基于线粒体基因组的东方鲀属系统发育学及群体遗传学

为了细致探究东方鲀属内系统发育关系,本研究首次基于群体尺度对东方鲀属物种进行系统发育分析。利用线粒体基因组,在包含10个种的124尾东方鲀中,挖掘了1 488个单核苷酸多态性（SNP）位点和4个插入缺失（INDEL）,使用这些遗传变异位点进行了系统发育及群体遗传学分析。发现网纹东方魨与铅点东方鲀可能是同种异名,且二者形成的姊妹群位于东方鲀属基部;暗纹东方鲀与红鳍东方鲀、菊黄东方鲀与双斑东方鲀各自亲缘关系较近。此外,实验发现了4尾可疑的双斑东方鲀和菊黄东方鲀杂交个体,以及2尾可疑的横纹东方魨杂交个体。遗传多样性方面,弓斑东方鲀遗传多样性最低。此外,实验在10种东方鲀中共找到595个种间特异性SNP位点。Ka/Ks分析表明,nd6基因的Ka/Ks最高（平均为1.19）,说明在东方鲀属中nd6可能经历了正选择,而ATP合成酶基因可能在东方鲀适应淡水环境中受到选择。研究表明,东方鲀属内系统发育关系较为复杂,且在野生环境下东方鲀物种间广泛存在自然杂交现象,该研究为东方鲀物种快速鉴定提供可靠的分子标记,加速东方鲀属系统发育研究进展,并为东方鲀野生种质资源保护提供了理论依据。     

暗纹东方鲀雌雄个体形态差异及其判别分析

为比较暗纹东方鲀(Takifugu fasciatus)雌雄个体之间的主要形态指标及形态差异,对296尾暗纹东方鲀的11项计量性状及11项比例性状进行了统计和分析。主成分分析结果显示,暗纹东方鲀22项形态指标可以划分为整体轮廓、整体及尾部的浑圆程度、头部特征、尾部长度比例4个方面,累积贡献率达72.31%。逐步判别分析最终筛选出眼径、肥满度、头长/体长、尾柄高/体长和体宽/体长5个相关变量,并建立了该鱼的性别判别函数。通过数据回代方程检验可得出暗纹东方鲀雌雄判别的综合正确率为81.1%。同时对筛选出用于建立判别函数的5个变量进行t检验,结果显示,尾柄高/体长、体宽/体长两个比例性状在雌雄个体间差异显著(P0.05),表明雌性个体较雄性个体尾柄处较厚,体型较宽。上述差异性状和雌雄判别函数可为暗纹东方鲀性别的鉴定提供参考方法和理论依据。     

两种东方鲀的GH基因单核苷酸多态性分析

根据红鳍东方鲀生长激素基因全序列,设计13对引物,结合单链构象多态性(SSCP)技术和克隆测序技术对野生红鳍东方鲀、养殖红鳍东方鲀和养殖暗纹东方鲀群体进行了遗传多样性分析.结果表明:东方鲀整个生长激素基因的6个外显子中没有多态性,在其内含子2、内含子5以及3′侧翼区发现有多处序列变异位点,包括碱基的缺失、插入和一些单核苷酸突变.这些遗传多态性的存在为从分子水平上对东方鲀的鉴定提供了一定的依据.群体遗传结构分析结果表明,红鳍东方鲀养殖群体的一些等位基因丧失,造成其遗传多样性显著下降,应及早加强对其种质的保护.     

暗纹东方鲀心型脂肪酸结合蛋白H-FABP基因克隆与表达分析

为深入了解心型脂肪酸结合蛋白(heart-type fatty acid-binding protein,H-FABP)的结构与功能,采用RACE技术克隆得到暗纹东方鲀H-FABP的全长cDNA序列,共772 bp,开放阅读框为402 bp,编码133个氨基酸。生物信息学分析表明,暗纹东方鲀H-FABP基因具有一个脂质转运蛋白家族保守结构域和多个蛋白激酶磷酸化位点。NJ法系统进化分析显示,暗纹东方鲀与红鳍东方鲀亲缘关系最近,其次是鲈形目。经荧光定量PCR检测,H-FABP基因在暗纹东方鲀所有被检测的组织中都有表达,其中肝脏中的表达量最高,其次为肌肉和心脏,预示H-FABP主要参与脂肪酸氧化分解过程。为探究豆油作为脂肪源的可行性,采用不同比例(0、25%、50%和75%)豆油替代鱼油的饲料投喂初始体质量为(8.31±0.20)g的暗纹东方鲀8周。结果显示,全鱼油组肝脏中H-FABP基因的表达量显著高于50%豆油组和75%豆油组,但与25%豆油组无显著性差异,且随着饲料中豆油比例的增加,暗纹东方鲀肝脏中H-FABP基因的表达量呈下降趋势。研究表明,富含n-3多不饱和脂肪酸的鱼油可以促进脂肪酸氧化分解,能预防脂肪肝。因此,为不影响暗纹东方鲀肝脏脂肪代谢,饲料中豆油替代鱼油的比例应控制在50%以下。     

暗纹东方鲀抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体基因的克隆、生物信息学及表达分析

为探究暗纹东方鲀(Takifugu obscures)抗苗勒氏管激素Ⅱ型受体(anti-Müllerian hormone receptorⅡ,Amhr2)基因的序列和结构信息,初步研究amhr2基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,实验通过设计简并引物扩增及RACE技术,克隆出暗纹东方鲀amhr2完整的CDS区,分析其相应的生物信息学特征及其在不同组织和不同发育期的mRNA表达水平。结果表明:amhr2序列cDNA全长为1 868 bp(NCBI登录号:MH218814),编码513个氨基酸,与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)同源性最高,达99%。氨基酸多重序列比对结果显示,Amhr2氨基酸序列中的近C-末端区域序列较为保守;通过构建系统进化树发现,暗纹东方鲀Amhr2与红鳍东方鲀亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,暗纹东方鲀amhr2仅在性腺中表达,且卵巢中的表达量明显高于精巢;并且在性腺早期发育过程中,amhr2在精巢和卵巢中的表达量均呈现出先降低再迅速升高的表达趋势。研究结果表明,amhr2在暗纹东方鲀中的表达具有组织特异性,且在性别分化和性别维持等过程中发挥重要的作用。     

暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。     

大口黑鲈组织蛋白酶B基因SNP筛选及其与生长性状关联分析

在动物体内组织蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)是以酶原形式存在于溶酶体中,能水解多种蛋白,是调控动物生长发育的重要候选功能基因。为开发与大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)标记,本研究对大口黑鲈EST-SNP库中CTSB基因上的SNP位点进行筛选。经PCR扩增和测序分析,从该基因中筛选到1个SNP位点(命名为C+598G),该位点属于错义突变位点,编码的甘氨酸突变成为精氨酸。采用Sna Pshot方法对C+598G位点在165尾大口黑鲈养殖样本中的基因型进行检测,并分析其在群体中的遗传多样性。结果显示,C+598G位点在养殖群体中存在CC、GC和GG3种基因型,其频率分别是40.6%、47.3%和12.1%,C和G等位基因频率分别是64.2%和35.8%;该位点在群体中的观测杂合度(Ho)和多态信息含量(PIC)分别为0.473和0.354,符合哈代-温伯格平衡定律。进一步分析不同基因型与大口黑鲈生长性状相关性,结果表明,3种基因型个体的体质量、全长、体高、尾柄长和尾柄高性状平均值从小到大依次为GG型、GC型和CC型,其中GG型个体在体质量上显著小于CC型个体(P<0.05)。本研究获得的C+598G标记与大口黑鲈生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种研究中的生长标记。     

大口黑鲈HSC70-1基因多态性及其双倍型与生长性状的关联分析

为了探讨HSC70-1基因对大口黑鲈(Micropterus salmoides)生长性状的影响作用,开发与生长性状相关的分子标记,该研究采用PCR技术扩增得到HSC70-1基因的cDNA和DNA全序列,编码区cDNA序列长1 953 bp,编码650个氨基酸,其DNA全序列长3 390 bp,包含8个外显子和7个内含子。采用直接测序法在该基因上筛选到4个单核苷酸多态性(SNP)位点,分别位于核苷酸序列中的第821、第1 105、第1 200和第2 804碱基处,且处于内含子上。SNP标记与性状的关联分析结果表明,C-821G位点上CC基因型个体的体质量和全长均显著高于CG和GG基因型(P0.05)。A-2804T位点上TT基因型个体的体质量和全长均显著高于AT和AA基因型(P0.05)。其他位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异(P0.05)。通过合并基因型发现,双倍型D1 (CC--CCTT)的各个生长性状表现最优,在体高和全长上显著高于D5。C-821G、A-2804T和D1与生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种的候选标记。     

暗纹东方鲀越冬盐度试验

为研究不同温度条件下盐度对暗纹东方鲀幼鱼越冬成活率的影响,于2012年底进行了盐度梯度试验,测定在不同温度(8、10、12、15℃)下,(50±2.32)g的暗纹东方鲀在不同盐度(0、1.5、3.0、4.5、6.0)下的越冬成活率,并通过大棚自然越冬试验进行验证。结果表明:同一温度条件下,在试验盐度范围内,随着盐度的升高,暗纹东方鲀的越冬成活率也逐渐提高;而在同一盐度下,随着温度的升高,暗纹东方鲀的越冬成活率也逐渐提高。当盐度为0时,暗纹东方鲀无法在自然温度下安全越冬;当盐度为4.5时,水温在8℃以上,暗纹东方鲀即能安全过冬,其越冬成活率达到80%以上。暗纹东方鲀大棚自然越冬试验证明,随着温度的下降逐渐增加水体盐度的方法经济而有效,当温度为15、12、10、9℃时,将相应的水体盐度调节为1.5、3.0、4.5、4.5,经过150 d的越冬期,两种规格(50~60 g和20~40 g)暗纹东方鲀的成活率分别为93.7%和80.5%。     

暗纹东方鲀种质退化特点及防控措施分析

<正>暗纹东方鲀是长江中下游特有优质渔业种质资源,是上海市水产原良种保护品种,野生个体有毒,常规淡水养殖暗纹东方鲀有弱毒,多代选育无毒家系淡水标准化养殖能够实现商品鱼完全无毒。对暗纹东方鲀的育苗和养殖研究始于20世纪80年代初,首先由上海市水产研究所在东海渔政局的支持下成立研究课题,在上海奉贤基地开展了暗纹东方鲀人工繁殖研     

An efficient molecular technique for sexing tiger pufferfish (fugu) and the occurrence of sex reversal in a hatchery population

The tiger pufferfish (fugu) is one of the most important food fishes in East Asia. Since its testes are regarded as a delicacy, sex determination is economically relevant. Previous studies have identified a missense single-nucleotide polymorphism (SNP) in the Amhr2 (anti-Müllerian hormone receptor type II) gene as a strong candidate for a master sex-determining polymorphism. To distinguish genotypic sex efficiently, we developed a high-resolution melting (HRM) assay for this SNP site. By screening 396 fish from two independent crosses reared under controlled conditions, we observed perfect concordance between the SNP genotype and phenotypic sex. Thus, this method holds great potential for use in high-throughput sexing. When analyzing 293 progeny from a third cross reared under unknown conditions, we unexpectedly found that 25 % of phenotypic males exhibited female genotype. These results suggest that environmental factors such as rearing conditions could influence the sex-determination pathway in pufferfish. Alternatively, genetic modifiers might override the signals from Amhr2. This finding raises a concern regarding enhanced stock management of this species, because sex-reversed fish could compromise the sex ratio in subsequent generations. The HRM assay will also be useful for monitoring the degree of sex reversal before release.     

青鱼线粒体ND4L的SNP筛选及在两种体色群体中的分布

为了分析青鱼线粒体蛋白编码基因与体色性状的相关性,从而筛选出与体色相关的SNP分子标记。本研究选取了5尾广东佛山灰色青鱼和5尾扬州邗江正常体色黑色青鱼群体的皮肤组织,通过qPCR检测13个线粒体蛋白质编码基因在两种颜色群体皮肤组织中的表达量,并进行显著性分析。对表达差异最明显的蛋白编码基因CDS区序列设计引物,并选取78尾佛山灰色青鱼样本和92尾邗江黑色青鱼样本进行测序,根据测序峰图筛选出SNP位点。结果发现：13个线粒体蛋白质编码基因中COII基因表达量最高,ND5基因表达量最低,ND4L基因在两种体色青鱼中的表达差异最为明显。在对170尾青鱼样本的线粒体ND4L基因上共检测到了2个SNP位点,位于编码区,且都为同义突变。卡方检验表明,252bp(C/T)处的SNP位点在两种体色青鱼群体中的等位基因频率和基因型频率都有极显著的差异(p＜0.01),243bp(A/G)处的SNP位点在两种体色青鱼群体中的等位基因频率和基因型频率差异不显著(p＞0.05),因此线粒体ND4L基因中的SNP位点C252T与青鱼体色显著相关。本研究中成功找到一个与青鱼体色相关的SNP分子标记,可以在青鱼的养殖和育种中提供理论分子层面的指导和帮助。     

大口黑鲈肌球蛋白重链基因SNPs的筛选及与生长性状的关联

肌球蛋白是肌肉细胞的重要组成成分,影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了研究肌球蛋白重链(MYH)基因多态性与大口黑鲈生长性状的相关性,本研究采用PCR技术扩增得到编码区序列全长为9759 bp的大口黑鲈MYH基因,该基因包含37个外显子和36个内含子,编码1940个氨基酸。采用直接测序法在MYH基因上筛选到8个单核苷酸多态性标记(SNP)位点(A-305G、G-558C、A-2784C、A-2816G、T-4765A、C-6206T、C-6811T和G-6935T),有4个位于外显子上,其中2个属于同义突变。用SNa Pshot方法对从同批繁殖、同塘养殖的大口黑鲈"优鲈1号"群体中随机选取的430尾个体中各位点的基因型进行检测。结果显示,内含子上的A-2784C和A-2816G位点完全连锁,所有位点在大口黑鲈"优鲈1号"群体中的平均有效等位基因数、平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为1.635、0.406和0.373,仅C-6206T、C-6811T和T-4765A位点的基因型频率分布符合Hardy-Weinberg定律。采用一般线性模型分析各位点与大口黑鲈生长性状之间的相关性,研究发现,C-6811T位点CC基因型个体的体质量和全长显著大于TT基因型,CC基因型个体的体高和尾柄长显著大于CT和TT基因型,其余位点不同基因型个体间的生长性状均不存在显著差异。C-6811T位点与生长性状显著相关,可作为大口黑鲈分子标记辅助育种的候选标记。     

刀鲚内皮素1基因SNP多态性及其与颌骨性状相关联分析

为探究刀鲚(Coilia nasus)内皮素1 (endothelin 1, Edn1)基因对刀鲚上颌骨长度的影响,根据此前的基因组重测序结果以及刀鲚基因组数据库,通过PCR扩增得到刀鲚Edn1基因序列,并使用直接测序法筛选并分析单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,分析各位点的基因型,并计算各位点的基本遗传参数、基因型频率和基因频率,将筛选出的SNP位点与刀鲚上颌骨长度性状进行关联分析、连锁不平衡分析和双倍型分析。结果表明,在刀鲚Edn1基因中共挖掘出5个SNP位点,分别为T134C、A418C、G1322A、C1607T、A1636C。G1322A与A1636C两个位点之间处于连锁不平衡状态。关联分析结果显示, T134C位点和A418C位点与上颌骨长度性状之间存在显著相关性;双倍型分析结果显示,T134C位点和A418C位点组成的双倍型中,D3(杂合TC和纯合AA)的上颌骨长度显著长于D1(纯合TT和杂合AC)和D2(纯合TT和纯合CC)。此外,刀鲚开口高度/头长和上颌骨长/头长的皮尔逊相关系数r=0.41,属中等正相关。研...     

四川白鹅催乳素基因内含子2的SNP及序列分析

以四川白鹅为材料,用PCR-SSCP方法检测了PRL基因内含子2扩增片段,结果在群体中共检测到AA、AB两种基因型。对不同基因型个体测序分析发现,四川白鹅PRL基因内含子2上存在一个新的SNP(A126G)位点。此外,将测序获得的四川白鹅PRL基因内含子2序列与GenBank上发表的皖西白鹅、浙东白鹅、马岗鹅、莱茵鹅PRL基因序列比对发现,鹅PRL基因内含子2区段存在一个(GA)n简单重复序列,且浙东白鹅、马岗鹅、莱茵鹅相比四川白鹅和皖西白鹅少一个GA重复,即存在一个简单重复序列多态性位点。     

凡纳滨对虾α-淀粉酶基因的SNPs检测

利用PCR产物直接测序法,对凡纳滨对虾SPR和SPF 2个品种共40个样本的α-淀粉酶基因(GenBank序列号:AJ133526)的单核苷酸多态性(SNP)进行了研究。找到9个SNPs,分别为:C127T、A138G、T951C、T1083C、C1457T、A2147C、A2226G、A2297G和T2306C。其中1个SNP是第4外显子中的错义突变,2个SNPs分别是第5和第7外显子中的同义突变,6个SNPs是内含子中的突变。这些结果可为凡纳滨对虾的研究提供遗传学依据。     

缢蛏α-淀粉酶基因外显子区域SNPs筛选及其与生长性状关联性

α-淀粉酶是广泛存在于生物体内的消化酶,主要参与生物体内碳水化合物的代谢,为生物体提供维持生命、生长发育和繁殖所需的能量。为研究α-淀粉酶基因外显子与缢蛏(Sinonovacula constricta)生长性状的相关性,实验采用PCR产物直接测序法对其进行筛选比对,共获得18个候选SNPs位点,分别为:Rs-1:48G/C、Rs-2:247 C/A、Rs-3:420 A/G、Rs-4:441C/T、Rs-5:537 G/T、Rs-6:837 G/T、Rs-7:936 A/G、Rs-8:952A/C、Rs-9:1047 T/G、Rs-10:1062 C/T、Rs-11:1287C/T、Rs-12:1350 A/C、Rs-13:1362 C/T、Rs-14:1371 C/T、Rs-15:1503T/C、Rs-16:1536 T/C、Rs-17:1737T/C、Rs-18:1788 C/T。随机选取同批繁殖、同塘养殖的缢蛏快长新品种"申浙1号"群体,运用MassARRAY质谱检测方法进行SNPs位点的分型,结果显示:除Rs-13位点外,其余位点均处于Hardy-Weinberg平衡(P> 0.05),Hardy-Weinberg平均值为0.581;多态信息含量平均值为0.237。基因型与生长性状的关联性分析结果表明:Rs-5:537 G/T与Rs-10:1062 C/T位点基因型个体之间部分性状存在显著性差异(P <0.05)。13个位点组成的双倍型与生长性状的关联性分析显示:双倍型S6的壳高高于S3、S5、S7(P <0.05),S6的总重大于S7(P <0.05);另外,S6各个生长性状值在所有双倍型中最高。获得的缢蛏α-淀粉酶编码区外显子与生长性状相关的SNPs标记,可为缢蛏遗传改良特征标记筛选及定制培育提供有益参考。     

三角帆蚌HcTyr基因内壳色性状相关SNP筛选及图谱定位

为研究三角帆蚌HcTyr基因与内壳色性状的相关性,本实验根据已分离的三角帆蚌HcTyr基因进行引物设计和片段扩增,并用144只三角帆蚌对其多态性进行筛选和验证,卡方检验分析了SNP位点和三角帆蚌内壳色相关性,并对HcTyr基因进行了图谱定位。结果显示,在HcTyr基因上筛选出8个SNP位点,其中有7个SNP位点与三角帆蚌内壳色L、a及d E呈显著相关性,用这7个SNP位点做单倍型构建和分析,发现Ⅱ、Ⅲ及Ⅳ这3种单倍型在白色群体中出现的频率极显著高于在紫色群体中出现的频率,而Ⅴ和Ⅶ这2两种单倍型在紫色群体中出现的频率极显著高于白色群体。进一步在商业养殖群体中验证发现,Ⅳ和Ⅶ这2种单倍型可分别作为白色和紫色群体的优势单倍型。研究表明,三角帆蚌HcTyr基因可作为内壳色相关的候选基因,其部分SNP位点可用于三角帆蚌分子辅助育种。另外本实验还将HcTyr基因定位在三角帆蚌LG16连锁群上,这为进一步解析该基因调控珍珠颜色形成的分子机制奠定了基础。     

ENU诱变草鱼家系生长特性及肌肉生长抑制素基因SNP筛选的研究

经过175 d养殖,对4个N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变草鱼家系进行生长对比,采用显著性比较,偏相关分析和因子分析统计方法对草鱼体质量、全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚性状进行分析,进而运用双向测序法对MSTN1、MSTN2基因在具有明显差异家系中进行SNP位点筛选。试验结果显示,家系4的生长速度明显大于家系3,家系4的8个性状明显大于其他3个家系;家系1中体长、尾柄长、体厚与体质量密切相关,家系2中体长、头长、体厚与体质量密切相关,家系3中全长、体长、尾柄高与体质量密切相关,家系4中全长、体长、体厚与体质量密切相关。由此可知,家系4和家系3具有明显的生长差异。对于MSTN1基因,家系3在465位点C/G、467位点G/A,家系4在465位点C/G均发生错义突变;对于MSTN2基因,家系3和4在912位点C/T均发生同义突变,家系3在1027位点G/A、家系4在366位点A/G均产生错义突变,位于非编码区1390位点A/T和1401位点G/A在两个家系均发现SNP位点。试验结果表明,MSTN1、MSTN2基因的不同SNP位点与ENU诱变草鱼的生长性状存在紧密联系。