稀有鱼句鲫β肌动蛋白启动子的克隆及其驱动活性的初步检测

稀有鮈鲫是一种新型的模式实验鱼,具有利用转基因技术培育开发成为观赏性鱼类的潜在可能。本实验采用PCR方法,从稀有鮈鲫基因组DNA中分离得到大小为1584bp的β肌动蛋白(β-actin)基因片段。序列分析表明,该片段包括长为1507bp的启动调控区和77bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为109bpβ-actin基因上游调控序列,不翻译的外显子1和内含子1。上游调控序列中含有TATAbox,CAATbox和CArGbox等与转录活性密切相关的作用元件,并且在稀有鮈鲫β-actin基因第一个内含子中也含有1个CArG调控元件。将该启动子片段克隆到绿色荧光表达载体(pAcGFP1-1)上,显微注射入稀有鮈鲫的受精卵中,通过荧光显微镜能观察到绿色荧光蛋白的表达。本实验成功分离了具有驱动活性的稀有鮈鲫β-actin基因启动子。     

稀有鮈鲫β-肌动蛋白启动子的克隆及其驱动活性的初步检测

稀有鮈鲫是一种新型的模式实验鱼,具有利用转基因技术培育开发成为观赏性鱼类的潜在可能。本实验采用PCR方法,从稀有鮈鲫基因组DNA中分离得到大小为1584bp的β肌动蛋白(β-actin)基因片段。序列分析表明,该片段包括长为1507bp的启动调控区和77bp的部分转录区序列。启动调控区包括一段长为109bpβ-actin基因上游调控序列,不翻译的外显子1和内含子1。上游调控序列中含有TATAbox,CAATbox和CArGbox等与转录活性密切相关的作用元件,并且在稀有鮈鲫β-actin基因第一个内含子中也含有1个CArG调控元件。将该启动子片段克隆到绿色荧光表达载体(pAcGFP1-1)上,显微注射入稀有鮈鲫的受精卵中,通过荧光显微镜能观察到绿色荧光蛋白的表达。本实验成功分离了具有驱动活性的稀有鮈鲫β-actin基因启动子。     

尼罗罗非鱼β-actin基因启动子的分离及其在真核细胞中的活性验证

采用高保真PCR方法从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)基因组DNA中分离出β-actin基因启动子序列,将β-actin基因启动子插入pN1-EGFP构建成真核细胞表达载体pEGFP-β-actin,并通过脂质体转染法将重组载体导入人胚肾上皮细胞HEK 293T,荧光显微镜下观察外源基因EGFP...     

绵羊整联蛋白受体av亚基基因实时定量PCR标准曲线的构建

目的为了建立检测绵羊整联蛋白受体αv亚基基因(ITGAV)mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,构建目的基因ITGAV、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线。方法根据GeneBank中绵羊ITGAV和β-actin基因编码区保守序列,设计特异引物,选择绵羊卵巢组织cDNA为模板进行PCR扩增,产物回收纯化后,与PMD18-T载体连接、转化感受态DH5α,筛选白色菌落并摇菌培养,经PCR和测序鉴定获得阳性ITGAV、β-actin重组质粒;将阳性重组质粒107～102梯度稀释作为模板,进行实时荧光定量PCR,系统软件自动生成标准曲线及回归方程。结果ITGAV基因相关系数(RSq)=0.998,扩增效率(Eff.)=104.7%;β-actin基因相关系数(RSq)=0.998,扩增效率(Eff.)=111.6%。经熔解曲线分析,ITGAV基因熔解温度为84.66℃,β-actin为86.92℃,2个基因片段的熔解曲线均呈单峰,扩增曲线呈典型的S型动力学曲线,指数扩增期和平台期十分明显,表现为理想的扩增曲线。结论成功构建目的基因ITGAV、内参基因β-actin的标准质粒和标准曲线。     

鲮β-肌动蛋白基因和启动子的克隆及序列特征分析

鲮(Cirrhinus molitorella)是华南地区重要的淡水养殖品种之一,但是鲮生长速度慢,且不耐低温,是目前鲮养殖产业所面临的主要问题。作为利用转基因技术培育快速生长鲮新品系研究工作的一部分,本实验利用PCR和一种新的染色体步移方法克隆了鲮β-肌动蛋白(β-actin)基因启动子和全基因组DNA序列。鲮β-actin基因长4 351 bp,由6个外显子和5个内含子组成。鲮β-actin基因启动子区域包含1个TATA盒,1个CCAAT盒,2个CArG调控元件和1个CRE调控元件,并且鲮β-actin基因内含子1中也含有一个CArG调控元件。这些结构特征说明本研究所克隆的鲮β-actin基因序列具有典型的启动子特征。鲮β-actin基因启动子的克隆为转基因鲮表达载体的构建提供了一个重要的调控结构元件。     

唐鱼β-肌动蛋白基因启动子的分离及其驱动活性的检测

利用PCR技术克隆唐鱼（Tanichthys albonubes）β-actin基因。所克隆的β-aetin基因片段为1464bp，包含长为1374bp的启动调控区和90bp的部分开放阅读框。启动调控区包括105bp的β-actin基因上游调控序列、第一个外显子和第一个内含子。上游调控序列中含有对转录起重要作用的CAAT Box、TATA Box、CArG Box等元件。将唐鱼β-actin启动调控区克隆到红色荧光表达载体pDsRed2-1上，并显微注射到唐鱼受精卵中，荧光显微镜观察红色荧光蛋白（RFP）的表达。结果表明，RFP在转基因唐鱼中的表达阳性率较高，最高可达51．8％，且RFP的表达水平较高。PCR检测转基因唐鱼的部分器官组织，在被检组织器官中均能检测到外源RFP基因；而RT-PCR以及Southern blot验证显示RFP mRNA的表达有所不同；Southern blot检测肌肉组织基因组DNA，可见比阳性载体大的杂交条带。说明所检测的组织中已发生外源基因RFP的整合，但有些组织存在表达水平较低或者不表达的现象。本实验分离到的β-actin基因启动子序列具有有效的驱动功能，可启动外源基因在唐鱼体内的高效表达，从而为下一步进行功能基因的转化研究奠定基础。     

西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长克隆、序列分析及其作为内参基因的应用研究

采用同源克隆和RACE技术获得西伯利亚鲟(Acipenser baerii)β-actin基因cDNA全长,序列分析表明西伯利亚鲟β-actin基因cDNA全长1322bp,其包括的137bp的5′端非翻译区,57bp的3′端非翻译区和编码375个氨基酸残基的1128bp开放阅读框。与其他物种比对,该基因具极高的保守性。同时也利用同源克隆技术获得了西伯利亚鲟Sox2基因的同源保守区,该序列长768bp,编码256个氨基酸,也具较高的保守性,与其他物种的相似性在70%以上。以β-actin作为内参基因,对Sox2基因在西伯利亚鲟成鱼各组织及胚胎发育各时期进行实时荧光定量PCR检测,发现Sox2基因在不同组织中均有表达。其中,在肝、胰、肾、脑4个组织中表达量差距不大,均处于相对较低的水平,在肌肉组织中表达量最高,达到了肝脏的10.4倍。同时Sox2基因虽在西伯利亚鲟胚胎发育各时期均有表达,但表达也具明显的时间差异性。在受精卵期、囊胚期Sox2基因的相对表达量较低,在原肠期、神经胚期、视泡形成期和心脏形成期Sox2基因相对表达量较高,且在心脏形成期达到最高点。本研究为量化西伯利亚鲟发育分化过程中相关基因提供了坚实的参照工具,增加了后续试验的可信度,同时可为今后深入研究西伯利亚鲟Sox2在侧线神经节分化发育、细胞迁移过程中的作用提供基础参考依据。     

中国大菱鲆虹彩病毒主要衣壳蛋白基因的PCR扩增及序列分析

应用同源PCR技术，从被一种球状病毒感染的患病大菱鲆（Scophthalmus maximus）脾脏和肾脏组织中扩增出了一段长度为620bp的DNA片断。序列测定和Blast分析表明，该DNA片断与鱼类虹彩病毒主要衣壳蛋白（MCP）C末端编码区的DNA序列高度相似，由此证实感染养殖大菱鲆的这种球状病毒为一种鱼类虹彩病毒，暂命名为大菱鲆红体病虹彩病毒（TRBIV）。多序列比对和分析发现，TRBIV MCP C末端的205个氨基酸序列与GenBank中20种虹彩病毒相应序列的相似性分别为99．47％（韩国大菱鲆虹彩病毒）、97％～98％（待指定病毒属的7种病毒），以及50％以下（蛙病毒属、淋巴囊肿病毒属、虹彩病毒属的12种病毒），由此绘制出了包含TRBIV在内的21种虹彩病毒的系统发育树。研究结果表明，感染中国养殖大菱鲆的TRBIV属于虹彩病毒科待指定病毒属，位于该属ISKNV亚群和RSIV亚群之间，是该病毒属的一个新成员。     

脊尾白虾GAPDH基因的克隆及其内参基因稳定性分析

为比较甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、18S rRNA和β-actin基因在脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)作内参基因的优劣,本研究采用同源克隆和RACE技术,克隆了脊尾白虾GAPDH基因全长cDNA序列(GenBank登录号:KX893516),通过实时荧光定量PCR(quantative real-time PCR,qPT-PCR)技术,检测3种基因在脊尾白虾不同组织及不同蜕壳后时间点的表达量变化,在此基础上进行内参稳定性分析。结果显示,脊尾白虾GAPDH基因全长1514 bp,开放读码框1002 bp,编码333个氨基酸,二级结构预测显示GAPDH蛋白具有一个高度保守的NAD~+结合功能域(NAD binding domain)和行使糖运输和代谢的催化功能域。分析qRT-PCR结果并结合ge Norm、Norm Finder和Best Keeper 3种软件的分析发现,在不同组织和不同蜕壳后时间点,3种内参基因的稳定性由高到低依次为18S r RNA、GAPDH、β-actin。因此,在脊尾白虾不同组织和不同蜕壳后时间点的定量分析中,选取单内参基因时,推荐使用18S rRNA为内参基因,双内参时推荐18S rRNA和GAPDH,而18S rRNA、β-actin和GAPDH在其他生理条件下作内参基因的稳定性还有待进一步研究。     

锦鲤保护性组织RNA提取及引物扩增研究

从养殖锦鲤各种组织中提取完整的RNA,是分子生物学研究锦鲤应激表达、体色变异、生长发育等功能基因表达的关键实验.在不伤害养殖锦鲤个体健康的情况下,取用鱼体的鳍条、鳞片、鳃丝、血液4种保护性组织,可以最大程度地减少对珍贵锦鲤个体的损伤,并达到研究相关基因表达的目的.本研究利用TRizol法提取RNA,获得的各样品RNA条带完整、纯度高.结果表明,4种保护性组织提取的RNA经过逆转录反应,得到了高质量的CDNA.内标基因(β-actin)、热激蛋白基因(hsp 70)、金属硫蛋白基因(MT)扩增得到清晰的条带,通过NCBI数据上的BLAST比对证明,各序列的同源性在95%以上.利用本研究的方法,可以充分保护养殖锦鲤个体的完好性,用于进一步的分子生物学研究.     

泥鳅β-actin启动子介导的革胡子鲶GH重组基因的构建及启动活性研究

为获得快速生长的泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus),研究了泥鳅β-actin基因启动子介导的革胡子鲶(Clarias gariepinus)生长激素(growth hormone,GH)重组基因。采用PCR和RT-PCR技术克隆泥鳅β-actin基因近端启动子、3′-UTR及革胡子鲶GH基因编码区,构建一个长为2 418bp的GH重组基因DPRK。首先,构建了以增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因作为报告基因的重组表达载体p AF(pβ-actin promoter-EGFP),然后转染DF1真核细胞,同时经酶切线性化后显微注射到斑马鱼(Danio rerio)和泥鳅的受精卵中,以评价泥鳅β-actin启动子的启动活性。其次,将重组基因DPRK显微注射到泥鳅受精卵中。结果显示:泥鳅β-actin启动子能在DF1细胞、斑马鱼和泥鳅的受精卵中启动绿色荧光蛋白的表达;泥鳅的荧光表达率(78.44%)显著高于斑马鱼(29.62%);泥鳅受精卵显微注射DPRK 20d后,在m RNA水平检测到GH基因的表达。这表明泥鳅β-actin基因近端启动子具有显著的启动活性,且重组基因DPRK能在泥鳅体内表达,为下一步泥鳅的基因工程育种奠定了理论基础。     

大菱鲆热休克蛋白90基因cDNA的克隆及其表达特征

从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选到HSP90,采用基因克隆方法获得含有1个97bp的5’UTR、2190bp的开放阅读框和501bp的3’UTR的全长cDNA序列。整个开放阅读框编码729个氨基酸,包含HSP90家族5个保守信号区。与其他物种已知序列同源比对的结果显示,此编码氨基酸更接近于热休克蛋白90β亚型(HSP90β),与牙鲆HSP90β的同源性高达96.6%。RT-PCR分析表明,在胚胎发育初期就能检测到HSP90,其表达量伴随着胚胎发育,先增加后减少,在尾芽期达到最高。HSP90在健康大菱鲆各供试组织中均有表达。经鳗弧菌感染处理后,在胚胎细胞中也有HSP90的强烈表达。结果显示,大菱鲆HSP90cDNA序列为HSP90β,是一种组成型表达的基因,其在维持正常生理机能、胚胎发育和应激中发挥重要的作用。     

缢蛏β-ACTIN-1基因的分子特性及其表达分析

为研究缢蛏功能基因的表达调控,利用SMART cDNA文库构建试剂盒成功构建了缢蛏肝脏组织的标准化cDNA文库。对随机选取的5 679个克隆进行随机测序,比对、筛选出2条β-actin同源序列,对其中一条EST序列两端进行扩增、测序,然后进行5′RACE(rapid amplification of cDNA ends,RACE)扩增、测序,拼接得到全长cDNA序列,命名为β-ACTIN 1。该序列全长为1 552 bp,包括73 bp的5′非翻译区和348 bp的3′非翻译区,以及1 131 bp的开放阅读框。阅读框共编码376个氨基酸,推算分子量约为41.95 ku,理论等电点为5.23。与其他7种软体动物的氨基酸序列进行比对发现,β-ACTIN 1基因的氨基酸序列中Ile179、Glu229、Ser232、Pro236、Ile248、Asn272、Cys273、Val283、Ser320、Ser325、Val330、Pro339等12个氨基酸残基具有特异性;同时发现缢蛏β-ACTIN 1氨基酸序列与其他软体动物的相似性高达97%以上。系统进化分析显示,缢蛏首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。荧光定量PCR检测结果显示,β-ACTIN 1基因在缢蛏各组织中的表达及鳗弧菌诱导后的表达均不稳定,不适合作为内参基因。     

卵形鲳!线粒体１６ＳｒＲＮＡ基因全长序列的克隆与分析

根据近源物种线粒体序列的同源比对，在16S rRNA基因上下游保守区域设计一对通用引物。PCR扩增获得特异的DNA片段，经克隆、测序和比对证实该片段包含了卵形鲳鲹线粒体16S rRNA全长序列1725bp。对5个个体分别测序后比对，发现卵形鲳鲹16S rRNA基因在钦州湾种群个体间存在至少7个变异位点，使5个个体分别具有5种不同的单倍型。将卵形鲳鲹和鲹科其它物种的16S rRNA序列进行比，根据比对结果构建的鲳鲹科各物种的系统进化树，支持鲹科下设四个亚科(鲹亚科，鰤亚科，鲳鲹亚科，鰆鲹亚科)的分类系统。综上所述，16S rRNA基因既可用于卵形鲳鲹种群遗传多样性分析，又适用于鲹科鱼类的系统进化分析。     

牙鲆胰岛素样生长因子结合蛋白IGFBP-1 cDNA全长的克隆及表达分析

利用RACE-PCR技术,从牙鲆(Paralichthys olivaceus)的肝脏组织总RNA中克隆得到胰岛素样生长因子结合蛋白-1(insulin-like growth factor binding protein 1, IGFBP-1)基因的全长cDNA序列,该cDNA全长为1070 bp,开放阅读框为729 bp,编码242个氨基酸。通过系统进化树分析,牙鲆IGFBP-1与鱼类IGFBP-1基因聚为一支;通过同源性比对,牙鲆IGFBP-1基因的核苷酸序列与大菱鲆同源性最高,为95%,而其推导的氨基酸序列与其它鱼类如大菱鲆、五条鰤、黄金鲈、红点鲑、鲤鱼和斑马鱼的同源性分别为89%、89%、84%、79%、67%和67%。半定量RT-PCR分析表明,牙鲆IGFBP-1基因存在母源转录本,合子基因在孵化前的胚胎阶段及早期仔鱼中仅有较低水平的表达,在后期仔鱼中表达逐渐增高;牙鲆IGFBP-1基因在肝脏中表达量最高,在胃、脾、肠、性腺、肾、鳃、脑、心脏和肌肉中也有不同程度的表达。     

应用环境DNA技术对邵伯湖浮游动物物种检测的初步研究

为掌握邵伯湖浮游动物物种组成,利用环境DNA技术于2018年11月对其浮游动物群落进行了监测。在邵伯湖15个采样点同步进行了水样采集,抽滤后进行了DNA提取,利用线粒体DNA 12S r RNA引物进行PCR扩增,并进行了高通量测序。结果显示,从二代测序的1114482条DNA序列中,比对得到浮游动物OTUs数68个。利用宏条形码共检出浮游动物22种(隶属于14科18属),邵伯湖浮游动物功能群以轮虫滤食者RF为主,各样点浮游动物α和β多样性的各项指数较为均匀,表明邵伯湖各区域的浮游动物多样性水平较接近。环境DNA技术适用于浅水湖泊浮游动物群落监测,在现阶段的淡水浮游动物资源监测中,该技术宜与传统的监测方法结合使用。     

坛紫菜叶绿体psaA基因片段的序列分析

根据日本kazusaDNA研究所收录的坛紫菜EST序列AV434021和AV433683设计引物,对坛紫菜配子体的RNA进行RT-PCR扩增,得到产物长度为480 bp。利用DNAstar、Clastal1.81等专业软件进行分析,结果表明,所得产物为紫菜叶绿体的psaA基因片段,其G C含量为55.9%。G C含量明显高于A T的含量;对按核酸序列推导的蛋白序列进行二级结构和三级结构预测,该蛋白存在3个α螺旋和2个β折叠。     

多浪羊DQB1基因第二外显子序列分析

实验采集了23只多浪羊的血样,利用PCR扩增技术,对其扩增产物进行测序,对测序结果进行比对分析。根据Blast比对分析发现,克隆到的该基因核酸序列的16个测序结果相似度较高,但只找到所给的反向引物的互补序列,确定为单向引物测得的结果。经过多次比对确定A04和B04两条序列的相似度达到96.8%。结果表明成功克隆到该基因片段核酸序列,长度为280 bp。经过DNAMAN的序列分析,发现有55个突变位点。     

暗纹东方鲀线粒体DNA控制区结构和系统发育分析

以暗纹东方(Takifugu fasciatus)肝脏线粒体DNA为模板,参照GenBank中红鳍东方(Takifugu rubripes)线粒体DNA序列设计合成特异引物进行PCR扩增,获得了暗纹东方线粒体DNA控制区基因(818 bp)及5′端上游的tR-NAPro基因(71 bp)的全序列。控制区碱基组成为T32.2%,C 19.1%,A35.6%,G13.2%。对照其他已报道的鱼类控制区结构,对暗纹东方控制区的结构进行了分析,识别了其终止序列区、中央保守区和保守序列区,找到了终止相关的序列TAS以及保守序列(CSB1,CSB2,CSB3)。CSB1、CSB2序列相对保守,TAS与其回文基序可形成稳定的茎环结构,成为H-链复制延伸时的终止识别位点。同时运用DNA分析软件对暗纹东方与GenBank中其他10多种鱼类的mtDNA控制区序列进行比对,并选取东方属的7种鱼类mtDNA控制区序列构建分子系统树。结果显示控制区基因较适于科鱼类中同属不同种的系统发育分析。     

日本黄姑鱼和鮸状黄姑鱼细胞色素b基因序列的比较分析

利用PCR技术对日本黄姑鱼和鮸状黄姑鱼线粒体DNA的细胞色素b基因片段进行了扩增，PCR产物直接测序，分别获得日本黄姑鱼和鮸状黄姑鱼1137bp的序列。通过对两种鱼的Cyth序列的比对分析，得出两种鱼序列的相似性为99．82％；分析了两种鱼序列的碱基组成及碱基变异情况，发现两种鱼的序列差异明显，碱基替换较多，而且有2个位点可以作为区分两种鱼的分子标记。因此，可以将Cyth基因作为种间分子鉴定或更高分类界元遗传分析的分子标记。