长江中下游干流环境DNA样本鱼类物种检测的初步研究

为开发适用于长江鱼类的环境DNA检测体系,在长江中下游干流24个采样点同步采集水样,抽滤后提取环境DNA,利用线粒体细胞色素B简并引物进行PCR扩增,扩增产物克隆测序得到419条序列,通过在Gen Bank核酸序列数据库进行BLAST序列比对确定物种信息,从来源于17个采样点的115条匹配成功的序列中,共检测到10种鱼类序列,代表15种鱼类。     

SSR-BSA技术对乌鳢性别差异标记的初步筛选

采用SSR结合BSA技术对1个家系96个乌鳢个体(雌雄各48个)进行性别差异标记的筛选。首先构建了雌雄基因池(各24个个体),然后用140对微卫星引物对其进行扫描,发现3对引物(HLJWL17,HLJWL59,HLJWL70)在雌雄基因池间扩增出差异条带,且都出现在雌性基因池中。用构建基因池的48个个体对3对引物进行第一轮单个体验证,HLJWL17和HLJWL70在基因池中扩增出的差异条带仅在极个别个体中出现,而HLJWL59的差异条带在绝大多数的雌性个体中被成功扩增出来,雄性个体皆无。用其余的48个个体对HLJWL59进行第二轮单个体验证,得到同样结果。对HLJWL59在8个雌性个体中扩增出来的差异基因片段进行克隆并测序。将8个个体的测序结果用Vector 8.0进行多序列比对,证实各个个体得到的条带是同一序列,该序列长度为243 bp,以TGC为重复单位,GC含量为51%。通过BLASTn比对,发现在GenBank数据库中无同源性序列存在。经统计,此差异标记在雌性乌鳢中出现的概率为62.5%,即该标记对该家系乌鳢性别的正确判别率为81.25%。     

卵形鲳!线粒体１６ＳｒＲＮＡ基因全长序列的克隆与分析

根据近源物种线粒体序列的同源比对，在16S rRNA基因上下游保守区域设计一对通用引物。PCR扩增获得特异的DNA片段，经克隆、测序和比对证实该片段包含了卵形鲳鲹线粒体16S rRNA全长序列1725bp。对5个个体分别测序后比对，发现卵形鲳鲹16S rRNA基因在钦州湾种群个体间存在至少7个变异位点，使5个个体分别具有5种不同的单倍型。将卵形鲳鲹和鲹科其它物种的16S rRNA序列进行比，根据比对结果构建的鲳鲹科各物种的系统进化树，支持鲹科下设四个亚科(鲹亚科，鰤亚科，鲳鲹亚科，鰆鲹亚科)的分类系统。综上所述，16S rRNA基因既可用于卵形鲳鲹种群遗传多样性分析，又适用于鲹科鱼类的系统进化分析。     

皱纹盘鲍肌动蛋白基因启动子的克隆和序列分析

从皱纹盘鲍雌性个体的足部肌肉提取总DNA后，通过聚合酶连式反应（PCR）技术扩增得到一个扩增产物。经克隆、筛选、确定重组子产物。测序得到了长度为511bp的启动子片段。分析测序结果发现，皱纹盘鲍肌动蛋白基因启动子DNA序列与目前己知的红鲍相应序列的相似度为95%；GC碱基含量为38.93%，较红鲍的低（59.2%）；所得序列含有高度保守的基本表达调控元件，即一个CAAT框和四个TATA框。     

三角帆蚌微卫星富集文库的构建、鉴定及多态性分析

通过磁珠富集法构建了三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)微卫星富集文库。共获得800个阳性克隆,其中的100个阳性克隆经测序分析,共获得微卫星序列54个。利用这些微卫星序列可设计33对引物,经过PCR扩增筛选获得了25对可用引物。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳,对洞庭湖1个种群的30只三角帆蚌进行扩增,发现13对引物呈现多态性,等位基因数在4～9。观测杂合度在0.2543～0.9827,期望杂合度在0.3629～0.8217,信息多态含量平均为0.5198。由于存在无效等位基因,两个微卫星基因座(GenBank登录号为GQ302651和GQ302658)明显地偏离哈代-温伯格平衡,但没有发现连锁不平衡现象。这说明利用磁珠富集法构建的三角帆蚌微卫星文库质量较好,13对多态性微卫星引物可为三角帆蚌微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供帮助。     

大菱鲆β-actin基因的初步研究

脊椎动物中不同物种的β-actin基因氨基酸之间的序列同源性超过98%。根据GenBank中登录的大菱鲆β-actin基因mRNA部分序列,与川鲽该基因全编码区DNA序列比对,依据比对结果分别在大菱鲆β-actin基因相邻外显子上设计1对引物,分别以RNA反转录产物和DNA为模板通过PCR方法进行克隆分析。对不同退火温度和循环数条件下的该基因RT-PCR产物进行了对比。针对RNA提取过程中的经过DNase处理但很难除净的痕量DNA污染,在琼脂糖凝胶电泳中很难被检测到的问题,初步探讨了利用上述2种模板对该基因扩增片断大小的不同来检出痕量DNA污染的可行性。     

基于PCR及焦磷酸测序技术的单孢子虫鉴定技术研究与应用

为适应口岸单孢子虫快速、准确、高通量检测的需求,建立一种基于PCR及焦磷酸测序技术平台的单孢子虫鉴定方法。以OIE推荐的PCR扩增方法获得单孢子虫特异基因,根据此基因的保守序列利用焦测序软件PyroMarkQ96ID设计专用引物进行PCR扩增及焦磷酸测序,测得序列经比对分析确定为单孢子虫序列。同时采用PCR焦磷酸测序方法和OIE推荐的PCR方法对牡蛎样品进行检测。结果表明,所建立的检测方法可从基因序列水平上准确鉴定牡蛎样品中的单孢子虫,且检测结果与OIE方法的检测结果一致。     

嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ—1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM—T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。     

萼花臂尾轮虫非混交雌体SOX基因的克隆与分析

选用根据SOX基因蛋白序列设计的1对兼并引物,采用PCR技术扩增萼花壁尾轮虫(Brachionus calyciflorus)非混交雌体基因组DNA。结果显示:实验得到1个约220 bp的片段。经过克隆和测序分析,共获得2个有差异的DNA片段,其中一个DNA片段证明为萼花臂尾轮虫SOX2蛋白编码序列,与人和秀丽隐杆线虫(Cae-norhabditis elegans)DNA序列碱基组成相似性分别为68.98%和75.93%,其编码的氨基酸序列与人、秀丽隐杆线虫SOX2蛋白相似性分别为为84.72%和81.94%。另一个DNA片段长209 bp,用BLAST程序在GenBank数据库中搜索,没有找到相似性序列,用该序列推导氨基酸序列,发现两个终止密码子,推测该片段是受到自然选择作用失去功能的SOX基因。同时对多个物种的SOX2基因保守序列进行比对,发现萼花臂尾轮虫SOX2基因是一种古老的基因形式,具有高度的保守性。     

编码鹰爪虾蜕皮抑制激素基因的cDNA片段的克隆和序列分析

提取鹰爪是眼柄总RNA，以眼柄总RNA为模板，根据日本对虾的具有蜕皮抑制活性的神经肽Pej-SGP-Ⅳ的氨基酸设计兼并引物，进行RT-PCR扩增，在适宜条件下得到一特异性片段。将这一特异性片段克隆到载体中进行测序，测得鹰爪虾的特异性cDNA片段由213个碱基对组成，推测的氨基酸序列由71个氨基酸组成。序列比较发现许多甲壳动物的CHH家庭神经肽与它相似。在所有与该序列推测的氨基酸序列相似的甲壳动物CHH家族神经肽中，MIH与它的相似度最高，表明由鹰爪虾眼柄特异性cDNA片段椎定的氨基酸基酸序列可能是鹰爪虾的MIH片段，它相当于MIH成熟肽的第5至75个氨基酸。     

地下海水池塘六价铬还原菌的多样性研究

从六价铬超标的地下海水池塘中采集底泥,以2216E培养基添加重铬酸钾为手段,筛选出对六价铬离子具有抗性的特异菌株。用细菌通用16SrDNA引物进行PCR扩增,PCR产物纯化后连接pMD18-T载体,导入大肠杆菌感受态细胞。然后对插入片段测序获得分离培养菌株的16SrDNA碱基全序列。通过NCBI比对,对分离的抗性菌株进行分子鉴定,确定其所属的分类地位。用PHYLIP软件,对16SrDNA碱基序列构建系统进化树,分析地下海水池塘六价铬还原菌的多样性。试验结果获得8株对六价铬有明显抗性的菌株,测序后发现8株菌为不同种的菌株,16SrDNA核酸序列相似度为88%,与已发表的序列或菌株的相似性为98%以上,属于6个属的8个不同的种。研究结果表明,铬超标地下海水池塘的活性底泥中六价铬抗性细菌菌株多样性十分丰富,通过进一步的还原性研究,可以筛选出对六价铬有还原特性的抗性菌株。     

中华绒螯蟹微卫星单片引物扩增产物的初步分析

采用人工合成的6个串联重复寡聚核苷酸单引物,以及2个加锚的二核苷酸引物,利用SPAR和ASSR技术,对中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis)基因进行PCR扩增,结果发现,对于GC含量丰富的三、四核苷酸引物如（GGA）5、（GACA）4,在不同退火温度的PCR反应中,都能扩增出清晰的条带,可以作为PCR扩增引物;反之,GC含量＜50％的（CATA）4和（GATA)4很难检测到扩增产物,在基本PCR条件下,2个加锚的二核苷酸引物如（AC）8、（GA）8,无论怎样改变退火温度,终难形成清晰条带,将不同引物扩增产物克隆到T－Vector上,选取其中9个阳性克隆进行序列测定,发现在（GACA）4引物扩增的2个片段中,序列结构相似,除引物序列外,都出现了2－3个内部重复序列和高含量的AT,其余7个片段在引物序列间都未见内部重复序列。     

泥蚶34个EST-SSR标记的开发及在格粗饰蚶中的通用性检测

利用泥蚶转录组高通量测序、拼接获得的大量EST序列开发SSR标记,在1123条EST序列里筛查到73条含有SSR位点的EST序列,其中54个位点适合设计引物,在位点两侧设计引物并进行PCR扩增.结果显示,46对引物获得稳定扩增的位点,引物在泥蚶奉化群体的多态性检测中发现,有34对引物表现出多态性,共扩增出122个等位基因,各位点的等位基因数Na为2～7个,平均每个位点产生3.59个等位基因,观测杂合度Ho、期望杂合度He、多态信息含量PIC范围分别为0.000 ～ 0.600、0.078 ～0.771、0.106～0.718;Hardy-Weinberg平衡检测显示,13个位点偏离了平衡状态;用Nr和Swiss-Prot蛋白质数据库对含有多态性SSR的EST进行了基因注释,25个SSR位点来自注释基因序列.将34对泥蚶多态性SSR引物在格粗饰蚶中进行了通用性检测,结果有1 1对成功扩增,8对表现为多态,通用率为23.53％,这些通用引物可用于两种蚶的遗传多样性评价、系统进化分析、比较作图和基因发掘等研究.     

中华绒螯蟹微卫星单引物扩增产物的初步分析

采用人工合成的 6个串联重复寡聚核苷酸单引物 ,以及 2个加锚的二核苷酸引物 ,利用SPAR和ASSR技术 ,对中华绒螯蟹 (Eriocheirsinensis)基因组进行PCR扩增 ,结果发现 ,对于GC含量丰富的三、四核苷酸引物如(CGA) 5、(GACA) 4 ,在不同退火温度的PCR反应中 ,都能扩增出清晰的条带 ,可以作为PCR扩增引物 ;反之 ,GC含量 <5 0 %的 (CATA) 4 和 (GATA) 4 很难检测到扩增产物 ;在基本PCR条件下 ,2个加锚的二核苷酸引物能扩增出可分辨的条带 ,但随着退火温度的升高 ,其中部分条带消失 ;对于不加锚的二核苷酸引物如 (AC) 8、(GA) 8,无论怎样改变退火温度 ,终难形成清晰条带。将不同引物扩增产物分别克隆到T Vector上 ,选取其中 9个阳性克隆进行序列测定 ,发现在 (GACA) 4 引物扩增的 2个片段中 ,序列结构相似 ,除引物序列外 ,都出现了 2～ 3个内部重复序列和高含量的AT ;其余 7个片段在引物序列间都未见内部重复序列     

鱼类环境DNA研究中通用引物的筛选验证

为了筛选一个通用性和适用性良好的能够运用于环境DNA(eDNA)研究的鱼类引物,从相关文献中选取了鱼类线粒体基因组部分片段的5对引物,分别对线粒体D-loop区、16S rRNA基因、COI基因以及Cytb基因部分片段进行扩增。对千岛湖48种鱼类基因组DNA进行扩增后比较发现,引物16s和COI均可以取得良好的扩增效果,通用性优于其他几对引物。引物16s的扩增产物经凝胶电泳检测均出现明亮的目的条带,引物COI则有3种鱼的条带经凝胶电泳检测亮度较暗。利用上述引物对环境样品eDNA扩增时发现,只有16s和COI的引物具有良好的扩增效果,能够得到明显单一的亮带。对该两种引物的PCR产物克隆后测序比对发现,16s的PCR产物均为千岛湖常见鱼类物种的基因片段,COI的PCR产物则为细菌COI基因的部分片段。综上,我们认为引物16s在通用性和适用性上都更为适合作为鱼类群落结构eDNA研究的通用引物。     

我国一株新型黄头病毒的分子流行病学

为查明黄头病毒(Yellow Head Virus,YHV)在我国的存在和变异情况,本研究采用世界动物卫生组织(OIE)《水生动物诊断手册》中YHV套式RT-PCR检测方法对2012-2014年采集的299份样品进行了YHV监测,并对部分YHV阳性样品基因进行了克隆测序及系统发育分析.流行病学调查显示,299份样品中YHV的阳性率为11％,我国养殖的中国明对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾以及罗氏沼虾的部分样品中均检出了YHV,中国明对虾和罗氏沼虾是本次调查中新发现的YHV自然宿主,而且YHV在中国明对虾中的检出率最高.对6份较强阳性样品YHV基因组ORF1b内1002 bp的分型片段进行克隆测序和序列分析,序列比对结果显示,阳性样品的YHV与国外报道的YHV的6个基因型相似度为81.0％-90.5％;系统发育分析显示,6份阳性样品归于同一分支,但与已知YHV的6个基因型均不在同一分支内,其与YHV基因1型(YHV-1)亲缘关系较近.对阳性样品YHV基因组ORF3内编码gp116蛋白的一段序列进行克隆测序,得出其序列长度为509 bp,与YHV-1a的545 bp、YHV-1b的383 bp和YHV-2(即鳃联病毒GAV)的476 bp均不同;依据该片段构建的系统发育树显示,6份阳性样品归于同一分支,与YHV已知的6个基因型不同,与YHV-1亲缘关系较近,且与YHV-1a相似度大于YHV-1b.对其中两份样品的ORF2序列进行比对显示,两份样品序列相似性为99.8％,蛋白序列完全相同,与YHV-1的序列相似度为85.9％,与YHV-2相似性为80.9％.样品调查结果对增补YHV的宿主范围有重要意义;YHV核酸检测和序列比对结果表明,感染我国养殖对虾的YHV为一种新的致病株型.     

中华绒螯蟹一个种质鉴定相关RAPD标记的SCAR转化

通过克隆测序获取了中华绒螯蟹Opp17目的片段,分析其长度、碱基组成等序列特征。序列测定结果表明,克隆片段的准确大小为1170bp,G+C含量为50.34%,Opp17(TGACCCGCCT)引物与所测序列中的引物结合位点完全匹配。在GenBank中对序列进行BLast检索,未找到任何同源序列。在此基础上,在原有随机引物Opp17的基础上向3’端延伸13～19个nt以设计SCAR引物,最终设计了1对中华绒螯蟹特异性SCAR(sequence characterized ampLified regions,序列特征化扩增区)引物SCAR-1(F-TGACCCGCCTCAGCACCCGAACG;R-TGACCCGCCTCTCAGCCACACACC)。利用这对引物对长江天然群体中华绒螯蟹基因组DNA进行PCR扩增,结果表明所有个体均能扩增出预期大小1170bp的特异性条带。对目的条带进行回收测序,结果与之前的测序结果完全一致,表明本研究已成功获取了中华绒螯蟹种质鉴定国家标准中Opp17目的条带的SCAR标记。     

浙江省桃花水母18S rRNA基因序列分析及物种鉴定

采用PCR和DNA测序技术扩增和测序了2003~2008年间采自浙江省宁波、杭州、温州和金华4个地区7个地点桃花水母(Craspedacusta)核糖体小亚基rRNA(18S rRNA)基因,并与已知索氏桃花水母(Craspedacusta sow-erbyi)和中华桃花水母(Craspedacusta sinensis)18S rRNA基因序列进行了比对。结果显示:这7个地点的桃花水母与索氏桃花水母序列极为相似,相似度达99.67%~100%,遗传距离为0~0.002,而与同属中华桃花水母的遗传距离为0.013~0.015。分子系统学分析显示这7个地点桃花水母与索氏桃花水母分支的置信度高达100%。结果确定分析样品均为索氏桃花水母。     

大鲵虹彩病毒贵州分离株MCP基因的克隆与原核表达

根据Gen Bank中大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP(major capsid protein,MCP)基因序列(序列号:KF512820),设计一对特异性引物,以大鲵虹彩病毒贵州分离株基因组DNA为模板,PCR扩增大鲵虹彩病毒MCP基因并测序,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因进行比对,然后将其亚克隆到原核表达载体p ET-32a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导后进行Western blot分析。结果显示:PCR扩增出长度为1 392 bp的片段,与Gen Bank中大鲵虹彩病毒MCP基因核苷酸序列相似性为99.7%~99.9%,SDSPAGE电泳显示该重组蛋白的相对分子质量约为67×103。免疫原性检测结果表明,该重组蛋白可与兔抗大鲵虹彩病毒阳性血清特异性反应,具有免疫原性。     

长江刀鲚GHRH基因克隆及序列分析

通过克隆长江刀鲚的GHRH基因片段并进行序列分析,旨在为长江刀鲚分子生物育种方面的进一步研究奠定基础。提取长江刀鲚组织中的总RNA,根据已知鱼类GHRH基因保守片段设计兼并引物,使用RT-PCR方法克隆长江刀鲚GHRH基因片段,对所得序列进行生物信息学分析。试验结果:克隆得到的基因片段长度为492 bp,推导出氨基酸残基为164个,其氨基酸序列与大西洋鲱鱼、斑马鱼和大西洋鳕的相似度分别为92 %、79 %和77 %。系统进化树分析进一步表明,长江刀鲚与大西洋鲱的亲缘关系最近。