长牡蛎壳色品系选育提供了重要的参考资料。     

中华绒螯蟹Scarb1基因功能及其与生长性状的关联分析

为研究B类Ⅰ型清道夫受体(SCARB1/SR-BI)在中华绒螯蟹代谢、生长以及免疫等生物学过程中的分子功能，实验对中华绒螯蟹Scarb1的克隆及时空表达进行了分析，观察了RNA干扰该基因后的相关组织结构和类胡萝卜素含量变化，筛选了该基因的SNP标记并与生长相关性状进行关联分析。结果显示，中华绒螯蟹的Scarb1由2个外显子和1个内含子组成，开放阅读框为2 415 bp，编码805个氨基酸；系统进化分析显示中华绒螯蟹与三疣梭子蟹的氨基酸同源性高达80.51%，具有较高的物种间保守性。该基因在不同蜕壳时期的肝胰腺、肠道、血淋巴细胞、心脏、鳃和肌肉组织中均有表达，但在肝胰腺、肠道和血淋巴细胞中的表达量相对较高。RNA干扰Scarb1后，组织切片观察发现肝胰腺的肝小管管腔模糊并产生了部分空泡化结构，肠道内膜的肌肉层和黏膜下层处出现显著空洞现象；肝胰腺的颜色由黄色变成灰白色，其中的类胡萝卜素含量显著下降。在该基因的第一外显子筛选到1个SNP位点(C432T)与蜕壳后体重和壳长增长率存在显著相关性。本研究结果为Scarb1在中华绒螯蟹的遗传研究和育种应用提供参考。     

杂色鲍HSP90基因启动子的功能分析

为探索启动子在热休克蛋白90表达调控中的作用,本研究在课题组已有杂色鲍HSP90基因cDNA的基础上,通过Genome walking、Tail-PCR和常规PCR等技术克隆获得该基因的5′调控区序列。在翻译起始位点(ATG)和第一外显子(长度94 bp)之间有一个809bp的内含子,第一外显子之前的5′调控区共2800 bp,从预测的转录起始位点(A)起,共2811 bp。在转录起始位点(A)上游–30 bp处存在TATA box。潜在的转录因子结合位点包括ATF、TBP、Sp1、Oct-1、C/EBPalpha、NF-1、NF-κappa B、GATA-1、Sox-2等。CpG岛预测软件分析其含1个CpG岛,长度为131 bp。实验构建了8个启动子缺失片段的萤火虫荧光素酶表达载体,通过瞬时转染293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,确定杂色鲍HSP90基因核心启动子区位于–98~83 bp。在–624~–539 bp,Oct-1、C/EBPalpha、NF-1这3个转录因子都起到一定的抑制作用。     

大口黑鲈肌球蛋白重链基因SNPs的筛选及与生长性状的关联

肌球蛋白是肌肉细胞的重要组成成分,影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了研究肌球蛋白重链(MYH)基因多态性与大口黑鲈生长性状的相关性,本研究采用PCR技术扩增得到编码区序列全长为9759 bp的大口黑鲈MYH基因,该基因包含37个外显子和36个内含子,编码1940个氨基酸。采用直接测序法在MYH基因上筛选到8个单核苷酸多态性标记(SNP)位点(A-305G、G-558C、A-2784C、A-2816G、T-4765A、C-6206T、C-6811T和G-6935T),有4个位于外显子上,其中2个属于同义突变。用SNa Pshot方法对从同批繁殖、同塘养殖的大口黑鲈"优鲈1号"群体中随机选取的430尾个体中各位点的基因型进行检测。结果显示,内含子上的A-2784C和A-2816G位点完全连锁,所有位点在大口黑鲈"优鲈1号"群体中的平均有效等位基因数、平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为1.635、0.406和0.373,仅C-6206T、C-6811T和T-4765A位点的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg定律。采用一般线性模型分析各位点与大口黑鲈生长性状之间的相关性,研究发现,C-6811T位点CC基因型个体的体质量和全长显著大于TT基因型,CC基因型个体的体高和尾柄长显著大于CT和TT基因型,其余位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异。C-6811T位点与生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种的候选标记。     

食蚊鱼CYP19a基因的克隆与序列分析

硬骨鱼类CYP19基因与生物的性别分化和激素调节相关,因此可开发用来探究环境激素污染与基因表达的关系。本研究首次克隆和分析了食蚊鱼CYP19a cDNA的全系列,为将CYP19基因作为监测环境激素生物标志物的研究提供了全面的实验数据。根据CYP19a基因c DNA保守区域设计引物,扩增保守区域并测序。采用RACE法扩增食蚊鱼CYP19a基因c DNA序列全长,对其蛋白序列进行同源性分析,并将序列应用于CYP19a mRNA转录水平的RT-PCR法检测中。成功克隆食蚊鱼CYP19a基因全长,获得CYP19a基因总长为2020 bp,ORF为238~1791 bp,共编码518个氨基酸,对其编码的蛋白质进行有关信号肽、跨膜螺旋、亲水性/疏水性、一级结构、二级结构和三级结构分析,与其他硬骨鱼类底鰆、青鰆、平鲷、鲫、鲤和斑马鱼的性腺CYP19a基因作同源性比较,其基因相似度分别为93%、84%、84%、71%、71%和66%。用MEGA6.0软件对19个物种的CYP19a基因进行聚类分析,食蚊鱼CYP19a基因与底鰆、青鰆同源性最高,说明芳香化酶在进化上相对保守。确定从食蚊鱼性腺所克隆的CYP19a基因是芳香化酶基因,证明食蚊鱼的芳香化酶是由CYP19a和CYP19b两种基因编码的。食蚊鱼卵巢芳香化酶具有3个高度保守的片段,并具有催化活性。     

鳖源柠檬酸杆菌属新种的分离鉴定与多位点序列

为确定2020年10月湖北一中华鳖发病的病原体及病原特征，实验从该养殖场患病中华鳖个体肝脏中分离获得1株优势菌A3，经理化性状及16S rRNA序列鉴定，表明菌株A3属于柠檬酸杆菌。进一步通过recN序列鉴定，发现A3与布氏柠檬酸杆菌recN碱基一致性为95.58%～96.01%，与柠檬酸杆菌属其他种的recN碱基一致性均低于93.72%，表明菌株A3为柠檬酸杆菌属潜在新种。人工回归感染实验证实菌株A3是引起本次中华鳖患病的病原菌。与嗜水气单胞菌相比，A3感染病程偏慢但致死率较高。药敏实验结果显示，菌株A3对美罗培南等10种抗生素敏感，对氟苯尼考等9种抗生素耐药。多位点序列分型(MLST)鉴定显示，菌株A3属于新序列型(ST)。对柠檬酸杆菌多位点序列分型的7个管家基因序列进行级联并构建系统发育树，结果显示，柠檬酸杆菌的进化与菌株的分离源及分离地点没有明显关系；菌株A3与分离自欧洲人源的ST120型菌株Citfre2580亲缘关系最近。本研究对中华鳖的病原进行了分离鉴定，并阐述了一种更可靠的柠檬酸杆菌鉴定方法，旨在引起人们对柠檬酸杆菌致病性的重视，为水产品健康养殖提供一定的参考依据。     

中华鳖dazl基因克隆及在生殖细胞中的表达

为探索龟鳖类生殖细胞的发育分化机制,实验通过特异性引物克隆了中华鳖dazl基因的cDNA片段,长1 007 bp,其中包括5′端非编码区197 bp,3′端非编码区33 bp,开放阅读框777 bp,编码258个氨基酸。氨基酸序列比对显示其与西部锦龟Dazl同源性最高,达96%;与小鼠Dazl同源性达75%。荧光定量PCR分析结果显示,中华鳖dazl mRNA主要在精巢和卵巢中表达,在体细胞组织中仅检测到微量表达。冰冻切片原位杂交结果显示,中华鳖dazl mRNA在生殖细胞中特异表达,且在不同时期的生殖细胞中呈动态表达模式。在精巢中,中华鳖dazl mRNA在初级和次级精母细胞中表达最强,在精原干细胞中表达水平次之,在精子细胞中未检测到信号;在卵巢中,中华鳖dazl mRNA信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布且在最早期的初级卵母细胞中信号最强,随着卵母细胞的增大,信号逐渐聚集并逐渐减弱。研究表明,dazl基因可能对中华鳖两性生殖细胞的发生具有重要的调控作用。     

中华绒螯蟹Akt基因的cDNA克隆、序列分析及表达特征

为研究Akt基因在中华绒螯蟹蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Akt(命名为Es Akt)的全长为2 200 bp的c DNA序列,包括159 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、496 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和长度为1545 bp编码514个氨基酸的编码序列。蛋白质结构域分析显示Es Akt含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的3个特征性保守结构域。多序列比对和系统发育分析显示,Es Akt与中国明对虾、凡纳滨对虾的Akt序列一致性都为0.889,在系统发育树中节肢动物Akt形成一个分支。应用荧光定量RTPCR技术分析Es Akt在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Akt在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中卵巢、眼柄和精巢中表达量较高,肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期不同部位的肌肉中,Es Akt表达量变化不同,步行足肌肉组织中Es Akt m RNA无显著的统计学差异。腹部肌肉组织中Es Akt m RNA水平在蜕壳前晚期D3~D4期表达量显著高于蜕壳后A~B期和蜕皮间期C期。螯足肌肉在蜕壳前晚期D3~D4期急剧下调,蜕壳后A~B期开始表达量显著升高,直至蜕皮间期C期。研究表明,Es Akt在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达量变化与蜕壳周期密切相关,说明Es Akt参与中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。     

缢蛏EGFR基因内含子1内SNP位点多态性与生长性状相关性

为研究缢蛏表皮生长因子受体基因(epidermal growth factor receptor,EGFR)单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与生长性状(壳长、壳宽、壳高和体质量)的相关性。本实验利用直接测序法从缢蛏EGFR基因的第一个内含子序列中共筛选到17个SNP位点。卡方检验结果显示,在17个位点中,有13个位点符合Hardy-Weinberg平衡,位点多态性检测显示17个位点中有10个位点表现为中等多态性(0.25PIC0.5)。利用一般线性模型(general linear model,GLM)及多重比较对缢蛏EGFR基因中17个SNPs的多态性与生长性状(壳长、壳宽、壳高和体质量)进行相关性分析,结果显示,16个SNP位点均与缢蛏的壳长、壳宽、壳高及体质量呈显著性相关。由此可见,EGFR基因可作为缢蛏生长性状改良的候选辅助分子标记,并且为进一步研究其生长相关功能奠定基础。