中华绒螯蟹Smad3(EsSmad3)的cDNA克隆、序列分析及表达特征

为了研究Smad基因在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Smad3(命名为Es Smad3)的cDNA全长序列2021 bp,包括36 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、656 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和编码442个氨基酸的开放阅读框。蛋白质结构域分析显示EsSmad3含有MH1和MH2两个特征性保守结构域。多序列比对显示,EsSmad3与人、斑马鱼、黑腹果蝇中的同源蛋白序列一致性分别为0.679、0.691、0.619。应用荧光定量RT-PCR技术分析EsSmad3在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Smad3在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中眼柄和精巢中表达量较高,心脏和肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期的不同部位的肌肉中,Es Smad3表达量变化不同:步行足肌肉组织中EsSmad3 mRNA表达在蜕壳间期高于蜕壳前D_(3–4)期和蜕壳后A~B期,但无显著的统计学差异(P0.05)。螯足肌肉在蜕壳前晚期D_(3–4)期急剧下调(P0.05),蜕壳后A~B期开始表达量显著升高(P0.05),直至蜕皮间期C期。腹部肌肉组织中EsSmad3m RNA水平在蜕皮间期C期显著高于蜕壳后A~B期,这种上调一直持续到蜕壳前晚前期D_(3–4)。上述结果表明,Es Smad3在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达模式与蜕皮周期密切相关,推测Es Smad3参与了中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。     

中华绒螯蟹细胞色素CYP2基因的克隆与表达分析

为研究细胞色素CYP2基因在中华绒螯蟹蜕皮及生长发育中的作用,本试验通过逆转录聚合酶链式RT-PCR反应以及cDNA末端快速扩增RACE技术获得了中华绒螯蟹CYP2基因cDNA全长。用实时荧光定量PCR技术,分析该基因在中华绒螯蟹蜕皮过程中各组织的相对表达量。试验结果显示,中华绒螯蟹CYP2的cDNA全长1772bp,编码491个氨基酸序列,包括一个84bp的5′端非编码区,一个212bp的3′端非编码区、一个1475bp的开放阅读框,经BLAST比对,该核苷酸序列与岸蟹、三疣梭子蟹的相似性分别为66%、64%。实时荧光定量PCR结果显示,中华绒螯蟹蜕皮前,CYP2基因在鳃中的表达量相对最高;在肝胰脏、肌肉中表达量略低于鳃;在Y器官、眼柄、胸神经节、脑神经节、肠中少量表达;在心和胃中表达量最低。中华绒螯蟹在不同的蜕皮时期中,通过荧光定量试验得出,肝胰脏中CYP2基因表达量在蜕皮前期和蜕皮期最高;眼柄中CYP2基因表达量从蜕皮期到蜕皮后期有上升趋势;鳃中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高;Y器官、脑神经节和肠中CYP2基因表达量在蜕皮期最高;肌肉中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高;胸神经节和胃中CYP2基因表达量在蜕皮后期最高;Y器官中CYP2基因在蜕皮前期表达量高于蜕皮后期和蜕皮期。以上试验结果表明,CYP2对中华绒螯蟹蜕皮生长中的调控可能起到重要作用。     

中华绒螯蟹4E-BP1基因的克隆、表达特征及其在蜕壳中的作用

真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 1 (4E-BP1)是 mTOR 信号通路下游的翻译抑制因子, 调节翻译的起始和蛋白质的合成。为探究中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) 4E-BP1 基因特征、时空表达模式及其在蜕壳过程中的潜在作用, 本研究利用 RACE 技术克隆获得中华绒螯蟹 Es4E-BP1 全长 cDNA 序列, 利用 qPCR 技术探究其时空表达, 利用 dsRNA 干扰探究其在中华绒螯蟹蜕壳中的作用。测序结果显示, Es4E-BP1 cDNA 全长 1678 bp, 包括 134 bp 的 5? 非编码区、1193 bp 的 3?非编码区和 351 bp 的开放阅读框。氨基酸序列分析发现, Es4E-BP1 含有 1 个 eIF4E 超级家族的典型保守域, 且包含 1 个超二级结构 TOS 基序和 1 个 YXXXXLΦ 基序。多序列比对和系统进化树分析显示, Es4E-BP1 与蓝蟹(Callinectes sapidus)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)聚为一支并且具有很高的同源性 (95.69%和 93.16%)。qPCR 结果显示, Es4E-BP1 在成蟹各个组织均有表达, 其中 Y 器官表达量最高, 其次为肌肉, 鳃丝中表达量最低。一个完整蜕壳周期内, 幼蟹不同组织表达模式不同, 但均在蜕壳后期 A-B 期表达量最高, 蜕壳前期表达量较低。注射 dsEs4E-BP1 后, 中华绒螯蟹存活率远低于对照组 CG 组; 蜕壳间隔显著高于 CG 组。研究结果表明, Es4E-BP1 在中华绒螯蟹各组织中广泛表达, 在调控蜕壳生长中具有重要作用, 为进一步研究甲壳动物 4E-BP1 基因提供了重要参考。     

中华绒螯蟹延伸因子EF-1δ基因全长cDNA克隆及表达

根据非洲爪蟾延伸因子-1δ(elongation factor-1δ,EF-1δ)基因的保守序列设计引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆出中华绒螯蟹EF-1δ基因并进行各组织间的表达分析.序列分析表明,中华绒螯蟹EF- 1δ cDNA全长933 bp,编码263个氨基酸,经BLASTN和BLASTX软件分析表明,此EF-1δ cDNA核苷酸序列与非洲爪蟾EF-1δ核苷酸序列的同源性最高,其相似性为70％;所编码的氨基酸序列与大红斑蝶EF-1δ的氨基酸序列相似性为54％.聚类分析表明,中华绒螯蟹EF-1δ的氨基酸序列与鱼虱EF-1δ聚为一支.荧光定量PCR结果显示,EF-1δ在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高,精巢、肝胰腺中有少量表达,心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达.不同发育状态的中华绒螯蟹EF-1δ在肌肉组织中表达量均显著高于肝胰腺和鳃组织中表达量(P＜0.05);3个不同发育状态蟹EF-1δ在肌肉中的表达量也呈显著性差异(P＜0.05),在早熟蟹肌肉中表达量最高,正常成熟蟹肌肉中次之,幼蟹肌肉中最低;不同发育状态蟹EF-1δ在肝胰腺和鳃组织中的表达没有显著差异(P＞0.05).     

中华绒螯蟹RXR基因全长cDNA克隆及表达分析

维甲类X受体(retinoid X receptor,RXR),属于核受体超家族(nuclear receptor super family)成员,是一种重要的调控因子,对甲壳动物生长发育和繁殖具有十分重要的作用。本研究根据陆地蟹 RXR基因保守区序列设计上下游引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)RXR基因并进行各组织间的表达分析。序列分析表明中华绒螯蟹RXR cDNA全长1517bp,编码433个氨基酸。经BLASTn和BLASTx分析表明,中华绒螯蟹RXR氨基酸序列与陆地蟹RXR基因的氨基酸序列相似性最高,为96%。系统进化树分析显示,中华绒螯蟹RXR的氨基酸序列与陆地蟹RXR聚为一支。荧光定量PCR结果显示,RXR在所有检测的组织中均有表达,且在中华绒螯蟹Y器官中表达量最高,肝胰腺、鳃和肌肉中有少量表达,心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中RXR表达量在D期最高,与AB期、C期呈显著性差异（P＜0.05）;肌肉中RXR在AB期表达量最高,与其他蜕皮时期呈显著性差异（P＜0.05）;肝胰腺和鳃中RXR在AB期表达量最高,E期表达量最低,但各蜕皮时期表达量之间差异不显著。     

中华绒螯蟹EcR基因全长cDNA克隆及表达分析

为了研究蜕皮激素受体(EcR)在中华绒螯蟹蜕皮和性腺发育过程中的作用,本实验采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术,克隆了中华绒螯蟹EcR基因全长cDNA序列。运用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法,分析该基因在不同组织、蜕皮过程及卵巢发育阶段的表达特征,并研究了甲基法尼酯(MF)对卵巢中EcR的调控作用。结果显示,中华绒螯蟹EcR cDNA全长2 156 bp,编码422个氨基酸,其序列与招潮蟹相似性最高,为89%。荧光定量PCR结果显示,EcR在Y器官中表达量最高;在卵巢和肌肉中少量表达;在肝胰腺、鳃、心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中EcR表达量在D期和E期的表达量最高;肝胰腺中EcR表达量从AB期到D期有上升的趋势,到E期有所降低;肌肉中EcR表达量在AB期最高;鳃中EcR表达量在D期最高。在中华绒螯蟹卵巢发育过程中,EcR在卵巢发育Ⅰ~Ⅳ期的表达量有上升趋势,到Ⅴ期表达量降低;体外注射实验中,MF1(注射1μg)组的EcR表达量与对照组和生理盐水组无显著差异,而MF2(注射2μg)组的EcR表达量显著上升;离体培养实验中,MF1组(10-8mol/L)和MF2组(10-7mol/L)显著高于对照组和生理盐水组。研究表明,EcR基因在中华绒螯蟹蜕皮和卵巢发育过程有重要作用,MF可以调控EcR基因在卵巢中的表达。     

中华绒螯蟹几丁质酶基因HXchit全长cDNA克隆及其在蜕皮过程中的表达分析

采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和c DNA末端快速扩增(RACE)技术,依据锯缘青蟹(Scylla serrata)几丁质酶基因的保守区设计引物,克隆了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)几丁质酶基因(HXchit)全长,并通过荧光定量PCR(q RT-PCR)技术研究了HXchit在中华绒螯蟹的同一蜕皮阶段不同组织、不同蜕皮阶段主要几个组织的表达情况。结果显示,HXchit基因c DNA全长2 042 bp(Gen Bank accession no.KJ513466),包括5′非编码区(5′UTR)35 bp,3′非编码区(3′UTR)537 bp,开放阅读框(ORF)1 470 bp,编码490个氨基酸,预测分子量和理论等电点分别为53.44 k D和4.41。经BLASTN和BLASTX分析,HXchit基因的氨基酸序列与锯缘青蟹几丁质酶的氨基酸序列同源性最高,相似性为75%;经聚类分析,HXchit氨基酸序列与锯缘青蟹几丁质酶聚为一支。q RT-PCR结果显示,HXchit在所检测的组织中均有表达,各组织的表达量依次为肝胰腺表皮肌肉胃鳃胸神经节肠心脏脑神经节。对不同蜕皮周期的中华绒螯蟹分析显示,肝胰腺中HXchit表达水平在D期最高,并与E期、AB期及C期呈显著性差异(P0.05);表皮中HXchit在E期、AB期、C期和D期的表达水平呈逐渐升高的趋势,D期表达量达到最高且与E期、AB期、C期呈显著性差异(P0.05);肌肉中HXchit表达量在C期最高,但各蜕皮时期的表达量之间差异不显著(P0.05)。结果表明HXchit是一种在中华绒螯蟹肝胰腺中大量表达的酸性几丁质酶,推测其在蜕皮周期中对几丁质类食物的消化或内源性几丁质的降解起到了重要作用,本研究旨在为进一步探索几丁质酶的准确生理功能和调控机制奠定分子基础。     

中华绒螯蟹蜕皮周期及蜕皮过程中肝胰腺消化酶活性的变化

采用Darch蜕皮周期分期方法,对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的蜕皮周期进行了划分,并初步探讨了中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺消化酶活性变化。根据第三颚足末端刚毛和表皮的形态学特征,可将中华绒螯蟹的蜕皮周期分为蜕皮后期(A-B期)、蜕皮间期(C期)、蜕皮前期(D期)和蜕皮期(E期),其中D期可进一步分为D0、D1、D3-43个亚期。在蜕皮过程中,肝胰腺淀粉酶和胰蛋白酶活性在蜕皮后A-B期开始升高,于蜕皮前早期D0阶段达最大(P<0.05),随后又逐渐降低,至蜕皮前晚期D3-4阶段降至最低(P<0.05);胃蛋白酶活力在蜕皮周期中于蜕皮前晚期D3-4阶段显著降低(P<0.05),其他阶段变化不明显(P>0.05)。结论认为,中华绒螯蟹蜕皮过程可分为C、D0、D1、D3-4、A-B 5个时期,蜕皮过程中肝胰腺淀粉酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶活性发生周期性变化。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1（MIH1）基因的cDNA片段克隆和Northern印迹分析

根据其他蟹类蜕皮抑制激素的氨基酸序列设计了简并引物,运用RT—PCR和RACE技术,从中华绒螯蟹(Erio-cheir japonica sinensis)成体的蜕皮间期眼柄中,克隆了1条长1145bp的cDNA。该cDNA编码60个氨基酸,包括942bp的3′端非翻译区。同源性分析结果表明,该cDNA编码的氨基酸序列和其他蟹类蜕皮抑制激素有较高的一致性,最高的一致性为64％,将获得的序列命名为中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因(GenBank检索号：AY309062)。用Northern印迹分析的方法对处于各个发育阶段的胚胎及涵状幼体期该基因的表达进行了研究,结果表明,处于胚胎发育早期的卵裂期几乎没有检测到杂交信号,而胚胎发育的其他时期和淹状幼体期都检测到蜕皮抑制激素1基因的mRNA。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1基因部分cDNA序列的获得为进一步获得该基因的全长cDNA、研究其功能及阐明中华螯蟹蜕皮的分子机制奠定了基础。     

中华绒螯蟹、日本绒螯蟹及其杂交种性腺发育和生化组成的比较

研究了中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)、日本绒螯蟹(E.japonica)及其杂交种成蟹性腺指数、肝胰腺指数、出肉率、总可食率及其常规生化成分,结果显示:(1)中华绒螯蟹的精巢指数显著高于其它两种群蟹,但其肝胰腺指数、出肉率和总可食率均无显著差异;中华绒螯蟹的卵巢指数也显著高于日本绒螯蟹和杂交蟹,而杂交蟹的肝胰腺指数显著高于其它两种群蟹。(2)中华绒螯蟹、日本绒螯蟹和杂交种精巢中水分、蛋白和脂肪含量分别最低,日本绒螯蟹精巢中碳水化合物含量最高;杂交种肝胰腺蛋白、脂肪和碳水化合物含量均最高,日本绒螯蟹肌肉中脂肪含量显著低于其它两种群。(3)日本绒螯蟹卵巢水分含量显著高于其它两种群蟹,蛋白、脂肪和碳水化合物含量显著低于其它两种群;日本绒螯蟹肝胰腺的水分和蛋白含量最高,但脂肪含量最低,杂交种肝胰腺中脂肪含量最高、水分含量最低;日本绒螯蟹肌肉中的水分含量最高,其它生化成分含量最低;中华绒螯蟹肌肉的水分含量最低,其它生化成分含量最高。整体上,中华绒螯蟹具有早熟特性,不同种群绒螯蟹性腺中的主要生化成分含量可能与其发育阶段有关,杂交蟹肝胰腺中脂肪含量较高,日本绒螯蟹肌肉中脂肪含量较低。     

Akt在中华绒螯蟹免疫中的功能

Akt作为PI3K-AKT 信号通路的核心分子,在细胞增殖、代谢、发育和存活等过程中发挥重要作用。本研究采用特异性引物及PCR技术,克隆获得了中华绒螯蟹Akt基因 (EsAkt)并进行生物信息学分析,实时定量PCR技术检测了EsAkt在中华绒螯蟹不同组织和不同免疫刺激后的表达水平,免疫荧光技术检测了EsAkt蛋白的细胞定位,双链RNA干扰技术分析了EsAkt干扰后凋亡基因的变化。结果显示,EsAkt分子包含PH结构域、中心催化结构域 (S_TKc)和羧基端疏水结构域 (S_TK_X) 3个保守的结构域。EsAkt在所有被检测的组织中呈现组成型表达,且在免疫相关组织 (如肝胰腺、鳃和血淋巴细胞)中的表达量显着高于胃和肠道。EsAkt蛋白主要以弥散状的形式分布在细胞质中。中华绒螯蟹注射脂多糖 (LPS)和嗜水气单胞菌后,显著诱导EsAkt转录本的表达,LPS免疫刺激12 h后,EsAkt响应达到峰值,为对照组的4.35倍,刺激48 h后,EsAkt的mRNA表达水平有所降低,但仍是对照组2.62倍。嗜水气单胞菌免疫刺激6 h后,EsAkt响应达到峰值,为对照组的9.05倍,刺激48 h后,EsAkt的mRNA表达量回落到正常水平。双链RNA干扰EsAkt后,EsAkt的mRNA表达量为对照组的0.38倍,而凋亡相关基因EsCaspase-3-like表达水平显著上调,为对照组的2.69倍。研究表明,EsAkt基因在中华绒螯蟹免疫中发挥重要作用,参与了机体对细菌引起的免疫应激过程。本研究丰富了中华绒螯蟹PI3K-AKT信号通路研究的基本资料,为进一步研究甲壳动物免疫防御机制奠定了基础。     

中华鳖dazl基因克隆及在生殖细胞中的表达

为探索龟鳖类生殖细胞的发育分化机制,实验通过特异性引物克隆了中华鳖dazl基因的cDNA片段,长1 007 bp,其中包括5′端非编码区197 bp,3′端非编码区33 bp,开放阅读框777 bp,编码258个氨基酸。氨基酸序列比对显示其与西部锦龟Dazl同源性最高,达96%;与小鼠Dazl同源性达75%。荧光定量PCR分析结果显示,中华鳖dazl mRNA主要在精巢和卵巢中表达,在体细胞组织中仅检测到微量表达。冰冻切片原位杂交结果显示,中华鳖dazl mRNA在生殖细胞中特异表达,且在不同时期的生殖细胞中呈动态表达模式。在精巢中,中华鳖dazl mRNA在初级和次级精母细胞中表达最强,在精原干细胞中表达水平次之,在精子细胞中未检测到信号;在卵巢中,中华鳖dazl mRNA信号在初级卵母细胞胞质中均匀分布且在最早期的初级卵母细胞中信号最强,随着卵母细胞的增大,信号逐渐聚集并逐渐减弱。研究表明,dazl基因可能对中华鳖两性生殖细胞的发生具有重要的调控作用。     

中华绒螯蟹Scarb1基因功能及其与生长性状的关联分析

为研究B类Ⅰ型清道夫受体(SCARB1/SR-BI)在中华绒螯蟹代谢、生长以及免疫等生物学过程中的分子功能，实验对中华绒螯蟹Scarb1的克隆及时空表达进行了分析，观察了RNA干扰该基因后的相关组织结构和类胡萝卜素含量变化，筛选了该基因的SNP标记并与生长相关性状进行关联分析。结果显示，中华绒螯蟹的Scarb1由2个外显子和1个内含子组成，开放阅读框为2 415 bp，编码805个氨基酸；系统进化分析显示中华绒螯蟹与三疣梭子蟹的氨基酸同源性高达80.51%，具有较高的物种间保守性。该基因在不同蜕壳时期的肝胰腺、肠道、血淋巴细胞、心脏、鳃和肌肉组织中均有表达，但在肝胰腺、肠道和血淋巴细胞中的表达量相对较高。RNA干扰Scarb1后，组织切片观察发现肝胰腺的肝小管管腔模糊并产生了部分空泡化结构，肠道内膜的肌肉层和黏膜下层处出现显著空洞现象；肝胰腺的颜色由黄色变成灰白色，其中的类胡萝卜素含量显著下降。在该基因的第一外显子筛选到1个SNP位点(C432T)与蜕壳后体重和壳长增长率存在显著相关性。本研究结果为Scarb1在中华绒螯蟹的遗传研究和育种应用提供参考。     

淇河鲫cyp19a1b基因的克隆表达及芳香化酶抑制剂对其表达的影响

为探索脑型芳香化酶基因(cyp19a1b)在雌核发育三倍体鱼淇河鲫性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆淇河鲫cyp19a1b基因cDNA全长序列,采用Real-time PCR分析其在不同组织、胚胎及胚后不同发育时期的表达情况,同时检测芳香化酶抑制剂Letrozole诱导性逆转及腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(hCG)后cyp19a1b在脑中的表达情况。结果显示,淇河鲫cyp19a1b cDNA全长2 984 bp(GenBank ID:MF926270),包含132 bp5′非编码区,1 319 bp 3′非编码区,1 533 bp开放读码框,编码510个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,淇河鲫Cyp19a1b与其他鲤科鱼类同源性较高,与哺乳类、爬行类等脊椎动物同源性较低,这与其分类地位一致;组织分布检测结果显示,cyp19a1b基因在淇河鲫脑中表达量最高,在卵巢等其他组织中表达量较低;Realtime PCR结果表明,在胚胎发育过程中cyp19a1b在外源精子刺激后从囊胚期开始上调,神经胚期达到最高,随后降低;出膜后随着发育的进行,该基因在脑中表达量逐步上调,在躯体中一直维持在较低水平;除此之外,伴随着Letrozole诱导的性逆转,cyp19a1b在脑中表达量降低;腹腔注射hCG可以促进cyp19a1b在脑中表达。研究表明,淇河鲫cyp19a1b基因可能通过参与神经系统的形成及神经内分泌活动,在性别决定与分化过程中起到一定的作用。     

中国明对虾calcineurin B基因的克隆及其在竞争行为中作用的初探

中国明对虾在养殖中表现出较强的竞争行为,对其生长性能产生了较大的影响,然而,到目前为止其发生的分子机制尚不清楚。钙调神经磷酸酶(calcineurin,CN)是高度保守的Ca2+/钙调蛋白(calmodulin,CaM)依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,由催化亚基(CNA)和调节亚基(CN-B)组成,是参与许多重要生理过程的多功能蛋白质。CNB在Ca2+/CaM的介导下主要在动物的中枢神经系统发挥重要作用。另外,前期通过比较转录组分析筛选出的与中国明对虾竞争行为相关的候选基因中包括CNB基因。为了进一步明确CNB在中国明对虾竞争过程中的作用,实验通过RACE技术克隆了中国明对虾CNB基因(FcCN-B)的全长cDNA序列,并利用Real-time PCR技术分析了其在高竞争能力组(HCG)和低竞争能力组(LCG)组间不同组织(神经节、心脏、胃、肝胰腺和肠)中的表达情况。结果显示,FcCN-B的cDNA全长序列为2867 bp,包括95 bp的5′非编码区(UTR),540 bp的开放阅读框(ORF),和2232 bp的3′UTR,其中ORF中具有4个保守的EF-hand Ca2+结合结构域。蛋白质同源性分析显示,FcCN-B的氨基酸序列与其他物种具有较高的同源性(78.8%~93.8%),其中最高的是中华绒螯蟹(93.8%)和黑腹果蝇(90.5%);系统进化关系分析显示,脊椎动物和无脊椎动物分别独立为一支,且中国明对虾与中华绒螯蟹单独聚为一支,之后与黑腹果蝇聚类关系最近,提示FcCN-B在中国明对虾中可能具有与其在中华绒螯蟹和果蝇中相类似的功能。Real-time PCR定量结果显示,FcCN-B在HCG组的神经节中的表达极显著高于LCG组,而其在HCG组的心脏中的表达极显著低于LCG组。研究结果表明,calcineurin B基因在中国明对虾的竞争行为中可能发挥一定的作用,将为解析中国明对虾竞争行为的分子机制奠定重要的基础。     

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。     

中华绒螯蟹蜕壳过程中螯足肌肉组织学及主要蛋白质含量变化

为探讨中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)蜕皮过程中肌肉生长机制,采用石蜡切片、电镜技术及生物化学方法,以中华绒鳌蟹幼蟹为对象,研究了其蜕壳过程中螯足闭螯肌肌肉的显微结构、超微结构及主要蛋白质含量的变化。结果显示,在蜕皮间期,螯足肌纤维充分伸展,多核,横截面呈不规则圆形或者多边形;肌原纤维排列有序,具有甲壳动物骨骼肌的典型特征,A带、I带及肌质网、二联体、线粒体等细胞器清晰可见。蜕皮前期,肌纤维降解以致其横截面大小不一;肌原纤维内部降解,出现腐蚀性空洞。蜕皮之后,在肌纤维末端的肌节处于超收缩状态,这些肌节长度缩短至正常长度的50%,肌纤维典型结构消失,A带、I带模糊不易区分,但肌质网、二联体、线粒体等结构仍然完整;肌纤维中间部分的肌节结构正常如蜕皮间期。生物化学研究发现,蜕皮前后螯足肌肉中肌原纤维蛋白和可溶性蛋白含量的变化同其结构特征的变化一致。本研究结果表明,中华绒螯蟹蜕皮后螯足肌肉可能的一种生长机制是通过增加新的肌节来伸长,动物刚蜕壳后,这些新形成的肌节以超收缩的形式存在,随着动物吸水身体膨大,外骨骼伸展、硬化,这些较短的肌节由于被拉伸而达到正常肌节的长度,从而完成肌肉的生长。     

黄河鲤酪氨酸酶基因的克隆、表达模式及定位分析

为探究Tyrosinase(Tyr)基因在黄河鲤体色形成中的作用,利用生物显微镜对黄河鲤黑色鳞片、银色鳞片、鳍条色素细胞的组成进行观察,并利用RACE克隆黄河鲤Tyr基因全长cDNA序列,荧光定量PCR分析其在不同组织中的表达情况,Western blot印迹和免疫组织化学方法检测其蛋白的表达定位。结果显示,黄河鲤具有黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞3种色素细胞,3种色素细胞的数量、种类和分布在不同组织中存在较大差异。黄河鲤Tyr基因cDNA全长1717 bp(GenBank ID:No.KY305667),其中ORF长1605 bp,编码535个氨基酸,5′-UTR区41 bp,3′-UTR区71 bp。蛋白同源分析发现,黄河鲤Tyr与鲤科鱼类相似性最高,与哺乳类及鸟类等脊椎动物相似性最低。系统进化分析显示,黄河鲤Tyr与鲤、瓯江彩鲤、锦鲤和斑马鱼等鲤科鱼类的亲缘关系最近。实时定量PCR分析表明,Tyr基因在黄河鲤不同组织中均有表达,肌肉中的表达量最高,其次是黑色皮肤,另外在黄色皮肤、臀鳍和尾鳍等黑色素细胞存在的组织中也有较高表达。Western blot印迹结果显示,Tyr基因在黑色皮肤中表达最高,其次是臀鳍和尾鳍,银色皮肤中没有表达。免疫组织化学结果显示,Tyr基因在黑色皮肤的黑色素细胞和黏液细胞中有表达。研究表明,Tyr基因表达水平与黑色素细胞数量和分布具有一定相关性,参与黄河鲤体色的形成。     

厚壳贻贝Wnt4基因时空表达

为探究Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段和组织生长过程中的作用,通过RACE技术克隆了厚壳贻贝Wnt4基因c DNA全长序列,该序列全长3342 bp,开放阅读框为1074 bp,编码357个氨基酸。该序列与人、小鼠、海胆、栉孔扇贝和长牡蛎等物种的同源性分别为61%、61%、60%、71%和76%。通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)分析Wnt4基因在厚壳贻贝成体多个组织中(外套膜、闭壳肌、鳃、雌雄性腺、足和消化腺)均有表达,其中在外套膜中表达量最高,推测可能与贝壳形成有关;Wnt4基因在厚壳贻贝幼虫发育阶段高表达主要集中在壳顶期,并推测Wnt4基因可能参与了贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育。本研究为进一步开展双壳贝类Wnt基因家族的功能研究提供了理论依据。