虫草菌粉对罗氏沼虾免疫功能的影响

罗氏沼虾饵料中添加0．5％虫草菌丝，罗氏沼虾血细胞吞噬百分比和吞噬指数、血清溶菌酶活力及酚氧化酶活力均显著提高。经嗜水气单胞菌攻毒后，试验组的免疫保护率也明显提高。试验证明，口服虫草菌粉可显著地提高罗氏沼虾的免疫功能，有效地预防嗜水气单胞菌的感染。     

日本沼虾血清淀粉样蛋白A(SAA)基因的克隆及其免疫功能

为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,M n S A A基因c D N A全长649 b p(G e n B a n k登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日本沼虾感染溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒后12~72 h,其血淋巴和肝胰腺中的MnSAA基因表达量与对照组相比均显著升高;RNAi实验显示,MnSAA基因沉默后,日本沼虾肝胰腺中AP-1和CD36基因分别在其感染嗜水气单胞菌后12~72 h和6~72 h与对照组相比显著下降,日本沼虾累积死亡率在感染嗜水气单胞菌后与对照组相比明显升高。研究表明,MnSAA参与日本沼虾的抗病原体感染的反应,在日本沼虾的免疫防御体系中具有重要的作用。     

罗氏沼虾GLUT1基因克隆及其在血糖稳态调节中的功能

为了探究葡萄糖转运蛋白 1 (glucose transporter type 1, GLUT1)在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)糖代谢调控中的作用, 本研究采用 cDNA 末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends, RACE)克隆获得罗氏沼虾 Mr-GLUT1 基因全长 cDNA 序列, 该基因全长 1929 bp, 开放阅读框(open reading frame, ORF) 1446 bp, 编码 481 个氨基酸, 分子量为 52035.73, 等电点为 6.76。多序列比对及系统进化树分析结果显示, 十足目 GLUT1 基因具有较高同源性, 均存在 12 个跨膜结构域, 罗氏沼虾 GLUT1 与对虾首先聚为一支, 表明亲缘关系最近。实时荧光定量 PCR 结果显示, Mr-GLUT1 在罗氏沼虾各组织均有表达, 肠道表达量最高。葡萄糖注射后, 罗氏沼虾血淋巴葡萄糖水平、肝糖原和肌糖原含量迅速升高, 肠道、肝胰腺和肌肉组织 Mr-GLUT1 基因表达显著上调, 但 Mr-GLUT1 基因表达变化时间延迟于葡萄糖含量的变化。RNA 干扰沉默罗氏沼虾体内 Mr-GLUT1 基因表达后, 血淋巴中葡萄糖和海藻糖含量显著上升。研究表明, Mr-GLUT1 基因可能参与罗氏沼虾血糖稳态调节, 在葡萄糖和海藻糖转运过程中发挥重要作用。     

咪唑类物质KK-42对日本沼虾α2-巨球蛋白基因表达的影响

为探讨KK-42提高感染嗜水气单孢菌的日本沼虾幼虾成活率的机制,实验首次克隆了α2M部分序列,研究了α2M基因的时空表达以及KK-42对其表达和活力的影响。将体长3.5~5.0 cm的日本沼虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,12 h后,每组再分为2个亚组,分别向虾腹部注射嗜水气单胞菌菌悬液(菌攻毒实验组和菌攻毒对照组)或生理盐水(实验组-1和对照组-1),于不同时间点测定幼虾的成活率、α2M基因表达水平和活力的变化。结果显示,KK-42预处理可显著提高感染嗜水气单胞菌的日本沼虾幼虾成活率。经BLAST比对,克隆的α2M部分mRNA序列与罗氏沼虾α2M具有90%以上同源性。实时荧光定量PCR实验显示,α2M基因表达水平在血细胞中最高,且以蜕皮前期最为显著。KK-42处理的幼虾血细胞α2M基因的表达无显著性差异;嗜水气单胞菌刺激使血细胞α2M mRNA水平在3 h比0 h提高了580%,其活力在24 h增幅为47.5%;而菌攻毒实验组mRNA水平在6~48 h明显高于菌攻毒对照组,尤其在12 h,增幅为511%,其活力水平也呈同样的变化趋势。研究表明,KK-42预处理能上调感染嗜水气单胞菌的幼虾血细胞α2M基因的转录水平,诱导α2M活力增强,这可能增强了幼虾的免疫水平,从而提高成活率。     

江苏高邮罗氏沼虾池塘养殖可培养微生物组成调查

为了探明罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)池塘养殖环境中重要微生物的组成, 以提升健康养殖管理技术, 分别于 2019 年 7 月、8 月和 10 月, 在江苏高邮市罗氏沼虾主养区开展了罗氏沼虾池塘养殖系统可培养环境微生物的组成调查。采用 LB 培养基分离纯化了罗氏沼虾肝胰腺、肠道、鳃及养殖水体中可培养的细菌, 利用细菌 16S rRNA 基因分子鉴定技术对分离菌株进行初步鉴定; 采用高通量测序技术分析了“铁壳”虾(养殖期生长缓慢)及铜绿微囊藻暴发池塘水环境微生物群落组成。以达卡气单胞菌(Aeromonas dhakensis)为受试病原菌, 分析了池塘养殖系统中潜在病原拮抗菌的种类及效果。3 次调查共分离可培养细菌 605 株, 成功鉴定 601 株, 分别属于 37 个属 119 种, 其中罗氏沼虾体内分离到菌株 23 属 76 种, 养殖水体中分离到 28 属 81 种。确定了池塘养殖系统中存在气单胞菌(Aeromonas spp.)、肠杆菌(Enterobacter spp.)、乳球菌(Lactococcus spp.)、弧菌(Vibrio spp.)等属的潜在病原菌。发生“铁壳”虾症的虾池优势环境微生物种类组成及占比与健康虾池相近, 但微小杆菌属(Exiguobacterium)与不动杆菌属(Acinetobacter)细菌占比高于健康虾池。铜绿微囊藻暴发影响环境微生物的组成结构, 嗜水气单胞菌属细菌占比增大。从池塘养殖系统筛选到甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、贝莱斯芽孢杆菌 (B. velezensis)、解淀粉芽孢杆菌(B. amyloliquefaciens)等潜在益生菌对气单胞菌具有较强拮抗作用。调查结果可为掌握罗氏沼虾池塘养殖系统细菌性病原组成及建立防控技术提供理论依据。     

左旋咪唑对罗氏沼虾免疫功能及抗病力的影响

以0(对照)、50、100和150 mg/kg饲料的剂量将左旋咪唑(LMS)添加于基础饲料中制成颗粒饲料投喂罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)14 d,采样测定了罗氏沼虾血细胞吞噬活性、血清酚氧化酶(PO)、溶菌酶(LSZ)及超氧化物岐化酶(SOD)活性,并以6×105cells/mL浓度的致病性嗜水气单胞菌(Aerom onas hydrophila)对罗氏沼虾进行肌肉注射(20μL/尾),记录接种7 d后罗氏沼虾的累积死亡率。结果表明,3个LMS处理组的罗氏沼虾血细胞吞噬百分比和吞噬指数、血清PO、LSZ及SOD活性均显著地高于对照组(P<0.05);LMS处理组的罗氏沼虾对嗜水气单胞菌的抵抗力明显增强。因此,饲喂适量的LMS能促进罗氏沼虾的免疫力和抗病力;在本试验条件下,100 mg/kg饲料的剂量为最适添加剂量。     

Akt在中华绒螯蟹免疫中的功能

Akt作为PI3K-AKT 信号通路的核心分子,在细胞增殖、代谢、发育和存活等过程中发挥重要作用。本研究采用特异性引物及PCR技术,克隆获得了中华绒螯蟹Akt基因 (EsAkt)并进行生物信息学分析,实时定量PCR技术检测了EsAkt在中华绒螯蟹不同组织和不同免疫刺激后的表达水平,免疫荧光技术检测了EsAkt蛋白的细胞定位,双链RNA干扰技术分析了EsAkt干扰后凋亡基因的变化。结果显示,EsAkt分子包含PH结构域、中心催化结构域 (S_TKc)和羧基端疏水结构域 (S_TK_X) 3个保守的结构域。EsAkt在所有被检测的组织中呈现组成型表达,且在免疫相关组织 (如肝胰腺、鳃和血淋巴细胞)中的表达量显着高于胃和肠道。EsAkt蛋白主要以弥散状的形式分布在细胞质中。中华绒螯蟹注射脂多糖 (LPS)和嗜水气单胞菌后,显著诱导EsAkt转录本的表达,LPS免疫刺激12 h后,EsAkt响应达到峰值,为对照组的4.35倍,刺激48 h后,EsAkt的mRNA表达水平有所降低,但仍是对照组2.62倍。嗜水气单胞菌免疫刺激6 h后,EsAkt响应达到峰值,为对照组的9.05倍,刺激48 h后,EsAkt的mRNA表达量回落到正常水平。双链RNA干扰EsAkt后,EsAkt的mRNA表达量为对照组的0.38倍,而凋亡相关基因EsCaspase-3-like表达水平显著上调,为对照组的2.69倍。研究表明,EsAkt基因在中华绒螯蟹免疫中发挥重要作用,参与了机体对细菌引起的免疫应激过程。本研究丰富了中华绒螯蟹PI3K-AKT信号通路研究的基本资料,为进一步研究甲壳动物免疫防御机制奠定了基础。     

秀丽白虾4种C型凝集素基因的克隆、组织表达与进化分析

C型凝集素是一类Ca² 依赖活性的糖蛋白,在虾蟹类的免疫防御中发挥着重要作用。采用RT-PCR及RACE技术首次克隆了秀丽白虾C型凝集素家族4个基因( EmCTL-1、EmCTL-2、EmCTL-3、EmCTL-4)的cDNA全长。这4个C型凝集素基因的cDNA全长分别为1 390、1 119、1 364和1 299 bp,分别含996、969、 1 026和1 044 bp的开放阅读框,各编码332、322、341和347个氨基酸的蛋白。其氨基酸序列与罗氏沼虾相应的C型凝集素的相似性分别为40%、37%、69%和73%, 与其他海水虾类的相似性在30%～41%之间。阳性选择模型分析显示虾类的C型凝集素基因在进化过程中经历了阳性选择。进化树分析表明,秀丽白虾的 C型凝集素基因与罗氏沼虾的亲缘关系最近,并且除EmCTL-4属于十足类C型凝集素亚群A外,其他均属于亚群C。组织表达分析表明,EmCTL-1主要在血液中表 达,EmCTL-2主要在性腺、血液和胸神经节中表达,而EmCTL-3和EmCTL-4则主要在精巢中表达。研究表明,秀丽白虾的C型凝集素基因具有较快的 进化特点,同时又具备凝集素行使免疫功能时必需的保守氨基酸残基及钙离子结合位点,精巢和血液是秀丽白虾C型凝集素基因主要的表达器官。     

咪唑类物质KK-42对日本沼虾免疫功能的影响

为评估咪唑类物质KK-42对日本沼虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响,将处于蜕皮间期的日本沼虾分别用1.95×10~(-4) mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡1min,测定处理后3、6、12、24h和48h细胞质锰超氧化物歧化酶、线粒体锰超氧化物歧化酶和血蓝蛋白基因的表达以及相应酶活力的变化;KK-42处理12h后,腹部注射嗜水气单胞菌,测定感染后日本沼虾的死亡率。结果显示,KK-42处理后3、6、12h,细胞质锰超氧化物歧化酶、线粒体锰超氧化物歧化酶和血蓝蛋白基因表达明显提高,超氧化物歧化酶活力和血蓝蛋白含量也于6~48h持续升高,在24h达到最高值。KK-42预处理可以降低感染嗜水气单胞菌后日本沼虾的死亡率。试验结果表明,KK-42可诱导日本沼虾免疫相关基因的表达,并能提高日本沼虾的抗菌能力。     

草鱼miR-462通过靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1调控嗜水气单胞菌感染诱导的免疫应答

为探究miR-462在嗜水气单胞菌感染草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kideny,CIK)后的调控机制,实验利用荧光定量技术检测了CIK细胞感染嗜水气单胞菌后miR-462表达水平的变化;运用RNAhybrid软件预测miR-462的靶基因,利用双荧光素酶报告基因系统进行确定;此外还分析了miR-462对靶基因下游基因的调控作用。结果显示,在CIK细胞感染嗜水气单胞菌的过程中,miR-462的表达发生显著变化;cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达先降低后升高,与miR-462的表达模式呈负相关。双荧光素酶报告系统显示,miR-462可靶向cx32.2、slc9a3.1和tbk1的3′非编码区抑制其表达,过表达miR-462可以显著抑制cx32.2、slc9a3.1和tbk1的表达。转染miR-462模拟物后,下游slc4a4a、tnfrsf5、cxcl9和cxcl11基因的表达受到抑制。研究表明,miR-462参与调控嗜水气单胞菌感染后草鱼CIK细胞中的免疫应答。cx32.2、slc9a3.1和tbk1被鉴定为miR-462的靶基因。miR-462可通过靶向slc9a3.1和tbk1影响下游基因的功能。     

草鱼miR-23a在嗜水气单胞菌感染过程中的调控机制

为探索嗜水气单胞菌感染后草鱼肾脏细胞(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)中miR-23a的调控机制,实验通过实时荧光定量PCR(qPCR)测定了嗜水气单胞菌感染CIK细胞后miR-23a的表达量变化,使用RNAhybrid软件预测miR-23a的靶基因并用双萤光素酶报告基因检测系统进...     

Immune responses of whiteleg shrimp,Litopenaeus vannamei (Boone, 1931), to bacterially expressed dsRNA specific to VP28 gene of white spot syndrome virus

In this study, dsRNA specific to VP28 gene of white spot syndrome virus (WSSV) of shrimp was synthesized in Escherichia coli in large scale and studied the immune response of shrimp to dsRNA‐VP28. The haematological parameters such as clotting time and total haemocytes counts, and immunological parameters such as prophenoloxidase (proPO), superoxide dismutase (SOD), superoxide anion (SOA) and malondialdehyde content, as well as the mRNA expression of ten immune‐related genes were examined to estimate the effect of dsRNA‐VP28 on the innate immunity of Litopenaeus vannamei. The activities of proPO, SOA and SOD significantly increased in haemocyte after dsRNA‐VP28 treatment, whereas MDA content did not change significantly. Among the ten immune‐related genes examined, only the mRNA expression of proPO, cMnSOD, haemocyanin, crustin, BGBP, lipopolysaccharides (LPs), lectin and lysozyme in haemocytes, gill and hepatopancreas of L. vannamei, was significantly upregulated at 12 h after dsRNA‐VP28 treatment, while no significant expression changes were observed in Toll receptor and tumour receptor genes. The increase of proPO and SOD activities, and SOA level and mRNA expression level of proPO, cMnSOD, haemocyanin, crustin, BGBP, LPs, lectin and lysozyme after dsRNA‐VP28 stimulation indicate that these immune‐related genes were involved in dsRNA‐VP28‐induced innate immunity in shrimp.     

Immunomodulatory effect of recombinant RNA‐dependent RNA polymerase protein of Macrobrachium rosenbergii nodavirus in giant freshwater prawn M. rosenbergii

The present study evaluated the role of recombinant RNA‐dependent RNA polymerase (RdRp) protein of Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) in modulating the immune response and in reducing MrNV load in infected prawn. In the first experiment, prawns (25–30 g) were injected with recombinant RdRp protein (RP) at a concentration of 0, 1.0 and 10 μg, and immune parameters and expression of some immune‐related genes were measured up to 14 days post injection (p.i.). In the second experiment, early juveniles were injected with a similar dose of RdRp and animals were challenged by immersion with MrNV. The infection status was detected in muscles by nested RT‐PCR up to 21 days post challenge. Prawn injected with higher concentration of RP showed significantly higher total haemocyte count at different period post injection. Significant up‐regulation of immune‐related genes was observed within 24 h in prawn treated with lower dose of RP and after 7 days p.i. at higher level of RP injection compared with adult control. Most of the tested samples (63%) were found to be RT‐PCR positive for MrNV at 48 h of post‐immersion challenge. After 14 days, MrNV was detected only in control prawn, while both RP‐injected groups were MrNV negative. This study elucidated the potential viral load reduction role played by RdRP in MrNV‐infected prawn.     

Molecular isolation and characterization of a haemocyanin of Macrobrachium rosenbergii reveal its antibacterial activities

Haemocyanin is a multi‐subunit protein complex found in the haemolymph and is involved in the immune system of crustaceans. In this study, a haemocyanin gene of Macrobrachium rosenbergii, designated MrHc, was successfully isolated. The MrHc gene contained an open reading frame (ORF) of 1,992 nucleotides, encoding a protein of 663 amino acid residues with a molecular mass of 76.5 kDa. The deduced amino acid sequence contained distinct structural motifs of the haemocyanin superfamily, including an all‐alpha domain, a copper‐containing domain and an immunoglobulin‐like domain. Based on the phylogenetic analysis, the MrHC protein demonstrated a close relationship with the haemocyanins of Palaemon carinicauda and Macrobrachium nipponense. The MrHc gene was expressed in various shrimp tissues, including the hepatopancreas, gill, haemocytes, stomach and muscle. After Macrobrachium rosenbergii nodavirus (MrNV) challenge tests, the MrHc gene was up‐regulated 237‐fold at day 2. A recombinant protein of the MrHc immunoglobulin‐like domain exhibited antibacterial activity against Vibrio vulnificus, V. parahaemolyticus, Aeromonas caviae, A. veronii, A. hydrophila and Bacillus cereus. This study suggested that MrHc may play important roles in the shrimp innate immune response to MrNV infection and bacterial infection.     

罗氏沼虾细胞色素P450家族CYP302a1基因克隆及其在蜕皮周期中的表达

蜕皮是甲壳动物重要的生理活动,与其蜕皮激素的合成密切相关,细胞色素P450(CYP)302a1是甲壳动物蜕皮激素合成通路中的关键酶之一。本研究克隆了罗氏沼虾CYP302a1基因(Mr-CYP302a1),cDNA全长1859 bp,开放阅读框(ORF)为1629 bp,编码543个氨基酸(aa),分子量大小为61.09 ku,等电点为8.42。氨基酸序列分析显示CYP302a1基因的保守结构域含有5个P450基因家族特征保守区域:heme-binding、helix-K、helixC、helix-I及PERF。系统进化分析结果显示Mr-CYP302a1首先与绿虾CYP302a1聚为一支,然后与凡纳滨对虾及三疣梭子蟹等十足目甲壳动物的CYP302a1聚为一支,与甲壳动物的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测表明Mr-CYP302a1在罗氏沼虾的多个组织中均有表达,其中在Y器官中的表达量最高,性腺中次之。同时研究发现,MrCYP302a1基因在罗氏沼虾的蜕皮后期(A期和B期)表达量很低,蜕皮间期(C期)表达量开始上升,在蜕皮前期D1亚期达到峰值。对Mr-CYP302a1进行蛋白表达及多克隆抗体制备,蛋白印迹法(Western blot,WB)检测表明Mr-CYP302a1蛋白在罗氏沼虾Y器官中的表达量最高,在蜕皮过程中的蜕皮前期D1亚期达到峰值。综上所述,该基因在罗氏沼虾的蜕皮过程中扮演着十分重要的角色。     

团头鲂NK-lysin基因鉴定和表达分析

为研究抗菌肽NK-LYSIN在团头鲂免疫系统中的可能功能,本实验从团头鲂转录组中钓取到2个NK-lysin基因(nkla和nklb),通过PCR扩增并测序验证其ORF序列。通过荧光定量PCR检测其在健康组织和嗜水气单胞菌感染后免疫组织中的表达,并构建其原核表达体系。结果显示,团头鲂nkla和nklb分别编码122和136个氨基酸,NKLA和NKLB均属于鞘脂激活蛋白样蛋白家族成员,各含有6个高度保守的半胱氨酸及1个Sap B结构域。在健康团头鲂各组织中,nkla在脾脏中表达量极高,在肌肉和血液中表达量极低;而nklb则在肠中表达量较高,在头肾中表达量较低,在其他组织均有表达。nkla和nklb不同的表达模式暗示它们可能存在功能上的分化。经嗜水气单胞菌感染后,团头鲂nkla与nklb表达变化模式相似,头肾中,表达量在4 h时显著下降;肝脏中,表达量在4 h达到最高,而后回落到正常水平;在脾脏和肠中4 h时开始下降,72 h时达到峰值,暗示NK-lysin可能在团头鲂抗嗜水气单胞菌感染过程中发挥重要作用。另外,本实验对nkla和nklb进行了原核表达,为进一步研究NK-lysin的功能奠定了基础。