咪唑类物质KK-42对日本沼虾免疫功能的影响

为评估咪唑类物质KK-42对日本沼虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响,将处于蜕皮间期的日本沼虾分别用1.95×10~(-4) mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡1min,测定处理后3、6、12、24h和48h细胞质锰超氧化物歧化酶、线粒体锰超氧化物歧化酶和血蓝蛋白基因的表达以及相应酶活力的变化;KK-42处理12h后,腹部注射嗜水气单胞菌,测定感染后日本沼虾的死亡率。结果显示,KK-42处理后3、6、12h,细胞质锰超氧化物歧化酶、线粒体锰超氧化物歧化酶和血蓝蛋白基因表达明显提高,超氧化物歧化酶活力和血蓝蛋白含量也于6~48h持续升高,在24h达到最高值。KK-42预处理可以降低感染嗜水气单胞菌后日本沼虾的死亡率。试验结果表明,KK-42可诱导日本沼虾免疫相关基因的表达,并能提高日本沼虾的抗菌能力。     

虫草菌粉对罗氏沼虾免疫功能的影响

罗氏沼虾饵料中添加0．5％虫草菌丝，罗氏沼虾血细胞吞噬百分比和吞噬指数、血清溶菌酶活力及酚氧化酶活力均显著提高。经嗜水气单胞菌攻毒后，试验组的免疫保护率也明显提高。试验证明，口服虫草菌粉可显著地提高罗氏沼虾的免疫功能，有效地预防嗜水气单胞菌的感染。     

虫草菌粉对日本沼虾免疫功能的影响

在饵料中添加0.5%的虫草菌粉,以口服形式对日本沼虾进行免疫。日本沼虾血淋巴吞噬活性,血清抗菌、溶菌活力及酚氧化酶活力均显著提高。经嗜水气单胞菌攻毒后,试验组的免疫保护率也明显提高。因此,投喂虫草菌粉,能够明显地增强日本沼虾的免疫抵抗能力。     

KK-42对日本沼虾D3期头胸甲表皮结构的影响

为探讨KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制,实验采用组织学方法观察了幼虾头胸甲表皮结构,定量测定了肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的活力。将体长(3.3±0.5)cm的日本沼虾随机分为两组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液(实验组)或不含KK-42的溶液(对照组)浸泡处理1 min之后,选取处于蜕皮前期D3期的日本沼虾,观察头胸甲表皮结构,测定肝胰腺NAGase活力。结果显示,KK-42处理后第1天,头胸甲外表皮厚度与对照组相比显著增长42.83%;第3天和第9天,内表皮的厚度同比提高70.72%、77.27%,整个头胸甲的厚度同比显著增厚。KK-42处理后第3天,上皮细胞的高度比对照组提高31.69%。KK-42处理后6、12和24 h,NAGase活力分别比相应的对照组升高42.53%、34.28%和18.36%。研究表明,KK-42处理可显著增加D3期日本沼虾头胸甲外骨骼的厚度,提高肝胰腺NAGase活力。     

日本沼虾血清淀粉样蛋白A(SAA)基因的克隆及其免疫功能

为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,M n S A A基因c D N A全长649 b p(G e n B a n k登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日本沼虾感染溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒后12~72 h,其血淋巴和肝胰腺中的MnSAA基因表达量与对照组相比均显著升高;RNAi实验显示,MnSAA基因沉默后,日本沼虾肝胰腺中AP-1和CD36基因分别在其感染嗜水气单胞菌后12~72 h和6~72 h与对照组相比显著下降,日本沼虾累积死亡率在感染嗜水气单胞菌后与对照组相比明显升高。研究表明,MnSAA参与日本沼虾的抗病原体感染的反应,在日本沼虾的免疫防御体系中具有重要的作用。     

嗜水气单胞菌在浸泡感染团头鲂的组织动态分布

利用具有绿色荧光蛋白基因标记的嗜水气单胞菌(WJ-8G FP)对团头鲂(Megalobrama amblycephala)进行浸泡攻毒试验,探究温度对浸泡感染后嗜水气单胞菌在团头鲂各组织分布的影响。实验设立A组(水温25℃),B组(水温32℃),C组(水温25℃),其中C组为对照组。用菌株WJ-8G FP对实验组A、B进行浸泡攻毒,试验组C不进行攻毒处理,攻毒后分别于2 h、4 h、8 h、12 h、24 h采集各组鱼血液、脾、肾、鳃、肠道、肌肉,培养法统计分析各组织器官上的荧光细菌数量。实验结果显示,在各取样时间段实验组A(25℃)和实验组B(32℃)团头鲂各组织在均能检测到荧光嗜水气单胞菌,对照组未检测到嗜水气单胞菌;最高菌量出现在鳃,且鳃上嗜水气单胞菌数量显著大于其他组织(P0.05),其次是脾、肾;组织内的菌量随时间大体呈现先上升后下降的趋势;B实验组中各组织菌量显著大于A实验组(P0.05)。研究结果表明,鳃是嗜水气单胞菌浸泡感染团头鲂的主要组织器官,与25℃相比较,在水温32℃时团头鲂被嗜水气单胞菌感染的风险更高。     

日本沼虾表皮蛋白-5基因全长cDNA克隆及表达分析

为探究甲壳动物表皮蛋白多样性及其功能,根据表皮转录组资料,利用RACE技术扩增得到日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长序列,分析其生物信息学、不同蜕皮时期的表达特征以及KK-42对其表达特征的影响。日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长796bp,开放阅读框477bp,编码158个氨基酸,含RR基序,预测蛋白等电点为4.22,分子量为16.46ku;氨基酸序列比对发现日本沼虾表皮蛋白-5与克氏原螯虾Casp-2相似性最高,为76%,与其他甲壳动物表皮蛋白相似性为41%~53%。实时荧光定量PCR结果显示,日本沼虾表皮蛋白-5基因在3个时期——蜕皮间期、蜕皮前早期和蜕皮前晚期均有表达,其中在脱皮前晚期的相对表达量最高,为蜕皮间期的1400倍,与之有极显著差异(P0.01)。KK-42处理显著上调日本沼虾表皮蛋白-5基因在蜕皮前早期的表达,在处理后3、6h和48h表达量分别是对照组的6.3、4.8和11.4倍。KK-42诱导日本沼虾表皮蛋白-5基因的表达,使峰值前移,这可能是KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制之一。     

日本沼虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因克隆及KK-42对其表达的影响

为进一步探究KK-42缩短蜕皮周期的分子机制,本研究以日本沼虾幼虾为材料,通过RACE技术克隆了几丁质降解途径中的限速酶基因NAGase c DNA全长序列,定量测定了KK-42处理不同时间对头胸甲表皮组织中NAGase m RNA相对表达量和对应酶活力的影响。序列分析结果显示,NAGase c DNA全长2 536 bp,编码617个氨基酸。同源性分析显示,NAGase基因保守性较低,与凡纳滨对虾的相似度最高,仅为68%。系统进化分析显示,日本沼虾、三疣梭子蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾聚为一个大类,凡纳滨对虾和中国明对虾亲缘关系更为接近,日本沼虾单列一个分支。Real-time PCR分析表明,NAGase相对表达量在蜕皮前D_0期达到峰值;KK-42处理后3 h,D_4期的相对表达量是对照组的253%,处理后6 h,C期和D_0期较对照组分别提高了226%和187%。NAGase酶活力从C期到D_4期逐渐提高,KK-42处理能明显提高C和D_0期NAGase酶活力,尤其对C期的影响最为显著,在处理后3、6和12 h分别提高了11.26、5.99、7.15倍。结果提示,KK-42对日本沼虾表皮NAGase的诱导效应可能是其缩短蜕皮周期的分子机制之一。     

KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能机制

为了探索KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能的机制,以水产基地自行繁殖的2月龄幼虾(体长1.2~2.0 cm)为材料,捕捞后暂养于流水养殖水槽,水温(26±1)°C,每天投喂2次,1周后用于实验研究。用1.95×10–4 mol/L的KK-42溶液(处理组)或不含KK-42溶液(对照组)浸润1 min,取出,一部分用于幼虾生长速率、蜕皮周期的测定;从剩余部分中选择处于蜕皮间期(C)和蜕皮前期(D)的幼虾,Real-time PCR分析表皮几丁质酶1基因(Mnchi-1)的转录水平,同时进行表皮几丁质酶的活力测定。在实验观察期间,KK-42处理组平均体质量均显著高于对照组,体质量增长率的升高出现在处理后的前2周。随着幼虾的生长,蜕皮周期的持续时间均趋于延长,在4个连续测定的蜕皮周期中,KK-42处理能明显缩短前2个周期的时程,分别从(8.70±1.07)、(9.81±0.43)d/周期缩短为(6.93±0.97)、(8.11±1.20)d/周期。KK-42处理可显著上调C期表皮Mnchi-1的表达,在第3、6和9 h,其m RNA水平比对照组高10倍以上,酶活性同比提高2倍以上;KK-42对D期的影响相对较弱,该基因的表达水平及酶活性仅在12 h显著升高。结果表明,KK-42能显著诱导D期、尤其是C期表皮Mnchi-1基因的表达,提高几丁质酶活性,推测幼虾对旧表皮的分解提前至C期,这可能是KK-42缩短幼虾的蜕皮周期、促进其生长的分子机制之一。     

复方中草药制剂对罗氏沼虾生长和非特异性免疫功能的影响

在基础饲料中添加0.5%、1.0%和2.0%的复方中草药制剂,连续投喂56 d后,通过测定供试罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)的生长性能、血细胞的吞噬活性、血清酶活性、酚氧化酶活性,比较了复合中草药制剂对罗氏沼虾促生长及非特异性免疫功能的影响。结果显示:饲料中添加0.5%的复方中草药制剂对罗氏沼虾的生长影响显著(P<0.05),添加1%和2%的中草药制剂对罗氏沼虾的血细胞的吞噬活性、溶菌酶活力、酚氧化酶活力影响极显著(P<0.01)。用嗜水气单胞菌攻毒7 d显示试验组免疫保护率高达44.7%~59.8%。因此,从促生长、提高免疫力和经济角度3方面考虑,建议添加剂量为1.0%为宜。     

A3α肽聚糖增强灭活嗜水气单胞菌疫苗免疫效果的研究

为了探讨 A_(3α)肽聚糖对灭活嗜水气单胞菌疫苗免疫效果的影响,用添加肽聚糖的饲料投喂注射接 种经甲醛灭活的嗜水气单胞菌菌苗的彭泽鲫,测定鲫鱼白细胞吞噬活性、血清和体表粘液溶菌酶活性、抗体 效价以及活菌攻毒后的免疫保护率。结果表明,肽聚糖与灭活菌苗联合使用,鱼体表粘液和血清溶菌酶活性、 白细胞吞噬活性、抗体效价以及活菌攻毒后的免疫保护率显著提高,表明 A_(3α)肽聚糖可增强灭活菌苗的免疫效 果。     

鳗鲡病原性嗜水气单胞菌与爱德华氏菌二联表达外膜蛋白的免疫原性

采用鳗鲡源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)外膜蛋白基因二联表达产物免疫日本鳗鲡(Anguilla japonica),检测其对日本鳗鲡免疫功能的影响及其攻毒免疫保护力。将150尾日本鳗鲡平均分为PBS、细菌免疫和外膜蛋白免疫3个组,3组鳗鲡分别以PBS(0.01 mol/L,p H7.4)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌二联灭活苗(5.0×108 CFU/m L)、嗜水气单胞菌与迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物(500μg/m L)腹腔注射0.2 m L。于免疫后14、21和28 d麻醉鳗鲡采血并分离抗凝血。测定3个时间点鳗鲡血浆中特异性抗体效价和同时期鳗鲡血浆、体表黏液、肝和肾组织匀浆液中的溶菌酶含量,同时检测3个时间点鳗鲡全血细胞的转化水平。免疫后28 d,嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌分别腹腔注射感染3组鳗鲡并测定其相对免疫保护率。结果表明,免疫后14 d和28 d,灭活菌和外膜蛋白免疫组的抗体水平均极显著高于PBS组(P0.01)。溶菌酶检测结果表明,不同处理组不同时间段血清、黏液和肝肾组织悬液的溶菌酶含量存在显著(P0.05)或极显著(P0.01)差异。免疫后14 d灭活菌组全血细胞转化水平显著高于PBS和外膜蛋白组(P0.05),而21 d两个免疫组则均显著低于PBS组(P0.05)。活菌感染结果表明,灭活菌和外膜蛋白免疫后28 d对两株病原菌的攻毒相对免疫保护率均比PBS组提高了50%(P0.05)。本研究结果表明鳗鲡源嗜水气单胞菌和迟缓爱德华氏菌外膜蛋白二联表达产物免疫日本鳗鲡后可提高鳗鲡的免疫功能及其对这两株菌的抵抗力,从而可能应用于鳗鲡基因工程疫苗的研发。     

KK-42对蜕皮后期日本沼虾头胸甲超微结构的影响

为了深入探究KK-42对表皮结构的影响,本实验以外表皮形成趋于结束而内表皮开始出现的蜕皮后期幼虾为材料,通过扫描电镜观察石蜡切片法,分析了KK-42处理前后头胸甲外表皮,尤其是内表皮结构的变化。将处于蜕皮间期的健康幼虾[体长(3.5±0.1)cm]随机分为2组,分别用1.95×10^-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液处理,取蜕皮后1.5、3.0、6.0及12.0 h幼虾头胸甲,观察其超微结构。另取蜕皮后6.0 h头胸甲,用解剖刀轻轻刮去内面组织,通过扫描电镜观察内表皮的表面结构。结果显示,蜕皮后1.5和3.0 h,头胸甲只包含上表皮和外表皮,KK-42处理组外表皮的板层数量显著增加,外表皮厚度分别比相应对照组提高了72.07%和38.67%;蜕皮后6.0~12.0 h,外表皮中疏松的板层趋于致密,其厚度在二组间无统计学差异。蜕皮后6.0 h,只有1层板层的内表皮出现,到蜕皮后12.0 h,板层数增至2层(对照组)和3层(处理组),且板层结构均疏松。此外,内表皮表面分布着大小不等、头尾走向的梭形孔道(pore canals);KK-42处理组内表皮结构未见明显变化。实验表明,KK-42对蜕皮后期日本沼虾幼虾头胸甲的超微结构有显著影响,能加快外表皮及内表皮板层的形成速率。     

左旋咪唑对罗氏沼虾免疫功能及抗病力的影响

以0(对照)、50、100和150 mg/kg饲料的剂量将左旋咪唑(LMS)添加于基础饲料中制成颗粒饲料投喂罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)14 d,采样测定了罗氏沼虾血细胞吞噬活性、血清酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LSZ)及超氧化物岐化酶(SOD)活性,并以6×105cells/mL浓度的致病性嗜水气单胞菌(Aerom onas hydrophila)对罗氏沼虾进行肌肉注射(20μL/尾),记录接种7 d后罗氏沼虾的累积死亡率。结果表明,3个LMS处理组的罗氏沼虾血细胞吞噬百分比和吞噬指数、血清PO、LSZ及SOD活性均显著地高于对照组(P<0.05);LMS处理组的罗氏沼虾对嗜水气单胞菌的抵抗力明显增强。因此,饲喂适量的LMS能促进罗氏沼虾的免疫力和抗病力;在本试验条件下,100 mg/kg饲料的剂量为最适添加剂量。     

复方中草药对青虾免疫功能的影响

将大黄、黄芩、党参、板蓝根等十余味中草药粉碎过筛后制成复方添加剂按1%、2%、3%的比例添加于基础饲料中制成颗粒药饵投喂青虾,测定青虾相关免疫指标的变化。结果表明,青虾血细胞吞噬百分比和吞噬指数、血清溶菌酶活力均显著提高。经嗜水气单胞菌攻毒后,各试验组的免疫保护率也明显提高。在各试验组中以2%的添加量的效果最好。试验证明,该添加剂可显著地提高青虾的免疫功能,能有效地预防嗜水气单胞菌的感染。     

日本鳗鲡败血腹水病病原研究

2000年3月中旬，自福建仙游某日本鳗鲡（Anguilla japonica)养殖场患败血腹水症的发病日本鳗鲡的肝脏及腹水处分离到四株细菌，经鉴定其中一株为迟钝爱德华氏菌（dwardsiella tarda)，一株温和气单胞菌（Aeromomas sobria)和两株嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)溶血试验，小鼠攻毒试验显示，上述四株细菌都有较强制 毒力，综合分析，上述菌株可能是引发这次日本幼鳗败血腹水病之病原菌。     

日本沼虾cytMnSOD和mtMnSOD基因全长cDNA克隆及表达

利用RACE技术从日本沼虾肝胰腺中克隆了cytMnSOD和mtMnSOD基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1 233 bp,开放阅读框为858 bp,编码286个氨基酸,N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1 113 bp,开放阅读框为654 bp,编码218个氨基酸,N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽;cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为31.33、24.05 ku和5.62、7.12。日本沼虾cytMnSOD推导的氨基酸序列与其mtMnSOD的相似性为40%,二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-time PCR结果表明,cytMnSOD和mtMnSOD在日本沼虾肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达,其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高,蜕皮后期和蜕皮前期较低。嗜水气单胞菌刺激后3 h,肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD的表达量显著增加,推测MnSOD是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。     

罗氏沼虾胞质锰超氧化物歧化酶的功能

为了解超氧化物歧化酶 (SOD)分子生物学特性和免疫功能，实验克隆了罗氏沼虾胞质锰SOD基因 (MrcMnSOD)，制备多克隆抗体，并分析在嗜水气单胞菌感染下该基因的表达模式。结果显示，嗜水气单胞菌感染可显著诱导MrcMnSOD在转录水平和蛋白质水平进行高表达。为探究MrcMnSOD参与免疫应答的机制，进一步的抑菌实验表明，该蛋白质可显著抑制3种革兰氏阴性细菌 (大肠杆菌、副溶血性弧菌、嗜水气单胞菌)和2种革兰氏阳性细菌 (无乳链球菌、金黄色葡萄球菌)的生长，且抑制作用与蛋白质浓度的关系不显著。研究表明，MrcMnSOD可能作为一种免疫相关分子参与免疫应答反应。本研究初步探讨了MrcMnSOD的免疫生物学功能，旨在为深入研究罗氏沼虾SOD的功能奠定相关基础。     

嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫力和抗病力的影响

为研究嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)灭活疫苗对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)(250 g±12 g)免疫力和抗病力的影响,给试验鱼腹腔注射0.2 mL的灭活嗜水气单胞菌悬液(1.0×108cfu/mL)。分别在注射前(0 d)和注射后7、14、21、28、35、42 d取样,测定血液白细胞吞噬活性、血清溶菌酶(LZM)活力、补体C3含量以及头肾和脾脏中IgM、IgT基因表达情况。结果表明:注射嗜水气单胞菌疫苗能显著提高白细胞吞噬率(PP)和吞噬指数(PI)、LZM活力和补体C3含量,注射后21 d达峰值,PI、LZM和补体C3在42 d仍显著高于对照组。免疫后21 d头肾和脾脏中IgM基因上调表达,35 d达峰值(分别上升24倍和26倍),42 d下降但仍极显著高于对照组。头肾和脾脏中IgT的上调表达比IgM弱得多,头肾35 d达峰值(上升6.2倍),脾脏28 d达峰值(上升6.1倍)。免疫42 d后嗜水气单胞菌攻毒结果表明,嗜水气单胞菌灭活疫苗对虹鳟有较高的免疫保护作用,免疫保护率达到71.43%。     

嗜水气单胞菌对框镜鲤免疫实验研究

嗜水气单胞菌是水产动物的常见致病菌,本研究利用在生理生化和PCR鉴定的基础上确定为嗜水气单胞菌,并经PCR和药物敏感性实验确定对多种抗菌药物具有耐药性的嗜水气单胞菌多重耐药株。用该菌株制备细菌疫苗对框镜鲤进行免疫实验,免疫方法采用浸洗2 min,1.5、3、6个月后分别进行注射攻毒,攻毒实验结果显示免疫保护率60%~95%,实验室安全性检测结果为安全可靠。该方法避免了逐尾鱼注射造成的较大的工作强度,为在生产实践中广泛应用预防多重耐药嗜水气单胞菌所引起的疾病奠定了基础。