KK-42对日本沼虾D3期头胸甲表皮结构的影响

为探讨KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制,实验采用组织学方法观察了幼虾头胸甲表皮结构,定量测定了肝胰腺N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)的活力。将体长(3.3±0.5)cm的日本沼虾随机分为两组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液(实验组)或不含KK-42的溶液(对照组)浸泡处理1 min之后,选取处于蜕皮前期D3期的日本沼虾,观察头胸甲表皮结构,测定肝胰腺NAGase活力。结果显示,KK-42处理后第1天,头胸甲外表皮厚度与对照组相比显著增长42.83%;第3天和第9天,内表皮的厚度同比提高70.72%、77.27%,整个头胸甲的厚度同比显著增厚。KK-42处理后第3天,上皮细胞的高度比对照组提高31.69%。KK-42处理后6、12和24 h,NAGase活力分别比相应的对照组升高42.53%、34.28%和18.36%。研究表明,KK-42处理可显著增加D3期日本沼虾头胸甲外骨骼的厚度,提高肝胰腺NAGase活力。     

KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能机制

为了探索KK-42对日本沼虾幼虾蜕皮周期的影响及其可能的机制,以水产基地自行繁殖的2月龄幼虾(体长1.2~2.0 cm)为材料,捕捞后暂养于流水养殖水槽,水温(26±1)°C,每天投喂2次,1周后用于实验研究。用1.95×10–4 mol/L的KK-42溶液(处理组)或不含KK-42溶液(对照组)浸润1 min,取出,一部分用于幼虾生长速率、蜕皮周期的测定;从剩余部分中选择处于蜕皮间期(C)和蜕皮前期(D)的幼虾,Real-time PCR分析表皮几丁质酶1基因(Mnchi-1)的转录水平,同时进行表皮几丁质酶的活力测定。在实验观察期间,KK-42处理组平均体质量均显著高于对照组,体质量增长率的升高出现在处理后的前2周。随着幼虾的生长,蜕皮周期的持续时间均趋于延长,在4个连续测定的蜕皮周期中,KK-42处理能明显缩短前2个周期的时程,分别从(8.70±1.07)、(9.81±0.43)d/周期缩短为(6.93±0.97)、(8.11±1.20)d/周期。KK-42处理可显著上调C期表皮Mnchi-1的表达,在第3、6和9 h,其m RNA水平比对照组高10倍以上,酶活性同比提高2倍以上;KK-42对D期的影响相对较弱,该基因的表达水平及酶活性仅在12 h显著升高。结果表明,KK-42能显著诱导D期、尤其是C期表皮Mnchi-1基因的表达,提高几丁质酶活性,推测幼虾对旧表皮的分解提前至C期,这可能是KK-42缩短幼虾的蜕皮周期、促进其生长的分子机制之一。     

日本沼虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶基因克隆及KK-42对其表达的影响

为进一步探究KK-42缩短蜕皮周期的分子机制,本研究以日本沼虾幼虾为材料,通过RACE技术克隆了几丁质降解途径中的限速酶基因NAGase c DNA全长序列,定量测定了KK-42处理不同时间对头胸甲表皮组织中NAGase m RNA相对表达量和对应酶活力的影响。序列分析结果显示,NAGase c DNA全长2 536 bp,编码617个氨基酸。同源性分析显示,NAGase基因保守性较低,与凡纳滨对虾的相似度最高,仅为68%。系统进化分析显示,日本沼虾、三疣梭子蟹、凡纳滨对虾、中国明对虾聚为一个大类,凡纳滨对虾和中国明对虾亲缘关系更为接近,日本沼虾单列一个分支。Real-time PCR分析表明,NAGase相对表达量在蜕皮前D_0期达到峰值;KK-42处理后3 h,D_4期的相对表达量是对照组的253%,处理后6 h,C期和D_0期较对照组分别提高了226%和187%。NAGase酶活力从C期到D_4期逐渐提高,KK-42处理能明显提高C和D_0期NAGase酶活力,尤其对C期的影响最为显著,在处理后3、6和12 h分别提高了11.26、5.99、7.15倍。结果提示,KK-42对日本沼虾表皮NAGase的诱导效应可能是其缩短蜕皮周期的分子机制之一。     

日本沼虾表皮蛋白-5基因全长cDNA克隆及表达分析

为探究甲壳动物表皮蛋白多样性及其功能,根据表皮转录组资料,利用RACE技术扩增得到日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长序列,分析其生物信息学、不同蜕皮时期的表达特征以及KK-42对其表达特征的影响。日本沼虾表皮蛋白-5基因的cDNA全长796bp,开放阅读框477bp,编码158个氨基酸,含RR基序,预测蛋白等电点为4.22,分子量为16.46ku;氨基酸序列比对发现日本沼虾表皮蛋白-5与克氏原螯虾Casp-2相似性最高,为76%,与其他甲壳动物表皮蛋白相似性为41%~53%。实时荧光定量PCR结果显示,日本沼虾表皮蛋白-5基因在3个时期——蜕皮间期、蜕皮前早期和蜕皮前晚期均有表达,其中在脱皮前晚期的相对表达量最高,为蜕皮间期的1400倍,与之有极显著差异(P0.01)。KK-42处理显著上调日本沼虾表皮蛋白-5基因在蜕皮前早期的表达,在处理后3、6h和48h表达量分别是对照组的6.3、4.8和11.4倍。KK-42诱导日本沼虾表皮蛋白-5基因的表达,使峰值前移,这可能是KK-42缩短日本沼虾幼虾蜕皮周期的机制之一。     

KK-42对蜕皮后期日本沼虾头胸甲超微结构的影响

为了深入探究KK-42对表皮结构的影响,本实验以外表皮形成趋于结束而内表皮开始出现的蜕皮后期幼虾为材料,通过扫描电镜观察石蜡切片法,分析了KK-42处理前后头胸甲外表皮,尤其是内表皮结构的变化。将处于蜕皮间期的健康幼虾[体长(3.5±0.1)cm]随机分为2组,分别用1.95×10^-4 mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液处理,取蜕皮后1.5、3.0、6.0及12.0 h幼虾头胸甲,观察其超微结构。另取蜕皮后6.0 h头胸甲,用解剖刀轻轻刮去内面组织,通过扫描电镜观察内表皮的表面结构。结果显示,蜕皮后1.5和3.0 h,头胸甲只包含上表皮和外表皮,KK-42处理组外表皮的板层数量显著增加,外表皮厚度分别比相应对照组提高了72.07%和38.67%;蜕皮后6.0~12.0 h,外表皮中疏松的板层趋于致密,其厚度在二组间无统计学差异。蜕皮后6.0 h,只有1层板层的内表皮出现,到蜕皮后12.0 h,板层数增至2层(对照组)和3层(处理组),且板层结构均疏松。此外,内表皮表面分布着大小不等、头尾走向的梭形孔道(pore canals);KK-42处理组内表皮结构未见明显变化。实验表明,KK-42对蜕皮后期日本沼虾幼虾头胸甲的超微结构有显著影响,能加快外表皮及内表皮板层的形成速率。     

凡纳滨对虾细胞色素P450家族新基因CYP4V18的克隆及KK-42对其转录的抑制

为探讨咪唑类物质KK-42促进凡纳滨对虾(Litopenaeaus vannamei)生长的分子机制,本研究克隆出与蜕皮和生长相关的CYP4V18基因的全序列,研究了该基因的时空表达,并结合测定血淋巴20-羟基蜕皮甾酮(20E)滴度。将体长3.5～5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,之后在相同条件下常规饲养。CYP4V18 mRNA水平定量分析采用real-time PCR,血淋巴中20E滴度测定采用反相高效液相色谱法。结果显示,CYP4V18开放阅读框为1 545 bp,编码515个氨基酸,包含CYP450保守序列;系统进化显示,CYP4V18与CYP4家族基因的亲缘关系最近。CYP4V18 mRNA水平在肝胰腺最高,分别是脑、Y-器官和肌肉的4、26和32倍。KK-42处理可显著抑制CYP4V18表达,在第2、4和6天分别降低了72.3%(P<0.05)、82.6%(P<0.05)和187.7%(P<0.01)。与同期对照组相比,KK-42处理之后血淋巴20E滴度在第2、4和6天分别升高1.7%、6.5%和13.5%。结果表明,KK-42可显著抑制凡纳滨对虾肝胰腺CYP4V18转录,升高血淋巴20E滴度,这可能是KK-42促生长机制之一。     

咪唑类物质KK-42对日本沼虾α2-巨球蛋白基因表达的影响

为探讨KK-42提高感染嗜水气单孢菌的日本沼虾幼虾成活率的机制,实验首次克隆了α2M部分序列,研究了α2M基因的时空表达以及KK-42对其表达和活力的影响。将体长3.5~5.0 cm的日本沼虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,12 h后,每组再分为2个亚组,分别向虾腹部注射嗜水气单胞菌菌悬液(菌攻毒实验组和菌攻毒对照组)或生理盐水(实验组-1和对照组-1),于不同时间点测定幼虾的成活率、α2M基因表达水平和活力的变化。结果显示,KK-42预处理可显著提高感染嗜水气单胞菌的日本沼虾幼虾成活率。经BLAST比对,克隆的α2M部分mRNA序列与罗氏沼虾α2M具有90%以上同源性。实时荧光定量PCR实验显示,α2M基因表达水平在血细胞中最高,且以蜕皮前期最为显著。KK-42处理的幼虾血细胞α2M基因的表达无显著性差异;嗜水气单胞菌刺激使血细胞α2M mRNA水平在3 h比0 h提高了580%,其活力在24 h增幅为47.5%;而菌攻毒实验组mRNA水平在6~48 h明显高于菌攻毒对照组,尤其在12 h,增幅为511%,其活力水平也呈同样的变化趋势。研究表明,KK-42预处理能上调感染嗜水气单胞菌的幼虾血细胞α2M基因的转录水平,诱导α2M活力增强,这可能增强了幼虾的免疫水平,从而提高成活率。     

中华绒螯蟹蜕皮周期及蜕皮过程中肝胰腺消化酶活性的变化

采用Darch蜕皮周期分期方法,对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的蜕皮周期进行了划分,并初步探讨了中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺消化酶活性变化。根据第三颚足末端刚毛和表皮的形态学特征,可将中华绒螯蟹的蜕皮周期分为蜕皮后期(A-B期)、蜕皮间期(C期)、蜕皮前期(D期)和蜕皮期(E期),其中D期可进一步分为D0、D1、D3-43个亚期。在蜕皮过程中,肝胰腺淀粉酶和胰蛋白酶活性在蜕皮后A-B期开始升高,于蜕皮前早期D0阶段达最大(P<0.05),随后又逐渐降低,至蜕皮前晚期D3-4阶段降至最低(P<0.05);胃蛋白酶活力在蜕皮周期中于蜕皮前晚期D3-4阶段显著降低(P<0.05),其他阶段变化不明显(P>0.05)。结论认为,中华绒螯蟹蜕皮过程可分为C、D0、D1、D3-4、A-B 5个时期,蜕皮过程中肝胰腺淀粉酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶活性发生周期性变化。     

KK-42对凡纳滨对虾热激蛋白基因表达的诱导作用

为探讨咪唑类物质KK-42可能的作用机制,首次克隆了热激蛋白90(HSP90)部分mRNA序列,研究了HSP90以及HSP70基因的时空表达以及KK-42对其表达的影响。将体长3.5～5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10^-4 mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,之后在相同条件下常规饲养。结果显示, HSP90和HSP70在凡纳滨对虾大颚器官、眼柄、肌肉和肝胰腺都有表达,其中,肝胰腺中的表达水平较高。实验期间,肝胰腺中两种HSP mRNA水平虽有一定波动,但含量相对较低;KK-42处理可显著诱导肝胰腺HSP的表达,在处理后第1、2、3天,HSP70和HSP90 mRNA含量分别比相应的对照组升高了243.4%、141.3%、410.5%和121.6%、505.5%、481.7%。结果表明,KK-42处理可显著提高凡纳滨对虾肝胰腺HSP90和HSP70基因的转录水平。     

保幼激素拮抗物KK-42对凡纳滨对虾HMGR表达的抑制

为研究保幼激素拮抗物KK-42促生长的分子机制,实验克隆出甲基法呢酯(MF)合成的关键酶——3-羟-3-甲基-戊二酰还原酶A(HMGR)部分mRNA序列,并研究该基因时空表达以及KK-42对其表达的影响。将体长3.5~5.0 cm凡纳滨对虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10^-4 mol/L的KK-42溶液或不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,之后在相同条件下常规饲养。不同组织中HMGR mRNA水平定量分析采用realtime PCR,血淋巴中MF滴度测定采用正相高效液相色谱法。结果显示,HMGR mRNA水平在大颚器官(MO)最高,其次是眼柄,肌肉和肝胰腺水平最低。在实验观察期间,眼柄与MO两种组织中HMGR的表达模式明显不同,前者各时间点mRNA水平变化较小,无统计学差异(P>0.05);后者mRNA含量分别在第1、7天显著高于第0天;实验期间血淋巴MF滴度逐渐升高。KK-42处理可显著抑制HMGR表达,但眼柄和MO中HMGR转录的下调模式仍不相同,前者mRNA水平在各时间点之间没有明显差异(P>0.05);而在MO下调幅度出现明显波动,其中在第1和7天,mRNA含量分别下降了82.5%和90.7 %;血淋巴MF滴度逐渐下降。结果表明,KK-42可显著抑制凡纳滨对虾多种组织(尤其是MO和眼柄)HMGR转录,降低血淋巴MF滴度,这可能是其促生长的机制之一。     

日本沼虾蜕皮过程中头胸甲外骨骼超微结构的改变

采用HE染色及石蜡切片的扫描电镜观察方法,描述了日本沼虾(Macrobrachium nipponense)蜕皮间期(C期,intermolt stage)及新旧表皮更替变化剧烈的蜕皮前晚期(D4期,late premolt stage)和蜕皮后期(postmolt stage)A-B期头胸甲外骨骼的形态结构变化特点。结果显示,日本沼虾外骨骼分为上表皮、外表皮、内表皮三层,D4期出现新的上表皮和外表皮,B期出现新内表皮,外表皮强嗜碱性而内表皮弱嗜酸性。扫描电镜观察发现,C期头胸甲内、外表皮均为几丁质-蛋白质纤维构成的平行板层结构且板层内有发达的孔道系统(pore canals,pc),但内外表皮板层间排列紧密程度不同,外表皮板层切面边缘较整齐,结构致密,板层内pc大小均一、近似圆形,内表皮板层切面边缘粗糙,结构较疏松,板层内pc大小不等、多为梭形。在蜕皮前后,新外表皮结构变化显著,与C期相比,D4期新外表皮超微结构与旧内表皮结构相似,而在A期,外表皮超微结构由疏松变为致密,这可能与蜕皮后表皮的钙化相关。本研究旨为阐明沼虾的蜕皮机制提供基础资料。     

蜕壳周期内中华绒螯蟹钙含量、组织结构及相关基因表达变化

运用生化分析、组织切片和分子生物学等技术,测定蜕壳期(蜕下旧壳后0.5 h内)和蜕壳后期(蜕下旧壳0.5 h后至新壳未完全硬化之前)平均体质量(5.63±2.35)g中华绒螯蟹肝胰腺和鳃中的钙含量,观察肝胰腺和鳃组织结构变化,用荧光定量PCR技术分析肝胰腺和鳃中的钙网蛋白(CRT)基因的表达情况.试验结果表明,蜕壳后期...     

Carbonic anhydrase and Na/K-ATPase activities during the molt cycle of low salinity-reared white shrimp <Emphasis Type="Italic">Litopenaeus vannamei</Emphasis>

Changes in hemolymph osmolality, ion concentrations, and enzymatic activities of carbonic anhydrase (CA) in the gills and epidermal tissue, and Na/K-ATPase in the gills during the molt cycle were investigated in the white shrimp Litopenaeus vannamei. Hemolymph osmolality was high in the intermolt and early premolt stages, but started to decrease prior to ecdysis through to postmolt stages A and B. Changes in Na⁺ and Cl⁻ ion concentrations paralleled those in hemolymph osmolality. CA activity levels in the anterior and posterior gills were low at intermolt stage C₀ and premolt stage D₀, and maximum at premolt stage D₃. In the epidermal tissue, activity was relatively high at intermolt stage C₀ and premolt stage D₀, but fluctuated towards premolt stage D₃ and postmolt stage A. On the other hand, Na/K-ATPase activity in the gills decreased between intermolt stage C₀ and premolt stage D₂, but increased at premolt stage D₃ and postmolt stage A. The changes in patterns of CA activity during the molt cycle suggest that CA may be involved in supplying counter-ions for Na⁺ and Cl⁻ uptake during molting. Branchial Na/K-ATPase appears to be involved in producing local osmotic gradients in order to support water influx across the epithelium.     

中华绒螯蟹蜕皮周期中肝胰腺细胞组成的变化

取一年生未成熟中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)幼蟹, 甲壳宽度在15~40 mm, 暂养在75 cm×50 cm×45 cm的玻璃缸内, 24 h充气, 自然光照, 每天换水1/3, 每次换水后投喂土豆、杂鱼等食物, 动物适应实验室条件1周后进行实验。为得到蜕皮后的样本, 将处于蜕皮前晚期的个体在相同条件下单独饲养。根据已报道方法, 将中华绒螯蟹的蜕皮周期分为蜕皮间期C期、蜕皮前D₀、D₁和D_3–4期、蜕皮后A-B期等5个时期。采用细胞学和组织学方法观察中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺细胞组成的变化, 结果显示, R细胞数量在蜕皮间期和蜕皮前期都占绝对优势, 虽然在蜕皮前早期D₀期数量显著下降(P<0.05), 但从D₁期开始上升, 于蜕皮前晚期D_3–4期达到最高(62.06 ± 3.92)%, 而在蜕皮后A-B期又显著降低(P<0.05)。F细胞的数量除在D₁期显著增加外(P<0.05), 其余时期的变化无统计学差异(P>0.05)。B细胞数量在蜕皮前早期D₀期显著增高(P<0.05), 随后开始下降, 直到蜕皮前晚期D_3–4期恢复到间期水平, 而蜕皮后A-B期数量又显著增高(P<0.05)。E细胞数量除在蜕皮前早期D₀期稍微上升外, 其余时期基本稳定(P>0.05)。饥饿对处于不同蜕皮时期的中华绒螯蟹肝胰腺细胞组成的影响不同, 饥饿48 h后, 处于D₀时期的中华绒螯蟹与正常组相比, 肝胰腺R细胞数量无显著变化, B细胞和E细胞数量显著下降, F细胞数量上升。处于D₁时期的中华绒螯蟹与正常组相比, 肝胰腺R细胞、B细胞、F细胞和E细胞数量均无显著变化。说明中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺细胞组成的变化和蜕皮周期密切相关。本研究通过探讨中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺组织结构及细胞组成变化, 了解甲壳动物蜕皮过程的基础生物学现象, 并为其健康养殖提供理论基础。

     

Carbonic anhydrase and Na/K-ATPase activities at different molting stages of the giant freshwater prawn <Emphasis Type="Italic">Macrobrachium rosenbergii</Emphasis>

ABSTRACT:   In the present study, the role of carbonic anhydrase (CA) and Na/K-ATPase in the gill and epidermal tissues in the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii was examined as a function of molting stage. CA activity levels in the front and back gills were low at the intermolt stage C₀, but increased significantly at premolt stage D₃, and then decreased after molting. In the epidermal tissue, activity levels decreased gradually towards premolt to a minimum level at stage D₃, but became elevated at postmolt stages A and B. Na/K-ATPase levels in the front and back gills did not change significantly during the molt cycle. CA in the gill is possibly involved in supplying counter-ions for ion uptake, while CA in the epidermal tissue may play a role in mineralizing the exoskeleton after ecdysis. Na/K-ATPase in the gills may function in ion uptake from the ambient medium; however, since its activity was not influenced by the molt cycle, it probably does not have a major role in osmoregulation in the freshwater environment.     

The molt stages and the hepatopancreas contents of lipids,glycogen and selected inorganic elements during the molt cycle of the Chinese mitten crab <Emphasis Type="Italic">Eriocheir sinensis</Emphasis>

A rapid molt-staging technique was developed for the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis, with the aim of investigating selected molt-linked biochemical and inorganic factors in these animals. The results allow the identification of four distinct molting periods (postmolt, intermolt, premolt and ecdysis) and the further classification of the premolt period into three substages (D₀, D₁ and D_3-4). These findings are consistent with the classical scheme elaborated by Drach and Tchernigovtzeff (Vie Milieu 18:595–610, 1967). The contents of lipids, glycogen and several inorganic elements (Ca, Mg, Cu and Zn) in the hepatopancreas fluctuated and agreed well with their functions and with the molting stages during the molt cycle.