日本沼虾蜕皮过程中头胸甲外骨骼超微结构的改变

采用HE染色及石蜡切片的扫描电镜观察方法,描述了日本沼虾(Macrobrachium nipponense)蜕皮间期(C期,intermolt stage)及新旧表皮更替变化剧烈的蜕皮前晚期(D4期,late premolt stage)和蜕皮后期(postmolt stage)A-B期头胸甲外骨骼的形态结构变化特点。结果显示,日本沼虾外骨骼分为上表皮、外表皮、内表皮三层,D4期出现新的上表皮和外表皮,B期出现新内表皮,外表皮强嗜碱性而内表皮弱嗜酸性。扫描电镜观察发现,C期头胸甲内、外表皮均为几丁质-蛋白质纤维构成的平行板层结构且板层内有发达的孔道系统(pore canals,pc),但内外表皮板层间排列紧密程度不同,外表皮板层切面边缘较整齐,结构致密,板层内pc大小均一、近似圆形,内表皮板层切面边缘粗糙,结构较疏松,板层内pc大小不等、多为梭形。在蜕皮前后,新外表皮结构变化显著,与C期相比,D4期新外表皮超微结构与旧内表皮结构相似,而在A期,外表皮超微结构由疏松变为致密,这可能与蜕皮后表皮的钙化相关。本研究旨为阐明沼虾的蜕皮机制提供基础资料。     

KK-42对日本沼虾D3期头胸甲表皮结构的影响

为探讨KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制,实验采用组织学方法观察了幼虾头胸甲表皮结构,定量测定了肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的活力。将体长(3.3±0.5)cm的日本沼虾随机分为两组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液(实验组)或不含KK-42的溶液(对照组)浸泡处理1 min之后,选取处于蜕皮前期D3期的日本沼虾,观察头胸甲表皮结构,测定肝胰腺NAGase活力。结果显示,KK-42处理后第1天,头胸甲外表皮厚度与对照组相比显著增长42.83%;第3天和第9天,内表皮的厚度同比提高70.72%、77.27%,整个头胸甲的厚度同比显著增厚。KK-42处理后第3天,上皮细胞的高度比对照组提高31.69%。KK-42处理后6、12和24 h,NAGase活力分别比相应的对照组升高42.53%、34.28%和18.36%。研究表明,KK-42处理可显著增加D3期日本沼虾头胸甲外骨骼的厚度,提高肝胰腺NAGase活力。     

KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能机制

为了探索KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能的机制,以水产基地自行繁殖的2月龄幼虾(体长1.2~2.0 cm)为材料,捕捞后暂养于流水养殖水槽,水温(26±1)°C,每天投喂2次,1周后用于实验研究。用1.95×10–4 mol/L的KK-42溶液(处理组)或不含KK-42溶液(对照组)浸润1 min,取出,一部分用于幼虾生长速率、蜕皮周期的测定;从剩余部分中选择处于蜕皮间期(C)和蜕皮前期(D)的幼虾,Real-time PCR分析表皮几丁质酶1基因(Mnchi-1)的转录水平,同时进行表皮几丁质酶的活力测定。在实验观察期间,KK-42处理组平均体质量均显著高于对照组,体质量增长率的升高出现在处理后的前2周。随着幼虾的生长,蜕皮周期的持续时间均趋于延长,在4个连续测定的蜕皮周期中,KK-42处理能明显缩短前2个周期的时程,分别从(8.70±1.07)、(9.81±0.43)d/周期缩短为(6.93±0.97)、(8.11±1.20)d/周期。KK-42处理可显著上调C期表皮Mnchi-1的表达,在第3、6和9 h,其m RNA水平比对照组高10倍以上,酶活性同比提高2倍以上;KK-42对D期的影响相对较弱,该基因的表达水平及酶活性仅在12 h显著升高。结果表明,KK-42能显著诱导D期、尤其是C期表皮Mnchi-1基因的表达,提高几丁质酶活性,推测幼虾对旧表皮的分解提前至C期,这可能是KK-42缩短幼虾的蜕皮周期、促进其生长的分子机制之一。     

日本沼虾表皮蛋白-5基因全长cDNA克隆及表达分析

为探究甲壳动物表皮蛋白多样性及其功能,根据表皮转录组资料,利用RACE技术扩增得到日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长序列,分析其生物信息学、不同蜕皮时期的表达特征以及KK-42对其表达特征的影响。日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长796bp,开放阅读框477bp,编码158个氨基酸,含RR基序,预测蛋白等电点为4.22,分子量为16.46ku;氨基酸序列比对发现日本沼虾表皮蛋白-5与克氏原螯虾Casp-2相似性最高,为76%,与其他甲壳动物表皮蛋白相似性为41%~53%。实时荧光定量PCR结果显示,日本沼虾表皮蛋白-5基因在3个时期——蜕皮间期、蜕皮前早期和蜕皮前晚期均有表达,其中在脱皮前晚期的相对表达量最高,为蜕皮间期的1400倍,与之有极显著差异(P0.01)。KK-42处理显著上调日本沼虾表皮蛋白-5基因在蜕皮前早期的表达,在处理后3、6h和48h表达量分别是对照组的6.3、4.8和11.4倍。KK-42诱导日本沼虾表皮蛋白-5基因的表达,使峰值前移,这可能是KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制之一。     

日本沼虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因克隆及KK-42对其表达的影响

为进一步探究KK-42缩短蜕皮周期的分子机制,本研究以日本沼虾幼虾为材料,通过RACE技术克隆了几丁质降解途径中的限速酶基因NAGase c DNA全长序列,定量测定了KK-42处理不同时间对头胸甲表皮组织中NAGase m RNA相对表达量和对应酶活力的影响。序列分析结果显示,NAGase c DNA全长2 536 bp,编码617个氨基酸。同源性分析显示,NAGase基因保守性较低,与凡纳滨对虾的相似度最高,仅为68%。系统进化分析显示,日本沼虾、三疣梭子蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾聚为一个大类,凡纳滨对虾和中国明对虾亲缘关系更为接近,日本沼虾单列一个分支。Real-time PCR分析表明,NAGase相对表达量在蜕皮前D_0期达到峰值;KK-42处理后3 h,D_4期的相对表达量是对照组的253%,处理后6 h,C期和D_0期较对照组分别提高了226%和187%。NAGase酶活力从C期到D_4期逐渐提高,KK-42处理能明显提高C和D_0期NAGase酶活力,尤其对C期的影响最为显著,在处理后3、6和12 h分别提高了11.26、5.99、7.15倍。结果提示,KK-42对日本沼虾表皮NAGase的诱导效应可能是其缩短蜕皮周期的分子机制之一。     

KK-42对日本沼虾表皮蛋白基因MnCP-1表达的上调效应

为探讨KK-42显著缩短日本沼虾(Macrobrachium nipponense)蜕皮周期的可能机制,本研究采用RACE技术首次从头胸甲中获得了一个含几丁质结合-4(chitin_bind_4)结构域的表皮蛋白(cuticle proteins,CPs)c DNA基因全长,命名为Mn CP-1。该序列全长604 bp,可编码122个氨基酸。氨基酸序列比对显示,Mn CP-1与普通黄道蟹(Cancer pagurus,P81576.1)相似性最高(61%)。系统进化分析发现,Mn CP-1与地中海实蝇(Ceratitis capitata)聚类为一支。Real-time PCR结果显示,头胸甲中Mn CP-1在蜕皮前期晚期(D3-4期)和蜕皮后期(A期)的表达量较高,而在蜕皮间期(C期)和蜕皮前期早期(D0-2期)的表达量较低。KK-42处理能显著上调C期和D0-2期Mn CP-1的表达,在处理后6、24和48 h,其mRNA表达水平较对照组高3倍以上。结果表明,头胸甲上皮细胞Mn CP-1的表达与蜕皮周期有关,KK-42可显著上调C期和D0-2期Mn CP-1的表达。     

咪唑类物质KK-42对日本沼虾α2-巨球蛋白基因表达的影响

为探讨KK-42提高感染嗜水气单孢菌的日本沼虾幼虾成活率的机制,实验首次克隆了α2M部分序列,研究了α2M基因的时空表达以及KK-42对其表达和活力的影响。将体长3.5~5.0 cm的日本沼虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,12 h后,每组再分为2个亚组,分别向虾腹部注射嗜水气单胞菌菌悬液(菌攻毒实验组和菌攻毒对照组)或生理盐水(实验组-1和对照组-1),于不同时间点测定幼虾的成活率、α2M基因表达水平和活力的变化。结果显示,KK-42预处理可显著提高感染嗜水气单胞菌的日本沼虾幼虾成活率。经BLAST比对,克隆的α2M部分mRNA序列与罗氏沼虾α2M具有90%以上同源性。实时荧光定量PCR实验显示,α2M基因表达水平在血细胞中最高,且以蜕皮前期最为显著。KK-42处理的幼虾血细胞α2M基因的表达无显著性差异;嗜水气单胞菌刺激使血细胞α2M mRNA水平在3 h比0 h提高了580%,其活力在24 h增幅为47.5%;而菌攻毒实验组mRNA水平在6~48 h明显高于菌攻毒对照组,尤其在12 h,增幅为511%,其活力水平也呈同样的变化趋势。研究表明,KK-42预处理能上调感染嗜水气单胞菌的幼虾血细胞α2M基因的转录水平,诱导α2M活力增强,这可能增强了幼虾的免疫水平,从而提高成活率。     

咪唑类物质KK-42对日本沼虾免疫功能的影响

为评估咪唑类物质KK-42对日本沼虾免疫相关基因表达及抗菌机能的影响,将处于蜕皮间期的日本沼虾分别用1.95×10~(-4) mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡1min,测定处理后3、6、12、24h和48h细胞质锰超氧化物歧化酶、线粒体锰超氧化物歧化酶和血蓝蛋白基因的表达以及相应酶活力的变化;KK-42处理12h后,腹部注射嗜水气单胞菌,测定感染后日本沼虾的死亡率。结果显示,KK-42处理后3、6、12h,细胞质锰超氧化物歧化酶、线粒体锰超氧化物歧化酶和血蓝蛋白基因表达明显提高,超氧化物歧化酶活力和血蓝蛋白含量也于6~48h持续升高,在24h达到最高值。KK-42预处理可以降低感染嗜水气单胞菌后日本沼虾的死亡率。试验结果表明,KK-42可诱导日本沼虾免疫相关基因的表达,并能提高日本沼虾的抗菌能力。     

在体条件下miR-305-5p对日本沼虾MnCHT3A的靶向调控作用

为了探索miRNA对日本沼虾几丁质酶3A(Macrobrachium nipponense chitinase 3A,MnCHT3A)基因的调控作用,实验采用生物信息学方法预测并筛选与MnCHT3A靶向结合的miRNA—miR-305-5p;利用qRT-PCR、生物化学以及组织学方法,研究了在体条件下,miR-305-5p对靶基因的调控作用。结果显示,一个蜕皮周期中miR-305-5p与MnCHT3A的表达量呈负相关,前者C期最高、A期最低;而MnCHT3A的表达趋势则相反。注射miR-305-5p mimics和miR-305-5p inhibitor后,与对照组相比,MnCHT3A转录水平分别降低60%和升高166%;MnCHT酶活性分别降低39.53%和升高133%。组织学观察发现,C期的头胸甲表皮为3层结构,由外向内依次为上表皮、外表皮和内表皮(H.E染色);几丁质荧光染色结果显示,几丁质分布在内、外表皮;扫描电镜结果清晰显示了内、外表皮的板层结构。与对照组相比,miR-305-5p mimics组内表皮的板层厚度增加,呈蓝色荧光的几丁质条带有增厚趋势;而miR-305-5p inhibitor组表皮结构紊乱,几丁质荧光分布不均且部分区域明显减弱。研究表明,miR-305-5p的靶基因为MnCHT3A,在体条件下,miR-305-5p能够靶向抑制MnCHT3A的转录。     

凡纳滨对虾细胞色素P450家族新基因CYP4V18的克隆及KK-42对其转录的抑制

为探讨咪唑类物质KK-42促进凡纳滨对虾(Litopenaeaus vannamei)生长的分子机制,本研究克隆出与蜕皮和生长相关的CYP4V18基因的全序列,研究了该基因的时空表达,并结合测定血淋巴20-羟基蜕皮甾酮(20E)滴度。将体长3.5～5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,之后在相同条件下常规饲养。CYP4V18 mRNA水平定量分析采用real-time PCR,血淋巴中20E滴度测定采用反相高效液相色谱法。结果显示,CYP4V18开放阅读框为1 545 bp,编码515个氨基酸,包含CYP450保守序列;系统进化显示,CYP4V18与CYP4家族基因的亲缘关系最近。CYP4V18 mRNA水平在肝胰腺最高,分别是脑、Y-器官和肌肉的4、26和32倍。KK-42处理可显著抑制CYP4V18表达,在第2、4和6天分别降低了72.3%(P<0.05)、82.6%(P<0.05)和187.7%(P<0.01)。与同期对照组相比,KK-42处理之后血淋巴20E滴度在第2、4和6天分别升高1.7%、6.5%和13.5%。结果表明,KK-42可显著抑制凡纳滨对虾肝胰腺CYP4V18转录,升高血淋巴20E滴度,这可能是KK-42促生长机制之一。     

日本沼虾表皮几丁质合成酶基因克隆及表达分析

为了解日本沼虾几丁质合成酶（Chs）基因在蜕皮过程中的作用,本实验采用RACE技术首次从表皮中克隆了几丁质合成酶基因（MnChs）cDNA全长,并用生物软件对其序列进行生物信息学分析,RT - PCR技术检测该基因的时空表达模式。结果表明,其cDNA全长5133 bp,5′UTR为 283 bp,3′UTR为 159 bp,开放阅读框（ORF）长度为4701 bp,编码1566个氨基酸,分子量为179.57 KDa,理论等电点为6.09,包含两个几丁质合成酶的标签序列EDR和QRRRW及Chitin-synth-C结构域。经BLAST比对,与日本仿长额虾、淡水枝角水蚤Chs相似性分别为89 %和63 %。RT - PCR结果显示,在蜕皮周期各阶段,不同组织MnChs的表达量差异显著：头胸甲在A期达到最高,胃肠在D0和D4期均较高,尾扇和肌肉在D4最高,肝胰腺则普遍较低。结果表明,MnChs基因转录物不仅存在于表皮,在其它组织也有分布,且mRNA水平的变化与蜕皮周期有关,作为几丁质生物合成的关键酶,推测该基因的表达在新外表皮和内表皮的形成中发挥重要作用。     

日本沼虾血清淀粉样蛋白A(SAA)基因的克隆及其免疫功能

为探索血清淀粉样蛋白A(SAA)在日本沼虾免疫防御系统中的作用,实验利用RACE方法克隆了日本沼虾SAA(MnSAA)基因cDNA全长序列,采用实时荧光定量PCR(QPCR)分析其在日本沼虾不同组织、不同发育时期的表达情况,以及溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒(WSSV)感染后MnSAA在血淋巴细胞和肝胰腺中的表达情况,同时还利用RNA干扰(RNAi)技术检测了MnSAA基因沉默后,日本沼虾再感染嗜水气单胞菌后其肝胰腺中激活子蛋白-1(AP-1)和B类清道夫受体(CD36)基因表达变化及虾的累积死亡率变化。结果显示,M n S A A基因c D N A全长649 b p(G e n B a n k登录号:MK292888),包含21 bp 5′非编码区,232 bp 3′非编码区,369 bp开放读码框,编码131个氨基酸残基;氨基酸序列比对及系统进化分析结果显示,MnSAA蛋白属于急性期血清淀粉样蛋白A蛋白(A-SAA),在进化上与无脊椎动物香港牡蛎的亲缘关系最近;mRNA表达分析显示,MnSAA基因在日本沼虾的各组织和各生长阶段均有表达,分别在肝胰腺和成虾阶段中的表达量最高;病原体感染实验表明,在日本沼虾感染溶壁微球菌、嗜水气单胞菌和白斑综合征病毒后12~72 h,其血淋巴和肝胰腺中的MnSAA基因表达量与对照组相比均显著升高;RNAi实验显示,MnSAA基因沉默后,日本沼虾肝胰腺中AP-1和CD36基因分别在其感染嗜水气单胞菌后12~72 h和6~72 h与对照组相比显著下降,日本沼虾累积死亡率在感染嗜水气单胞菌后与对照组相比明显升高。研究表明,MnSAA参与日本沼虾的抗病原体感染的反应,在日本沼虾的免疫防御体系中具有重要的作用。     

蜕壳周期内中华绒螯蟹钙含量、组织结构及相关基因表达变化

运用生化分析、组织切片和分子生物学等技术,测定蜕壳期(蜕下旧壳后0.5 h内)和蜕壳后期(蜕下旧壳0.5 h后至新壳未完全硬化之前)平均体质量(5.63±2.35)g中华绒螯蟹肝胰腺和鳃中的钙含量,观察肝胰腺和鳃组织结构变化,用荧光定量PCR技术分析肝胰腺和鳃中的钙网蛋白(CRT)基因的表达情况.试验结果表明,蜕壳后期...     

日本沼虾五群体形态性状对体质量的通径分析

为筛选出影响日本沼虾体质量的主要形态性状,以便确定人工选育的理想测定指标,以太湖、鄱阳湖、白洋淀、微山湖及淀山湖的野生日本沼虾为研究对象,随机选取各群体90尾虾测定19个形态指标,采用简单相关分析和通径分析等多元回归分析方法分析各群体对体质量作用较为突出的形态性状,并进行聚类分析。通径分析结果显示,太湖群体体长、头胸甲宽、第二步足长、头胸甲高、尾扇长对体质量的通径系数达到极显著,逐步回归建立其对体质量的回归方程、回归截距及相应的回归系数分别为–9.878、0.075、0.314、0.011、0.320、0.222;鄱阳湖群体头胸甲长、尾扇长、尾节宽、头胸甲宽、头胸甲高、尾节高、体长性状对体质量的通径系数达到极显著,回归截距和相应的回归系数分别为–1.618、0.392、–0.280、0.703、0.524、–0.359、0.688、–0.061;白洋淀群体体长、头胸甲宽、第二步足长和尾扇长对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数分别为–4.796、0.082、0.222、0.007、0.136;微山湖群体头胸甲长、腹节高、第二步足长、腹节宽对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数分别为–7.644、0.248、0.329、0.025、0.301;淀山湖群体体长、第二步足长、头胸甲宽、尾节宽、腹节宽对体质量的通径系数达到极显著,其回归截距和相应的回归系数为–6.257、0.019、0.018、0.164、0.264、0.162。体长与头胸甲性状在不同群体中都对体质量的作用十分明显。聚类结果显示,地理位置越接近,形态上越相似。研究表明,各个地区被保留的性状与体质量的复相关系数为0.965、0.904、0.902、0.971、0.955,为影响各自群体体质量的主要自变量。     

低氧和复氧对日本沼虾抗氧化酶活力及组织结构的影响

为研究低氧胁迫及恢复后日本沼虾(Macrobrachiumnipponense)抗氧化酶活力和组织结构的变化,将体重(2.0±0.2) g的日本沼虾暴露于(2.0±0.2) mg/L低氧环境中24 h,设定溶解氧(6.0±0.2) mg/L为对照组,每组设置3个重复,于低氧胁迫0 h、6 h、12 h、24 h及复氧1 h、6 h、12 h、24 h分别采集实验组及对照组鳃、肝胰腺及肌肉组织,测定这些组织的抗氧化酶活力,并进行组织切片观察。实验结果表明,低氧胁迫期间肌肉组织中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活力先升高后下降, 3种酶活力在低氧胁迫12 h时显著高于对照组(P0.05),复氧阶段肌肉组织中SOD、CAT酶活力呈波动性变化,GPX酶活力在复氧24h时显著低于对照组(P0.05)。鳃组织中SOD、CAT和GPX酶活力在低氧胁迫12 h时显著高于对照组(P0.05), GPX酶活力在复氧24 h时显著高于对照组(P0.05)。在低氧胁迫期间肝胰腺SOD、CAT和GPX酶活力在低氧6 h均达到最大值并显著高于对照组(P0.05),复氧阶段3种酶活力均呈现波动性变化,肝胰腺中丙二醛(MDA)含量在低氧及复氧阶段均显著高于对照组(P0.05)。低氧胁迫及恢复并未对肌肉组织结构产生明显的影响。鳃组织在低氧胁迫期间鳃小片上皮细胞与支柱细胞排列发生紊乱,次级层片发生肥大的现象且有红细胞流入,泌氯细胞形态发生变化且细胞数目有所增加,但复氧后均得到一定程度的恢复。肝胰腺组织在低氧胁迫期间B细胞数量逐渐降低,胞内运转泡体积减小,复氧阶段B细胞数量及体积恢复明显。结果表明急性低氧胁迫能够导致日本沼虾肝胰腺和鳃组织结构损伤并引起抗氧化酶活力发生显著变化,且24 h恢复期不足以让日本沼虾在低氧胁迫中完全恢复。     

Effects of cholesterol on growth,feed utilization,body composition and immune parameters in juvenile oriental river prawn,Macrobrachium nipponense (De Haan)

An 8‐week feeding trial was conducted to investigate the effects of dietary cholesterol levels on growth, feed utilization, body composition and immune parameters in juvenile oriental river prawn, Macrobrachium nipponense. Six isolipid (80 g kg^?1 crude lipid) and isoproteic (400 g kg^?1 crude protein) diets, supplemented with 0, 3.0, 6.0, 9.0, 12.0 and 15.0 g kg^?1 cholesterol, were evaluated. Growth performance and feed utilization of M. nipponense were improved as dietary cholesterol levels increased. Weight gain and specific growth rate were highest, and feed conversation ratio was lowest, when prawns were fed a diet supplemented with 9.0 g kg^?1 cholesterol. However, final body weights and survival rates of juvenile M. nipponense were not affected significantly by dietary cholesterol. Body composition of prawns, including moisture, crude protein and crude lipid, was not significantly affected by changes in dietary cholesterol. The immune parameters measured in hepatopancreas, including total antioxidant capacity, and glutathione, catalase, alkaline phosphatase and acid phosphatase activities, were at optimum levels in prawns fed with 9.0 g kg^?1 dietary cholesterol. In summary, the best growth performance, lowest feed conversation ratio, and the most enhanced antioxidant capacity and immunity parameters were attained in juvenile M. nipponense when fed a diet supplemented with 9.0 g kg^?1 cholesterol.