不同来源嗜水气单胞菌耐药基因检测

采用PCR方法,对分离于唐山和秦皇岛养殖场的宽体金线蛭(Whitmania pigra)、中国林蛙(Rana temporaria chensinensis)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellua)、青鱼(Mylopharyngodon piceus)以及鲤(Cyprinus carpio)肝脏的42株不同水产养殖动物的致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行了4种耐药基因β-内酰胺类(TEM)、氨基糖苷类(ant(3″)-I)、磺胺类(Sul3)和四环素类(tet(A))的检测。结果表明:42株嗜水气单胞菌均100%携带TEM、ant(3″)-I和Sul3,不携带tet(A)。所检不同水产动物源嗜水气单胞菌均携带TEM、ant(3″)-I及Sul3耐药基因,从分子层面表明该致病菌多重耐药或潜在耐药严重。     

日本鳗鲡腐皮病病原菌的分离及鉴定

从患腐皮病的日本鳗鲡(Anguilla japonica)体表溃烂处分离到1株病原菌(322A),对其进行了人工感染实验和生理生化分析,测定了该菌株的16S rRNA基因序列和促旋酶(gyrase)B亚单位gyrB基因序列,并分别构建系统发育树。结果显示:感染实验证实菌株322A具有致病性;生理生化分析鉴定该菌株属于气单胞菌属(Aero-monassp.);16S rRNA基因分析显示,该菌株与气单胞菌属细菌的同源性均在99%~100%,构建的系统树显示,菌株322A与嗜水气单胞菌(A.hydrophila(FJ462702))亲缘关系最近;gyrB基因分析表明,该菌株与A.hydrophila种内序列的相似性为96%~98%,种间序列的相似性为94%~95%,构建的系统树结果显示,该菌株与A.hydrophila(FJ608553、FJ608552、AF208259)聚为一个分支。综合上述实验结果,菌株322A可鉴定为嗜水气单胞菌(A.hydrophila)。     

罗非鱼嗜水气单胞菌气溶素毒素基因的克隆及功能分析

根据已发表的嗜水气单胞菌气溶素(Aer)毒素基因的序列,设计1对特异性引物,应用PCR技术,扩增GXL3、GXL5、GXL9共3株罗非鱼嗜水气单胞菌的气溶素成熟蛋白基因,克隆到pMD18-T载体上进行序列测定.测序结果表明,3个菌株Aer毒素成熟蛋白的核苷酸序列为1 335bp,编码445个氨基酸,其与分离株No.BAA83088的成熟蛋白基因的核苷酸序列及推导的氨基酸序列的同源性分别为90.9%、91.4%、91.4%和96.2%、96.6%、96.6%,具有很高的同源性.应用分子生物软件分析广西分离株GXL9 Aer成熟蛋白,该蛋白无跨膜区,拥有较多的疏水区和抗原位点,等电点为5.5.     

虹鳟源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)分离及16SrRNA基因鉴定

从发病虹鳟(Oncorhynchus mykiss)肾脏组织中分离到了1株优势菌HZS-01,将分离纯化的菌株进行形态、生理生化特征研究和16S rRNA基因鉴定分析。结果显示,HZS-01株菌的形态和生理生化反应结果符合嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的特征。16S rRNA基因序列分析结果显示,分离菌株在系统发育树上与嗜水气单胞菌(A.hydrophila)属同一分支,同源性达99%以上。综合菌株HZS-01的形态学特征和16S rRNA基因分析结果,将其鉴定为嗜水气单胞菌。药敏试验结果表明,分离菌株对强力霉素、诺氟沙星、左氧氟沙星、新生霉素、阿奇霉素敏感度高,对生产用药预防和治疗有实际指导意义。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

池塘养殖中华绒螯蟹细菌性疾病病原的分离与鉴定

从安徽省当涂县和芜湖县池塘养殖患病中华绒螯蟹的肝脏和肌肉组织中分离到35株细菌,经人工感染试验证实DT9和WH21菌株为病原菌。细菌形态特征检查2菌株均为革兰氏阴性杆菌。细菌16S rRNA基因序列分析结果:2条扩增的基因序列长度均为1443bp,DT9菌株与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii,FJ490063)的亲缘关系最近,同源性为99.2%。WH21菌株与嗜水气单胞菌(A.hydrophila,AB680307)的亲缘关系最近,同源性为99.9%。     

鱼源气单胞菌的毒力基因检测、分型及致病力

为调查鱼源气单胞菌毒力基因与其致病力的相关性,以2009—2018年从不同患病鱼分离的173株气单胞菌为研究对象,通过检测毒力相关基因、测定溶血活性、腹腔注射感染异育银鲫等方法开展评价。通过管家基因gyrB分子鉴定结果显示,173株气单胞菌中维氏气单胞菌(119/173,68.9%)和嗜水气单胞菌(50/173,28.9%)是主要流行的菌株。10个毒力基因aer(162/173,93.64%)、act(131/173,75.72%)、ast(55/173,31.79%)、alt(58/173,33.53%)、lip(152/173,87.86%)、exu(154/173,89.02%)、fla(143/173,82.66%)、gcaT(148/173, 85.55%)、 eprCAI(41/173, 23.70%)和ahyB(51/173, 29.48%)普遍存在于173株气单胞菌中。依据检测到的毒力基因数量从多到少分布情况,这些菌株可分为7大类(Ⅰ～Ⅶ)53个毒力基因型。大部分嗜水气单胞菌检测到8～10个毒力基因,主要分布于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因型;维氏气单胞菌的eprCAI、ahyB、 ast和alt等4个毒力基因检测率低,主要分布于Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ类基因型。大部分气单胞菌(94.22%,163/173)具有溶血活性。代表性毒力基因型的38株维氏气单胞菌和20株嗜水气单胞菌腹腔注射异育银鲫攻毒结果显示,3.0×106 CFU/尾的剂量下,3株维氏气单胞菌使鲫死亡率达80%～100%,16株嗜水气单胞菌使鲫死亡率达90%～100%。研究表明,维氏气单胞菌是目前最主要流行的气单胞菌,但其检测到的毒力基因普遍少于嗜水气单胞菌,且对异育银鲫的致病力普遍弱于嗜水气单胞菌。本研究能够为气单胞菌败血症的流行病学调查和疫苗研究提供理论依据。     

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

1株嗜水气单胞菌的拮抗菌鉴定及其特性研究

从池塘养殖的团头鲂(Megalobrama amblycephala)肠道中分离筛选出15株嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)拮抗菌,其中菌株S24在平板贴片试验中对供试的嗜水气单胞菌菌株具有稳定和较高的拮抗作用。综合形态学观察、生理生化指标检测及分子序列(16S rDNA,gyrB)分析,将菌株S24确定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。拮抗菌S24和嗜水气单胞菌(菌株43)的共凝集率为(36.0%±4.3%)。共培养试验可见拮抗菌S24能明显抑制嗜水气单胞菌43的增殖;共培养18 h时,嗜水气单胞菌43的细胞数量达到最低。试验结果表明,拮抗菌株S24适宜作为潜在防治嗜水气单胞菌病的益生菌。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的克隆与序列分析

根据已发表的外膜蛋白基因ompⅡ的核苷酸序列设计引物，从分离 自患红底板病的中华鳖的嗜水气单胞菌中扩增得到了ompTS基因，对ompTS 基因进行序列分析，发现其与ompⅡ基因的核苷酸序列有83.5%的同源性。ompTS基因最长的开放阅读框（ORF）为1068nt，编码由355个氨基酸组成，分子量为38.9kDa的蛋白质OmpTS，其氨基酸序列的前20个氨基酸残基可能组成信号肽。由ompTS基因的编码氨基酸序列与其它细菌外膜蛋白的氨基酸序列的比较结果，进一步证实细菌外膜蛋白氨基酸序列的N端存在高度保守区。根据序列分析结果推测，ompTS基因很可能是一个新的基因，编码38.9kDa的嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpTS，该蛋白质在膜中极有可能形成孔道，具备与孔蛋白相似的性质。     

6株水产动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因的克隆与序列分析

根据气单胞菌主要黏附素基因（ahal）、溶血素基因（hly）和细胞兴奋性肠毒素基因（alt）完整开放阅读框（0RF）设计3对特异性引物，对6株气单胞菌安徽分离株进行ahal、hly和alt基因的PCR扩增、克隆和测序。测序结果显示，安徽分离株aim、hly和alt基因的ORF大小分别为1056--1068bp、1482bp和1104N1107bp，各编码351-355、493和367-368个氨基酸。序列分析显示：（1）属于alt^＋aim^＋hly^＋毒力基因型的3个安徽分离株间aha1核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均很高，分别为98.8％-99．3％和97％-97．6％，且与国内参考株mh／Trionyx sinensis／Guangzhou（Guangdong）／AF276639的同源性高达98．5％-99％和96.8％-97．6％。而alt^＋ahal^＋hly^-HA6安徽分离株与国外参考株Ah／Fish／Barcelona（Spain）／AF183931间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性较高，分别为95.8％和97．2％。（2）不同表型种气单胞菌安徽分离株之间及其与国内外其他分离株之间的hly核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均较高，分别介于88．4％-100％之间和90.8％-98．7％之间。（3）5个安徽分离株（RA16、CA1、HA6、HA7和GA1）之间及其与惟一参考株之间的alt核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性分别高达93．5％-99．9％和80．2％-98．3％，但与BA17分离株间的核苷酸序列同源性（81．6％-81．7％）和推测的氨基酸序列同源性（77．5％-84．9％）均较低。这些结果表明，气单胞菌ahal和alt基因在不同毒力基因型间存在一定差异性，hly基因在不同表型种间存在较高保守性，该基因可作为研制气单胞菌基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

斑点叉尾■溃烂症的病原鉴定和致病特性

为探明斑点叉尾[鱼回](Ictalunes punctatus)溃烂症的病因,从4尾患鱼肝脾中分离纯化出4株优势菌株,并进行病原鉴定、毒力基因检测、动物回归感染和药敏试验。4株优势菌经鉴定并命名为杀鲑气单胞菌无色亚种(Aeromonas salmonicida subsp achromogenes)X-G1,杀鲑气单胞菌杀鲑亚种(A.s subsp salmonicida)X-P2、X-P3和嗜水气单胞菌(A.hydrophila)X-P4。15℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3的世代时间(约14 min)均小于嗜水气单胞菌X-P4(约20 min);25℃时,杀鲑气单胞菌X-G1、X-P2和X-P3株的世代时间(约20 min)均大于嗜水气单胞菌X-P4株(约16 min)。X-G1株可检到弹性蛋白酶、溶血素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等3种毒力基因;X-P2株仅可检到弹性蛋白酶1种毒力基因;X-P3株可检测到弹性蛋白酶、溶血素、细胞毒性肠毒素、丝氨酸蛋白酶、酯酶、气溶素和甘油磷脂胆固醇酰基转移酶等7种毒力基因;X-P4株可检测到鞭毛、弹性蛋白酶、气溶素、细胞毒性肠毒素、热不稳定性肠毒素、丝氨酸蛋白酶和溶血素等7种毒力基因。分离株X-G1、X-P2、X-P3和X-P4在15~17℃水温下腹腔注射攻毒的半数致死浓度(LD 50)依次为0.49×10^4、0.78×10^4、0.53×10^4、3.84×10^4 CFU/g;而在23~26℃水温下测得的LD 50依次为1.48×10^4、1.80×10^4、0.82×10^4、0.68×10^4 CFU/g。分离株混合感染比单一株感染均表现出更强的致死能力。分离菌株对多西环素、恩诺沙星、氟苯尼考均敏感,但因患病鱼不能摄食药饵而导致治疗失败。     

豫北地区主要淡水鱼类感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

对豫北地区嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病进行流行病学调查,分离鉴定致病性嗜水气单胞菌菌株,并对致病性嗜水气单胞菌菌株进行毒力验证和药敏试验。采集4个养殖场病鱼标本及水样,每月进行流行病学调查,利用生理生化及分子生物学方法检测嗜水气单胞菌的分布状况。结果显示,筛选出52株为嗜水气单胞菌,其中32株为致病性嗜水气单胞菌,20株为非致病性嗜水气单胞菌,且致病性嗜水气单胞菌主要分布在7—9月份,毒力验证试验表明,32株致病性菌株的毒力大小差异明显,筛选出强毒株XDMG(4),为后期试验的疫苗株做准备;药敏试验表明,不同菌株对同一种药物的药敏结果不同,但大部分药物的药敏结果基本一致,70%以上的致病性菌株对头孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌药物表现为高度敏感,对青霉素类药物表现为高度耐药性,耐药率达100%,对氨基糖苷类(不包括阿米卡星)、磺胺类、四环素等药物呈现不同程度的耐药性,具有多重耐药性。本试验旨在丰富本地区的鱼类细菌性败血病的病原资料,并为该菌引起的人类疾病的防控提供科学依据。     

Identification and pathogenicity to rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), of some aeromonads

Twelve strains of fish pathogenic aeromonads were identified by 16S rRNA sequencing as Aeromonas bestiarum , A. hydrophila , A. hydrophila subsp. dhakensis , A. salmonicida subsp. salmonicida , A. sobria biovar sobria and A. veronii biovar sobria. Following intramuscular injection, A. hydrophila subsp. dhakensis caused dark liquefying, raised furuncle-like lesions in rainbow trout within 48 h. Extracellular products of all cultures contained gelatinase and lecithinase, and most revealed lipase. Congo red absorption and siderophore production was recorded, but not so the suicide phenomenon or slime production. Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis profile of the outer membrane proteins (OMP) revealed 10–25 bands, of which major bands were seen in the region of 32.5–47.5 and 62–83 kDa. Marked heterogenicity of the OMP and whole cell protein (WCP) profiles within and among the species was observed. Polypeptides of 83–173 kDa were detected in the WCP profile of the cultures, but they were not expressed in OMP fractions.     

乌江网箱养殖患病花鲈的细菌分离与分子鉴定

摘 要：利用微生物学常用的细菌分离、纯化方法从病害花鲈分离出9株菌株，编号分别为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ、Ⅷ、Ⅸ。对9株菌株的16SrRNA基因序列进行PCR扩增，均得到约600bp的片段。将扩增结果进行测序，测序结果输入到NCBI （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中，用BLAST工具对序列进行同源性比对分析。结果表明：Ⅰ为杀鲑气单胞菌,同源性98%；II为不动菌属，同源性97%；III为肺炎克雷伯氏杆菌，同源性98%；IV为嗜水气单胞菌，同源性99%；V为希瓦氏菌，同源性99%；VI为腐生葡萄球菌同源性99%；VII为枯草芽孢杆菌，同源性99%；Ⅷ为沙雷氏菌属，同源性95%；Ⅸ为杀鲑气单胞菌，同源性97%。