鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对牙鲆免疫效果的初步研究

为研究鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗对牙鲆的免疫效果,用该种疫苗对牙鲆进行了免疫试验.给牙鲆注射鱼肠道弧菌外膜蛋白疫苗,饲养25 d后分别用鱼肠道弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌进行攻毒,20 d后分别统计各组鱼的免疫保护率.结果表明,该疫苗对鱼肠道弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为84.6%、30.8%、33.3%.     

鲖爱德华菌口服疫苗对斑点鲖的免疫效果

为评价鲖爱德华菌口服微球疫苗对斑点鲖的免疫效果,实验以天然高分子聚合物海藻酸钠和鲖爱德华菌灭活疫苗为材料,制备鲖爱德华菌口服微球疫苗。将实验动物随机分为鲖爱德华菌微球疫苗组、鲖爱德华菌灭活疫苗组、空微球组和对照组,以拌料口服方式进行免疫,通过检测血清中溶菌酶活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、补体替代途径(ACH50)活性等非特异性免疫指标,抗体效价以及相对免疫保护率评价疫苗免疫效果,采用荧光定量PCR检测口服疫苗对斑点鲖免疫相关基因表达量的影响。结果显示,鲖爱德华菌口服微球疫苗能够较长时间增强斑点鲖非特异性免疫功能;血清凝集效价于第5周达到峰值,为1∶16,免疫后第7周仍可检测到特异性抗体;口服鲖爱德华菌微球疫苗的斑点鲖获得的抗鲖爱德华菌相对免疫保护率为60.7%,远高于灭活疫苗组(14.3%)及空微球组(10.7%);荧光定量分析结果显示,攻毒后48 h相比攻毒前各免疫基因表达量均有上调,鲖爱德华菌微球疫苗对受免鱼肾脏、脾脏中免疫基因的表达影响尤为明显。结果表明,鲖爱德华菌口服微球疫苗能增强斑点鲖非特异性免疫功能,对鲖爱德华菌病起到一定的预防作用。     

异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果

为了研究异源无乳链球菌胞外产物灭活疫苗免疫罗非鱼后的免疫效果, 本研究采用 10%甲醛溶液灭活法制备了无乳链球菌 HN0901 和 GX1101 胞外产物灭活疫苗, 通过腹腔注射途径免疫健康奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus♀×O.aureus♂), 在免疫后 28 d 用同/异源无乳链球菌攻毒, 测定了免疫后和攻毒后罗非鱼的免疫应答反应和血清抗体效价, 并比较了罗非鱼在腹腔注射 1×108 CFU/尾无乳链球菌后的相对免疫保护率和交叉免疫保护率。 结果显示, 免疫鱼谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)在免疫后 28 d 显著高于对照组, 但在攻毒后显著低于对照组; 与对照鱼相比, 免疫鱼的超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)水平在免疫和攻毒后均有不同程度的提高, 丙二醛(MDA)显著降低(P＜0.05)。实时定量 PCR 结果显示, 炎性细胞因子基因 TNF-α、IL-1β 和 TGF-β, 体液免疫相关基因 HSP70, MHC Ⅱ和 IgM 在免疫和攻毒后也呈现显著升高趋势, 并显著高于对照组(P＜0.05)。血清抗体效价于免疫后第 28 天达到 1∶6400, 显著高于对照组(P＜0.05)。攻毒实验结果显示, 免疫组在同源和异源无乳链球菌攻毒后相对的免疫保护率在 31.6%~47.4%。结果表明, 研制的灭活疫苗免疫罗非鱼后, 能够显著诱导罗非鱼体内的免疫应答, 产生中等疫苗效力, 对同/异源无乳链球菌都具有免疫保护能力。本研究结果为深入研究罗非鱼链球菌病的免疫预防技术和研制二价疫苗奠定了基础。     

嗜水气单胞菌疫苗免疫效果研究

选取对鲤鱼毒力强的嗜水气单胞菌菌株制成灭活疫苗,研究疫苗的免疫保护效应.采用甲醛灭活制备疫苗,分别对鲤鱼进行注射和浸泡试验,测定白细胞吞噬活性、淋巴细胞转化能力、血清、皮肤黏液的抗体效价及活菌攻毒后的免疫保护率.结果表明,受免鱼各项指标均明显高于对照组,注射组免疫保护率达90%,其中浸泡组各项略低于注射组.嗜水气单胞菌灭活疫苗对鲤鱼有显著免疫保护效应,可作为预防细菌性败血症感染的疫苗.     

鳗弧菌灭活疫苗对牙鲆免疫效果的研究

制备鳗弧菌福尔马林灭活的全细胞疫苗，腹腔注射接种牙鲆，50d后进行第2次免疫。利用自制的兔抗鱼血清的抗血清通过ELISA实验检测了受免鱼特异性免疫应答水平，并通过攻毒实验，测定了疫苗对牙鲆的免疫保护率。结果表明，各免疫组血清抗体效价的最高值分别达1：512、1：2048、1：1024；各组受免鱼对人工攻毒均具有保护作用。用鳗弧菌攻毒后，免疫保护率分别达81．25％、87、50％、93．75％，而且发现受免鱼对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)也表现了一定的交叉保护性，免疫保护率分别为46．15％、53．85％、53．85％。     

大鲵虹彩病毒病灭活疫苗安全性与免疫效力研究

为了探明大鲵虹彩病毒病灭活疫苗的安全性与免疫效力,采用β-丙内酯(β-propiolactone, BPL)灭活鲤上皮瘤细胞(Epithelioma papilloma cyprini,EPC)内增殖的大鲵虹彩病毒(giant salamander iridovirus, GSIV),制备成大鲵虹彩病毒病灭活疫苗,利用免疫剂量为1.0×10~6 TCID_(50)/mL的灭活疫苗腹腔注射健康大鲵(Andrias davidianus),研究疫苗的安全性和免疫效力。结果显示:一次单剂量注射、单剂量重复注射和超剂量注射后,大鲵的行为和摄食均正常,未见不良反应,证明了制备的大鲵虹彩病毒病灭活疫苗安全;用不同剂量的疫苗(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/尾)免疫健康大鲵,在免疫后第28 d用GSIV进行攻毒,当免疫剂量为0.1 mL/尾时,相对免疫保护率为44.44%,其它4种免疫剂量的相对免疫保护率相似,均高于70%。大鲵在免疫后7 d已开始产生免疫应答,21 d血清抗体效价达到最高值252.48±28.01。在免疫后两周内,MyD88基因、TLR9基因和MHCIIA基因均显著上调。免疫后150 d进行攻毒实验,大鲵的相对免疫保护率为62.5%。二次免疫实验中,大鲵分别在第一次免疫7、14、21、28、56 d后进行第二次免疫。结果显示,第一次免疫21 d后进行二次免疫,其血清抗体效价可以较长时间维持在最高水平,最高血清抗体效价为274.37±25.23,第二次免疫后的第150 d用GSIV进行攻毒,存活率为86.67%。研究结果表明,大鲵虹彩病毒病灭活疫苗最佳免疫方式为腹腔注射疫苗0.2 mL/尾后,21 d进行第二次免疫,免疫剂量为0.2 mL/尾。     

鳗弧菌和溶藻弧菌二联疫苗对大菱鲆的免疫效果

将鳗弧菌（Vibrio anguillarum）和溶藻弧菌（V.alginolyticus）分别用0.3%福尔马林灭活,制备成鳗弧菌和溶藻弧菌2种单苗,并将2种菌等量配制成二联疫苗,单次腹腔注射免疫大菱鲆（Scophtalmus maximus）.通过检测免疫后替代途径补体活力、溶菌酶活力、抗体凝集效价的变化并分别进行攻毒实验比较疫苗的免疫效果.结果显示,3种疫苗对所测定的各免疫指标都有一定的促进作用,但二联疫苗后期效果低于2种单苗.二联疫苗对鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为83.52%和83.24%,而鳗弧菌单苗对鳗弧菌攻毒、溶藻弧菌单苗对溶藻弧菌攻毒的免疫保护率分别为80.37%和74.89%.可以认为2株菌具有制备二联疫苗的可能性.[中国水产科学,2006,13（3）：397-402]     

抗黄颡鱼“红头病”功能性蛋粉的制备及其应用

为了评价抗爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)的特异性Ig Y的功能性蛋粉在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)"红头病"预防及治疗中的应用效果,采用灭活的爱德华氏菌(菌种保藏号:CCTCCNO:M2012024)免疫蛋鸡,通过微包膜及高速离心喷雾干燥技术制备抗爱德华氏菌的特异性Ig Y的功能性蛋粉,采用泼洒和口服两种方式检测该功能性蛋粉对黄颡鱼的免疫保护率。结果显示,所制备的功能性蛋粉抗体效价达到1∶5120;以剂量为2 mg/L功能性蛋粉连续泼洒水体3 d或以饲料重量0.2%的剂量口服14 d后,再用浓度为2.0×107CFU/m L的致病性爱德华氏菌对健康黄颡鱼进行攻毒,泼洒和口服功能性蛋粉对黄颡鱼的免疫保护率分别为85.5%和70.0%;对人工感染爱德华氏菌后患病的黄颡鱼养殖水体连续泼洒5 d或投喂14 d功能性蛋粉,其对黄颡鱼的免疫保护率分别为67.2%和40.7%,表明制备的功能性蛋粉对黄颡鱼"红头病"有很好的预防和治疗效果。     

鳗弧菌L-18株的限铁条件和铁调节外膜蛋白的免疫效果

利用Western-blot技术,对鳗弧菌L-18株的OMPs和IROMPs的免疫反应性进行了分析,并通过免疫牙鲆比较二者免疫保护力的差异,以期从IROMPs方向探索开发鳗弧菌新型鱼用疫苗,并为研究其免疫原理提供重要的科学依据。结果表明,培养基中加入不同浓度的联铁剂,鳗弧菌L-18株的生长和铁载体的表达出现规律性变化,其中加入100~130μmol.L-12,2′-联吡啶为最适合限铁条件,此时铁载体的表达量最高且生长受抑制程度较小。在此条件下,菌株表达出74.3 ku和77.4 ku的IROMPs,其中77.4 ku蛋白具有免疫反应性,为重要抗原。用全菌灭活疫苗、OMPs、IROMPs分别腹腔注射免疫牙鲆7周后攻毒,IROMPs疫苗的相对免疫保护力达到75.9%,远高于OMPs疫苗的51.8%。相对于OMPs,IROMPs的抗体效价显著提高,接近全菌疫苗组的水平,而血清杀菌活力没有显著变化。     

鳗弧菌L-18株的限铁条件和铁调节外膜蛋白的免疫效果研究

利用Western-blot技术，对鳗弧菌L-18株的OMPs和IROMPs的免疫反应性进行了分析，并通过免疫牙鲆比较二者免疫保护力的差异，以期从IROMPs方向探索开发鳗弧菌新型鱼用疫苗，并为研究其免疫原理提供重要的科学依据。结果表明，培养基中加入不同浓度的联铁剂，鳗弧菌L-18株的生长和铁载体的表达出现规律性变化，其中加入100~130μmol·L-1 2,2’-联吡啶为最适合限铁条件，此时铁载体的表达量最高且生长受抑制程度较小。在此条件下，菌株表达出74.3ku和77.4ku的IROMPs，其中77.4ku蛋白具有免疫反应性，为重要抗原。用全菌灭活疫苗、OMPs、IROMPs分别腹腔注射免疫牙鲆7周后攻毒， IROMPs疫苗的相对免疫保护力达到75.9%，远高于OMPs疫苗的51.8%。相对于OMPs，IROMPs的抗体效价显著提高，接近全菌疫苗组的水平，而血清杀菌活力没有显著变化。 关键词：鳗弧菌；铁调节外膜蛋白；牙鲆     

日本鳗鲡腐皮病病原菌的分离及鉴定

从患腐皮病的日本鳗鲡(Anguilla japonica)体表溃烂处分离到1株病原菌(322A),对其进行了人工感染实验和生理生化分析,测定了该菌株的16S rRNA基因序列和促旋酶(gyrase)B亚单位gyrB基因序列,并分别构建系统发育树。结果显示:感染实验证实菌株322A具有致病性;生理生化分析鉴定该菌株属于气单胞菌属(Aero-monassp.);16S rRNA基因分析显示,该菌株与气单胞菌属细菌的同源性均在99%~100%,构建的系统树显示,菌株322A与嗜水气单胞菌(A.hydrophila(FJ462702))亲缘关系最近;gyrB基因分析表明,该菌株与A.hydrophila种内序列的相似性为96%~98%,种间序列的相似性为94%~95%,构建的系统树结果显示,该菌株与A.hydrophila(FJ608553、FJ608552、AF208259)聚为一个分支。综合上述实验结果,菌株322A可鉴定为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。     

载铜蒙脱石对嗜水气单胞菌粘附尼罗罗非鱼上皮细胞的影响

采用尼罗罗非鱼上皮细胞培养模型，观察嗜水气单胞菌对鳃上皮、皮肤上皮、肠上皮细胞的粘附率，研究载铜蒙脱石对细菌粘附的阻断作用及其对细菌粘附引起鱼上皮细胞膜生物特性变化的影响。结果显示：嗜水气单胞菌与鱼上皮细胞均有不同程度的粘附作用，粘附率大小顺序为鳃上皮〉皮肤上皮〉肠上皮细胞。载铜蒙脱石均显著降低了嗜水气单胞菌对鳃、皮肤和肠上皮细胞的粘附率（P〈0．05），而且对不同上皮细胞的粘附阻断率无显著差异。嗜水气单胞菌粘附肠上皮细胞后细胞膜生物特性发生了显著变化，与正常对照组相比，嗜水气单胞菌粘附鱼上皮细胞后，胞浆游离钙和细胞膜磷脂酶A2活性显著上升。载铜蒙脱石可显著降低由于嗜水气单胞菌粘附鱼上皮细胞引起的胞浆游离钙和细胞膜磷脂酶A2活性的升高。结果表明，载铜蒙脱石可有效阻断病原菌粘附，从而防治细菌感染和细菌移位。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

PCR扩增特异性16SrDNA和溶血素基因检测致病性嗜水气单胞菌

根据已发表的气单胞菌16S rDNA基因序列及气单胞菌气溶素(aerolysin)基因序列，设计了2对引物，建立了检测致病性嗜水气单胞菌的PCR方法。通过对12株气单胞菌的检测，发现16S rDNA引物具有高度的特异性，仅对嗜水气单胞菌扩增阳性。而Aero基因引物检测结果与采用生物学方法(鲜血平板法)检测的结果符合率为97．2％，且具有高度的敏感性，可检测最低1fg的模板。将16S rDNA与Aero基因结合PCR方法检测致病性嗜水气单胞菌与用致病性嗜水气单胞菌检测试剂盒的符合率为94．4％。该方法的建立为致病性嗜水气单胞菌的检测提供了一种简便、快速的途径，是一种比较实用的致病性嗜水气单胞菌的检测方法。     

Antibacterial abilities of intestinal bacteria from larval and juvenile Japanese flounder against fish pathogens

The present study was undertaken to examine the antibacterial abilities of intestinal bacteria isolated from juveniles and larvae of Japanese flounder Paralichthys olivaceus . Newly hatched larvae of flounder were held in a 100 L plastic circular tank and fed rotifiers, Artemia nauplii and commercial feeds, depending on the developmental stage of the fish. Genera Aeromonas , Moraxella and Vibrio were predominantly isolated from the intestinal tracts of Japanese flounder at larval and juvenile stages, whereas Aeromonas , Bacillus , coryneforms, Moraxella , Pseudomonas and Vibrio were detected at high densities in live diets and artificial feeds. Antibacterial bacteria accounted for 1.7–24.3% of the intestinal isolates against Lactococcus garvieae , Pasteurella piscicida , Vibrio anguillarum and V. vulnificus . In particular, as much as 53.3% of Vibrio spp. other than Vibrio -swarmer isolated from 197-day-old juveniles inhibited the growth of P. piscicida . These results suggest that intestinal bacteria having antibacterial activity play a role in the prevention of infectious diseases.     

1株嗜水气单胞菌的拮抗菌鉴定及其特性研究

从池塘养殖的团头鲂(Megalobrama amblycephala)肠道中分离筛选出15株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)拮抗菌,其中菌株S24在平板贴片试验中对供试的嗜水气单胞菌菌株具有稳定和较高的拮抗作用。综合形态学观察、生理生化指标检测及分子序列(16S rDNA,gyrB)分析,将菌株S24确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。拮抗菌S24和嗜水气单胞菌(菌株43)的共凝集率为(36.0%±4.3%)。共培养试验可见拮抗菌S24能明显抑制嗜水气单胞菌43的增殖;共培养18 h时,嗜水气单胞菌43的细胞数量达到最低。试验结果表明,拮抗菌株S24适宜作为潜在防治嗜水气单胞菌病的益生菌。     

水产致病性嗜水气单胞菌耐药性比较与分析

对15株分离自甲鱼、草鱼、鲫鱼、石蛙、团头鲂和三角鲂的嗜水气单胞菌,用K-B纸片法对18种抗生素进行药敏试验后,用NCCLS标准进行判断,结果输入WHONET5.4耐药监测软件,比较15株菌的耐药水平及18种抗生素的耐药率,并对四环素和强力霉素表现出来的交叉耐药性进行分析,结果表明,15株嗜水气单胞菌耐药现象较为严重,恩诺沙星、四环素、强力霉素和利福平耐药率均超过40%,WHONET5.4散点图表明四环素和强力霉素有较为密切的交叉耐药现象。     

Dominant pathogenic species of mesophilic aeromonads isolated from diseased and healthy fish cultured in Poland

Aeromonas isolates were collected from cultured fish, characterized phenotypically and identified to species using 16S rDNA. The pathogenicity of all isolates was assayed on the basis of haemolytic and proteolytic activity and challenge tests were performed for isolates from healthy fish. A total of 131 Aeromonas isolates were obtained and identified as follows: A. hydrophila (13), A. bestiarum (23), A. salmonicida (motile biogroup) (19), A. caviae (2), A. sobria (18), A. veronii bt. sobria (42), A. jandaei (1), A. encheleia (11) and A. allosaccharophila (2). All isolates of A. hydrophila and A. bestiarum and most isolates of A. salmonicida and A. veronii were classified as pathogenic. Aeromonas hydrophila was isolated only from diseased trout except for one isolate obtained from carp fry. The other potentially pathogenic Aeromonas species were present in diseased as well as healthy fish. The pathogenicity of isolates from healthy fish was correlated with their enzymatic activity and was also tested by challenge experiments. The dominant pathogenic species were A. veronii bt. sobria, A. bestiarum and A. salmonicida in common carp and A. hydrophila in rainbow trout.     

不同来源嗜水气单胞菌外膜蛋白基因检测及序列分析

采用PCR方法,对分离于发病宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)、鲤(Cyprinus carpio)的42株致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了外膜蛋白(OMP)基因的检测;将代表菌株的外膜蛋白基因通过DNAStar软件与GenBank中报道的4株嗜水气单胞菌(FJ437030.1、AF183931.1、AF276639.2、CP000462.1)和1株温和气单胞菌(A.sobria,FJ437029.1)参考菌株进行了核苷酸同源性比较分析。结果表明,所检不同来源嗜水气单胞菌的OMP基因携带率为100%;所测代表菌株的OMP基因与参考菌株的同源性在86.0%～99.2%之间。所测得的不同来源嗜水气单胞菌OMP基因的同源性98.3%～100%,其中分离于宽体金线蛭的HTQ010505-1与青鱼的HL060811-4两菌株间同源性高达100%。     

养殖欧洲鳗鲡体表溃疡病病原菌的分离、鉴定及药敏试验

从福建诏安患病的人工养殖欧洲鳗鲡体内分离到1株致病菌,人工回归感染实验显示分离的菌株能使欧洲鳗鲡致病死亡,且临床症状与自然病例相似。分离菌具有β-溶血性;可在含盐量4%的培养基上生长;革兰氏染色呈阴性,短杆状,具有运动性;其生化反应特性与其他水生动物源的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)相同;16S rRNA基因序列分析结果显示:分离菌株在系统发育树上与A.hydrophila属同一分支,相似性达99.8%。根据分离菌株的形态、生理生化特性,结合16S rRNA序列测定(GenBank登录号为JN391411)与系统发育分析,将其鉴定为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。药敏试验结果表明分离菌对头孢噻肟钠、氟苯尼考、复方新诺明、奥复星、头孢吡肟、头孢孟多、左氟沙星等高度敏感。