致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

嗜水气单胞菌疫苗免疫效果研究

选取对鲤鱼毒力强的嗜水气单胞菌菌株制成灭活疫苗,研究疫苗的免疫保护效应.采用甲醛灭活制备疫苗,分别对鲤鱼进行注射和浸泡试验,测定白细胞吞噬活性、淋巴细胞转化能力、血清、皮肤黏液的抗体效价及活菌攻毒后的免疫保护率.结果表明,受免鱼各项指标均明显高于对照组,注射组免疫保护率达90%,其中浸泡组各项略低于注射组.嗜水气单胞菌灭活疫苗对鲤鱼有显著免疫保护效应,可作为预防细菌性败血症感染的疫苗.     

L-半胱氨酸提高嗜水气单胞菌对氟苯尼考的敏感性

抗菌药物的应用能对细菌感染性疾病进行有效地控制和治疗,但水产动物养殖中滥用和误用抗菌药物导致耐药细菌的产生、养殖水环境污染和养殖动物药物残留等一系列问题,应对和解决抗菌药物在水产动物养殖中的滥用问题已经刻不容缓。本研究通过抗菌药物杀菌、组织细菌清除、细菌攻毒、鱼体存活率统计和药物敏感性检测等方法,探究外源L-半胱氨酸添加对氟苯尼考杀菌作用的影响。体外杀菌结果显示,4.00 mmol/LL-半胱氨酸可使20.00～200.00μg/mL氟苯尼考对嗜水气单胞菌的杀菌效率提高1.9～11.1倍,其联合用药的杀菌作用具有剂量和时间依赖效应。组织细菌清除结果显示,相比单独使用氟苯尼考,L-半胱氨酸与氟苯尼考合剂对鱼体肝脏、脾脏和肾脏组织中嗜水气单胞菌的清除能力提高4～16倍。细菌攻毒后,采用注射和口服L-半胱氨酸或/和氟苯尼考进行治疗,结果发现L-半胱氨酸与氟苯尼考合剂可大幅提高黄河鲤对嗜水气单胞菌的抗感染能力。同时,单独添加L-半胱氨酸也能促进组织细菌的清除和鱼体的抗感染能力。细菌MIC测定结果显示,添加1.00～4.00 mmol/L L-半胱氨酸使嗜水气单胞菌对氟苯尼考的敏感性提高2～4倍。由此推测,L-半胱氨酸可能通过增强嗜水气单胞菌对氟苯尼考的敏感性,从而提高抗菌药物对鱼体细菌感染的防治效果。研究表明,L-半胱氨酸作为氟苯尼考的增效剂不仅可提高抗菌药物的防治效果,而且可大幅降低抗菌药物的使用量,对嗜水气单胞菌的防控具有一定的实际应用价值。     

A3α肽聚糖增强灭活嗜水气单胞菌疫苗免疫效果的研究

为了探讨 A_(3α)肽聚糖对灭活嗜水气单胞菌疫苗免疫效果的影响,用添加肽聚糖的饲料投喂注射接 种经甲醛灭活的嗜水气单胞菌菌苗的彭泽鲫,测定鲫鱼白细胞吞噬活性、血清和体表粘液溶菌酶活性、抗体 效价以及活菌攻毒后的免疫保护率。结果表明,肽聚糖与灭活菌苗联合使用,鱼体表粘液和血清溶菌酶活性、 白细胞吞噬活性、抗体效价以及活菌攻毒后的免疫保护率显著提高,表明 A_(3α)肽聚糖可增强灭活菌苗的免疫效 果。     

多效价载体疫苗免疫大菱鲆效果评价

采用注射与浸泡2种方法,对构建的多效价载体疫苗MVAV6203A-1进行了免疫保护效果和血清效价的研究.结果显示,用多效价载体疫苗注射免疫大菱鲆(Scophthalmus maximus),可同时获得对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的免疫保护效果,免疫相对保护率分别为80.6％和77.0％；用ELISA方法测定血清效价的结果显示,免疫MVAV6203A-1后大菱鲆血清效价最高达到2 048,均值为891,明显高于对照组的97；用多效价载体疫苗浸泡免疫大菱鲆后,对鳗弧菌与嗜水气单胞菌的免疫相对保护率分别为62.2％和11.7％.血清效价分析显示,实验组与对照组的均值均为64.上述结果表明,所构建的疫苗MVAV6203A-1可有效提高大菱鲆对鳗弧菌和嗜水气单胞菌的免疫力,并且免疫和攻毒的途径可能是影响免疫保护效果的因子.本研究旨在为鳗弧菌与嗜水气单胞菌引起的鱼类疾病防治提供技术支撑.     

嗜水气单胞菌在浸泡感染团头鲂的组织动态分布

利用具有绿色荧光蛋白基因标记的嗜水气单胞菌(WJ-8G FP)对团头鲂(Megalobrama amblycephala)进行浸泡攻毒试验,探究温度对浸泡感染后嗜水气单胞菌在团头鲂各组织分布的影响。实验设立A组(水温25℃),B组(水温32℃),C组(水温25℃),其中C组为对照组。用菌株WJ-8G FP对实验组A、B进行浸泡攻毒,试验组C不进行攻毒处理,攻毒后分别于2 h、4 h、8 h、12 h、24 h采集各组鱼血液、脾、肾、鳃、肠道、肌肉,培养法统计分析各组织器官上的荧光细菌数量。实验结果显示,在各取样时间段实验组A(25℃)和实验组B(32℃)团头鲂各组织在均能检测到荧光嗜水气单胞菌,对照组未检测到嗜水气单胞菌;最高菌量出现在鳃,且鳃上嗜水气单胞菌数量显著大于其他组织(P0.05),其次是脾、肾;组织内的菌量随时间大体呈现先上升后下降的趋势;B实验组中各组织菌量显著大于A实验组(P0.05)。研究结果表明,鳃是嗜水气单胞菌浸泡感染团头鲂的主要组织器官,与25℃相比较,在水温32℃时团头鲂被嗜水气单胞菌感染的风险更高。     

耐喹诺酮类药物嗜水气单胞菌的分离鉴定及电镜观察

本研究对吉林省内12个水域采集和送检的66尾病鱼进行细菌分离鉴定,共检出46株嗜水气单胞菌疑似株,通过生化试验和PCR扩增气溶素基因aer鉴定法,确定其中22株为嗜水气单胞菌。进一步采用纸片扩散法和双倍稀释法测定嗜水气单胞菌分离株对多种抗生素的耐药性,其中部分菌株存在不同程度的耐药性,22株嗜水气单胞菌中有4株对喹诺酮类药物耐药,并且为交叉耐药。其对喹诺酮类药物的抑菌圈均小于19mm。嗜水气单胞菌耐喹诺酮类药物的检出率为18 2%。将病料中分离的8株嗜水气单胞菌在电镜下观察发现,2株耐药菌表面发现均匀分布的球形结构,而6株敏感菌表面未见此结构。     

豫北地区主要淡水鱼类感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

对豫北地区嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病进行流行病学调查,分离鉴定致病性嗜水气单胞菌菌株,并对致病性嗜水气单胞菌菌株进行毒力验证和药敏试验。采集4个养殖场病鱼标本及水样,每月进行流行病学调查,利用生理生化及分子生物学方法检测嗜水气单胞菌的分布状况。结果显示,筛选出52株为嗜水气单胞菌,其中32株为致病性嗜水气单胞菌,20株为非致病性嗜水气单胞菌,且致病性嗜水气单胞菌主要分布在7—9月份,毒力验证试验表明,32株致病性菌株的毒力大小差异明显,筛选出强毒株XDMG(4),为后期试验的疫苗株做准备;药敏试验表明,不同菌株对同一种药物的药敏结果不同,但大部分药物的药敏结果基本一致,70%以上的致病性菌株对头孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌药物表现为高度敏感,对青霉素类药物表现为高度耐药性,耐药率达100%,对氨基糖苷类(不包括阿米卡星)、磺胺类、四环素等药物呈现不同程度的耐药性,具有多重耐药性。本试验旨在丰富本地区的鱼类细菌性败血病的病原资料,并为该菌引起的人类疾病的防控提供科学依据。     

咪唑类物质KK-42对日本沼虾α2-巨球蛋白基因表达的影响

为探讨KK-42提高感染嗜水气单孢菌的日本沼虾幼虾成活率的机制,实验首次克隆了α2M部分序列,研究了α2M基因的时空表达以及KK-42对其表达和活力的影响。将体长3.5~5.0 cm的日本沼虾幼虾随机分为2组,分别用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液和不含KK-42的溶液浸泡处理1 min,12 h后,每组再分为2个亚组,分别向虾腹部注射嗜水气单胞菌菌悬液(菌攻毒实验组和菌攻毒对照组)或生理盐水(实验组-1和对照组-1),于不同时间点测定幼虾的成活率、α2M基因表达水平和活力的变化。结果显示,KK-42预处理可显著提高感染嗜水气单胞菌的日本沼虾幼虾成活率。经BLAST比对,克隆的α2M部分mRNA序列与罗氏沼虾α2M具有90%以上同源性。实时荧光定量PCR实验显示,α2M基因表达水平在血细胞中最高,且以蜕皮前期最为显著。KK-42处理的幼虾血细胞α2M基因的表达无显著性差异;嗜水气单胞菌刺激使血细胞α2M mRNA水平在3 h比0 h提高了580%,其活力在24 h增幅为47.5%;而菌攻毒实验组mRNA水平在6~48 h明显高于菌攻毒对照组,尤其在12 h,增幅为511%,其活力水平也呈同样的变化趋势。研究表明,KK-42预处理能上调感染嗜水气单胞菌的幼虾血细胞α2M基因的转录水平,诱导α2M活力增强,这可能增强了幼虾的免疫水平,从而提高成活率。     

水库暴发性鱼病及其防治技术研究

用经酚灭活的嗜水气单胞菌和由该菌提取的脂多糖作为抗原对鱼进行注射免疫后，其血清中凝集抗体效价在第４周达到峰值，血液和头贤中吞噬细胞活性均高于对照鱼，以活菌攻毒后鱼体免疫保护力分到达５３．９％和６９．２％。     

褐牙鲆腹水症病原菌的分离鉴定及其灭活疫苗的研制

从患腹水病褐牙鲆体内分离致病菌,通过生理生化和分子生物学方法进行鉴定;该菌的16S rDNA序列与标准株同源性达99.8%,证明该菌为嗜水气单胞菌.制备灭活疫苗后分别注射小鼠和牙鲆,测定其免疫效果.试验结果表明,用所制备的灭活疫苗免疫小鼠,其保护率达到90%,免疫牙鲆的保护率达到80%;采用渗透压差法浸泡免疫牙鲆在攻毒后发病率仅为6%,攻毒后保护率为85%;通过间接ELISA检测表明受免动物体内产生了较高水平的抗体;剖检及病理切片结果表明免疫过的动物内脏健康无异样,而未免动物肝脏充血,肠腔有积水.说明该疫苗安全有效.     

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

中华绒螯蟹嗜水气单胞菌微胶囊口服疫苗制备工艺及特性研究

以福尔马林灭活的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)腹水病及抖抖病并发病病原菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)CL99920菌株为芯材和海藻酸钠为壁材,采用乳化法制备嗜水气单胞菌微胶囊口服疫苗.通过单因素试验和正交试验,研究了海藻酸钠浓度、乳化时间、搅拌速度和菌胶比例对嗜水气单胞菌...     

一株分离自团头鲂的嗜水气单胞菌病原学及其与ST251型菌株的全基因组比较

为确定湖北仙桃一团头鲂(Megalobrama amblycephala)专养池塘的发病病原体及病原特征, 并从全基因组层面初步分析该病原菌的毒力和耐药特征, 本研究从患病团头鲂的肝脏分离得到一株病原菌 LHW39, 经理化性状及 16S rRNA 鉴定, 表明 LHW39 为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)。多序列分型结果显示 LHW39 属于嗜水气单胞菌 ST251 型克隆群, 该克隆群是导致中国和美国地区鱼类暴发气单胞菌败血症(motile Aeromonas septicemia, MAS)的流行菌株群。回归感染实验证实菌株 LHW39 是引起本次团头鲂患病的病原菌; LHW39 对斑马鱼(Danio rerio)的半致死剂量为 1.55×105 CFU/尾, 表明 LHW39 为高毒力菌株。药敏实验显示, LHW39 对头孢噻吩耐药。全基因组测序结果发现, LHW39 全基因组大小为 5099855 bp, GC 含量为 60.80%, 共预测到 4572 个编码序列(CDS), GenBank 登录号 CP050012。基因组毒力基因比较分析结果显示: LHW39 与其他 ST251 型菌株相似, 基因组中含有丰富的毒力基因, 并且含有 VI 型分泌系统(T6SS); 此外, 聚类热图暗示 ST251 克隆群中菌株毒力相关基因的进化可能与菌株分离的地理位置和感染的宿主存在关联。基因组原噬菌体预测结果显示, LHW39 基因组中含有一个长度为 30.2 kb 的完整原噬菌体 phAhLHW39, 其在 ST251 型菌株中相当保守、并且是 ST251 型菌株所特有。耐药基因分析结果表明, LHW39 中含有抗磺胺类、喹诺酮类、四环素类、头孢类和碳青霉烯类等抗生素的相关基因, 这些基因在 ST251 型菌株中高度保守。本研究对致病性嗜水气单胞菌 LHW39 进行了病原学及全基因组比较分析, 为防控鱼类嗜水气单胞菌感染提供了一定的参考依据。     

鲤嗜水气单胞菌感染症及其病原生物学特性

对一起养殖鲤(Cypr inus carp io )发生的病害进行了发病情况、临床特征、病理变化等方面的检验。以3尾病(死)鲤进行病变组织中的细菌检查及细菌分离, 对分离菌进行了形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定; 同时选择代表菌株进行了16S rRNA 基因的分子鉴定, 测定了16S rRNA 基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树。结果表明, 分离菌为气单胞菌属(Aeromonas K luyv er and Van N iel 1936) 的嗜水气单[A.hydrophila (Chester 1901) Stan ier 1943] , 代表菌株( HC060718- 1株) 16S rRNA基因序列长度( 不包括引物结合区)为1 454 bp( GenBank登录号: EF669478)。择代表菌株做对健康鲤的人工感染试验, 表明了分离鉴定的嗜水气单胞菌在被检鲤病例的相应原发病原学意义及较强的致病作用。药敏试验结果显示, 对供试37种抗菌药物中的头孢噻肟等23种药物高度敏感, 对氨苄青霉素等5种药物敏感, 对青霉素G等9种药物耐药。     

Immune protection in carp, Cyprinus carpio L., after immunization with Aeromonas hydrophila crude lipopolysaccharide

Abstract. Vaccination with crude lipopolysaccharide (LPS) induced better protection against infection with Aeromonas hydrophila in carp than vaccination with formalin killed vaccine. Dipping fish in vaccine for 2 h at 25°C was more effective than intraperitoneal injection of the vaccine in procedural simplicity, lower stress loading and the degree of protection acquired. In carp immunized with crude LPS by the dip method, antibodies were not detected by bacteriai agglutination, passive haemagglutination and the agar diffusion tests. The results indicate that the protection against A. hydrophila infection in carp is not dependent on humoral immunity.     

银鲫肠道内抑制嗜水气单胞菌的潜在益生菌筛选及其特性研究

从养殖的银鲫(Carassius auratus gibelio)肠道中分离纯化得到60株具有不同特征的菌株,以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为指示菌,点种法初筛得到12株菌株,再通过牛津杯实验筛选出4株对嗜水气单胞菌有明显抑制作用(抑菌圈直径在14 mm以上)的益生菌疑似株,并进行了耐热试验、耐酸试验和人工肠液耐受试验,筛选出最符合益生菌功能特性的菌株YJ-9。该菌株在90℃高温水浴30 min后相对存活率为1.51%,在pH3的液体培养基中4 h内相对存活率为8.37%,活菌数都保持在106 CFU/mL以上,并且可以在人工模拟肠液中缓慢生长。在急性毒力实验中,10倍于实验剂量的菌株YJ-9对银鲫无毒,动物保护实验证明菌株YJ-9能有效增强银鲫对嗜水气单胞菌的免疫抵抗力,相对保护率达到80%。研究结果表明,菌株YJ-9可以作为一个新的饲用微生态制剂候选菌种。     

luxR基因调控嗜水气单胞菌耐药性的分子机制初探

LuxR家族蛋白是一类在革兰氏阴性细菌中发挥重要作用的调控蛋白，参与细菌多项重要生理活动。采用RNAi技术构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) luxR05735稳定沉默菌株luxR05735-RNAi，并利用qRT-PCR检测基因沉默效果。结果显示，与野生株相比，沉默株中luxR05735的表达量降低了96.8%。药物敏感性实验表明，与野生株相比，luxR05735-RNAi对庆大霉素、诺氟沙星、卡那霉素、吡哌酸的耐药性显著降低。对野生株与沉默株luxR05735-RNAi的转录组数据进行分析发现，表达差异显著的基因共有1286个，其中，上调基因353个，下调基因933个；显著富集的通路4条，分别是核糖体通路、精氨酸生物合成通路、硫代谢通路、硒化合物代谢通路；在这4条通路中可能与嗜水气单胞菌耐药性相关的重要功能基因包括metE、glnA、rplB、rplX、rpsA、rpsJ等，这些功能基因编码的蛋白主要与细菌的生物成膜及核糖体蛋白合成相关。综合以上研究结果，可以推测嗜水气单胞菌的luxR05735通过调控细菌的生物膜形成相关基因及核糖体蛋白相关基因的表达，从而调控细菌对药物的耐受性。     

大黄鱼致病嗜水气单胞菌的分离鉴定及其多克隆抗体制备

为探究引起网箱养殖大黄鱼肠炎病的病原及其特性,自患病大黄鱼肝脏组织分离到1株优势菌NDLc-P,经回归感染试验确认该菌为大黄鱼致病菌.人工感染7 d后,该菌对体质量(46.4±3.5)g的健康大黄鱼的半数致死密度为3.98×107 cf u/m L,表明该菌株对大黄鱼有一定的致病性.利用梅里埃微量多项鉴定系统对病原菌N...