中药余甘子对猪腹泻病原菌体外抑制作用的研究

猪腹泻病一般由病毒和细菌混合感染引起，严重影响生猪健康，目前主要采用大剂量抗生素来进行治疗，但易产生副作用。寻找中药来替代抗生素治疗猪腹泻病，是生猪养殖业发展的大方向和迫切需求。研究将中药余甘子、诃子用中性去离子水索氏提取4～6 h,螃蟹甲、多刺绿绒蒿用无水乙醇索氏提取6 h,蒸干溶剂，收率分别为10.5%、10%、11%和10%。将余甘子、诃子用水稀释，螃蟹甲、多刺绿绒蒿用5%吐温80水溶液稀释得到试验用药物贮存液，采用试管法测定余甘子及它与其他中药的组合对猪腹泻病原菌(大肠杆菌，猪霍乱沙门氏菌，以及这2种细菌混合菌)的最低抑菌浓度，结果显示：余甘子对猪腹泻病原菌有较强的抑菌作用。诃子、螃蟹甲、多刺绿绒蒿与余甘子的多种药物组合也有较强的抑菌作用，多数能协同余甘子抑制猪腹泻常见病原菌。     

猪δ冠状病毒重庆流行株的诊断与N基因序列分析

2023年重庆市某规模化养猪场猪群发生腹泻疫情,通过临床观察、RT-PCR检测、N基因克隆测序及序列分析对采集的腹泻仔猪肠道组织进行鉴定。结果显示,发病猪水样腹泻,小肠壁变薄、黏膜充血;成功检测到1株猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus, PDCoV),命名为CQ2023株。该毒株N基因序列全长1 029 bp,与30株GenBank中登录的参考毒株N基因序列比对显示,核苷酸序列相似性为96.7%～99.4%,其中PDCoV CQ2023株与CHN-HeN06-2022株的相似性最高,为99.4%。遗传进化分析显示PDCoV CQ2023株属于国内流行株,与国内PDCoV毒株CHN-HeN06-2022等处于同一进化分支,亲缘关系最近。该次研究成功鉴定出该猪场腹泻疫情由PDCoV感染引起,并进行了N基因序列分析,为PDCoV的流行病学研究、遗传进化、预防及诊断试剂的研究提供数据支持。     

密码子优化的RHDV2双VP60基因重组杆状病毒构建及表达蛋白免疫原性分析

【目的】试验旨在优化兔出血症病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus 2,RHDV2)病毒样颗粒(virus-like particle, VLP)疫苗的制备策略,探究RHDV2 VLP疫苗对家兔的免疫原性,为低成本、高产量RHDV2新型疫苗研发提供新思路。【方法】根据昆虫细胞的密码子偏好性优化合成RHDV2 VP60全基因,将双VP60基因插入真核载体pFastBac^TM Dual,转化携带Bacmid质粒的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,构建含双VP60基因的重组杆粒Bacmid-VP60-VP60,转染Sf9昆虫细胞,通过Western blotting、间接免疫荧光试验(IFA)及透射电镜对重组杆状病毒Bacmid-VP60-VP60进行表达验证;将优化策略制备的重组蛋白抗原与氢氧化铝佐剂按照9∶1比例制备VLP灭活疫苗,通过安全性检验、最小免疫剂量、免疫持续期等评估优化策略制备的RHDV2 VLP疫苗的保护效果。【结果】试验成功构建重组杆粒Bacmid-VP60-VP60。Western blotting鉴定结果显示,...     

三株递呈猪流行性腹泻病毒S基因的减毒鼠伤寒沙门菌的生物学特性研究

为了探究减毒沙门菌递呈不同长度猪流行性腹泻病毒(PEDV)S基因的可行性,本研究对3株携带不同长度S基因片段的减毒鼠伤寒沙门菌进行了生物学特性评估。主要进行了对所构建的重组减毒沙门菌菌株SL7207(pVAX-S499-650)(长456bp,编码S蛋白N末端499—650位氨基酸)、SL7207(pVAX-S499-789)(长873bp,编码S蛋白N末端499—789位氨基酸)和前期构建的菌株SL7207(pVAXD-S1-789)(长2 367bp,编码S蛋白N末端1—789位氨基酸)的生物学特性研究,包括生长曲线测定、携带质粒的体内/外稳定性、回肠组织内的转录、在小鼠体内动态增殖规律、小鼠口服的安全性等。结果表明:SL7207(pVAX-S499-650)、SL7207(pVAX-S499-789)、SL7207(pVAXDS1-789)3种口服菌株均具有较高的稳定性;携带的目的基因可在肠道组织内转录;菌株在小鼠肝、脾中增殖约5周后逐渐被机体清除;小鼠口服具有良好的安全性。本研究结果表明减毒鼠伤寒沙门菌SL7207可递呈不同长度的S基因抗原片段,为后续开展3种菌株的实际口服免疫效果比较研究奠定了基础。     

鲖爱德华菌口服疫苗对斑点鲖的免疫效果

为评价鲖爱德华菌口服微球疫苗对斑点鲖的免疫效果,实验以天然高分子聚合物海藻酸钠和鲖爱德华菌灭活疫苗为材料,制备鲖爱德华菌口服微球疫苗。将实验动物随机分为鲖爱德华菌微球疫苗组、鲖爱德华菌灭活疫苗组、空微球组和对照组,以拌料口服方式进行免疫,通过检测血清中溶菌酶活力、总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力、补体替代途径(ACH50)活性等非特异性免疫指标,抗体效价以及相对免疫保护率评价疫苗免疫效果,采用荧光定量PCR检测口服疫苗对斑点鲖免疫相关基因表达量的影响。结果显示,鲖爱德华菌口服微球疫苗能够较长时间增强斑点鲖非特异性免疫功能;血清凝集效价于第5周达到峰值,为1∶16,免疫后第7周仍可检测到特异性抗体;口服鲖爱德华菌微球疫苗的斑点鲖获得的抗鲖爱德华菌相对免疫保护率为60.7%,远高于灭活疫苗组(14.3%)及空微球组(10.7%);荧光定量分析结果显示,攻毒后48 h相比攻毒前各免疫基因表达量均有上调,鲖爱德华菌微球疫苗对受免鱼肾脏、脾脏中免疫基因的表达影响尤为明显。结果表明,鲖爱德华菌口服微球疫苗能增强斑点鲖非特异性免疫功能,对鲖爱德华菌病起到一定的预防作用。     

高致病性维氏气单胞菌胞外产物对斑点鲖的致病性

为了研究维氏气单胞菌及其胞外产物的致病机制对预防和治疗斑点鲖维氏气单胞菌病的作用。通过对一株高致病性斑点鲖源维氏气单胞菌胞外产物(extracellular product,ECP)的提取并结合体内外实验研究其酶活性与致病性,以期为维氏气单胞菌的致病机制研究提供新思路。采用饱和硫酸铵沉淀法,对一株高致病性的斑点鲖源维氏气单胞菌的ECP进行了提取,将其进行浓度检测、SDS-PAGE分析和酶活测定;并将提取的ECP攻毒斑点鲖,通过病理学分析研究其致病机制。提取的ECP经考马斯亮蓝试剂盒确定其浓度为0.743 mg/m L;SDS-PAGE分析发现该ECP类型丰富,分子大小主要集中在20.0~33.0 ku。运用琼脂平板扩散法对ECP中主要毒力和代谢相关酶活性进行体外测定,发现ECP具有脂酶、蛋白酶、卵磷脂酶、DNA酶和溶血活性,不具有淀粉酶、明胶酶、脲酶活性;并对与毒力密切相关的溶血活性进行了进一步的溶血谱绘制,发现ECP对其他多种动物红细胞都有溶血活性,对鱼类红细胞溶血性较强,但对鸡、鸭红细胞无溶血活性。ECP攻毒健康斑点鲖后,发现其具有明显致病性,死亡率高达100%。病鱼大体病理变化为体表黏液增多,出现褪色斑以及不同程度的出血斑;眼球充血;肛门红肿外凸;剖检病变表现:鳃丝充血肿胀、肝脏肿大、散在少量出血点,脾脏肿大暗红,肠道扩张、肠壁变薄、肠腔内有大量黄色黏液。组织学病变主要表现为肝细胞变性、坏死;脾脏淋巴细胞减少,大量结缔组织增生;胃、肠道黏膜上皮坏死脱落。该株维氏气单胞菌的胞外产物具有多种酶活性,且对斑点鲖具有明显的致病性,推测该胞外产物在维氏气单胞菌入侵、感染甚至致死斑点鲖过程中都发挥了重要作用。