鲵鱼消化道细菌群落结构及多样性初步研究

采用常规分离纯化与构建16S rDNA克隆文库相结合的方法对（鲵）鱼（Miichthys miiuy）消化道细菌多样性进行了初步研究.结果表明,（鲵）鱼消化道各部位可培养细菌的菌落数量从大到小依次为前肠＞幽门胃＞中肠＞后肠＞前胃＞后胃＞口咽腔,其中肠道部位菌落数量最多.分离细菌菌株主要为杆状细菌和革兰氏阴性菌,对其中的50株典型菌株进行分子鉴定,发现它们主要属于变形菌门的γ-变形菌纲（占52.7％）和β-变形菌纲（占36.8％）,以及厚壁菌门的芽孢杆菌纲（占10.5％）;不可培养细菌16S rDNA文库克隆子主要属于γ-变形菌纲、α-变形菌纲和脱铁杆菌纲,部分序列与已报道的物种相似性较低,说明消化道中可能存在新的有待开发的肠道菌株.     

16S rDNA克隆文库技术在活性污泥系统微生物组成分析中的应用

采用构建16S rDNA克隆文库方法对活性污泥系统的细菌种群多样性进行研究。随机测定了71个克隆子序列(1 500bp),BLAST比对结果表明,活性污泥中微生物群落具有高度多样性,可分为6个主要类群,其中,拟杆菌(Bacteroides)类群和γ变形菌(γ-Proteobacteria)类群在文库中所占比例最大,分别为38.03%和32.39%;其次是β-Proteobacteria,占19.72%;Firmicutes,Candidate division TM7和α-Pro-teobacteria类群所占比例相对较小,分别为4.23%,4.23%和1.04%。序列分析结果表明,活性污泥中具有可强化生物脱氮除磷效果的食酸菌(Acidovorax),包括假单胞菌(Pseudomonas),红环菌(Rhodocyclus)等细菌。     

中华鳖体表和体内菌群多样性分析

采用16S rDNA分析方法,分别提取中华鳖体表和体内细菌总DNA,以之为模板进行PCR扩增获得细菌16S rDNA基因片段,并构建16S rDNA克隆文库.从2个文库中分别随机选取100个重组克隆子,抽提重组质粒,用Hae Ⅲ和MspⅠ限制性内切酶进行酶切,获得酶切指纹图谱,从每种图谱随机挑选克隆子测序,获得其16S rDNA部分序列,构建了系统进化树.在中华鳖体表和体内细菌克隆文库中分别包含13种和10种RFLP谱型,分别挑选了70个和60个克隆子进行测序.结果表明,中华鳖体表和体内文库克隆子分别归为15类和11类OTU,体表和体内菌群多样性较强,优势细菌类群分别为拟杆菌和变形菌,并在文库中检测到了几株益生菌和条件致病菌.     

摄食不同饵料的大口黑鲈肠道菌群分析

为了探究投喂冰鲜杂鱼和人工配合饲料对大口黑鲈肠道菌群的影响,本研究采用变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对摄食不同饵料的2组鲈鱼肠道内容物的细菌群落结构进行了比较分析.结果显示,冰鲜组与饲料组的大口黑鲈肠道菌群组成相似性较低(相似性24％),且冰鲜组肠道菌群多样性高于饲料组.对2组大口黑鲈中共有条带和特异性条带进一步测序分析显示,2组大口黑鲈肠道共有菌有红螺菌、梭菌、保科爱德华菌、嗜麦芽窄食单胞菌和蓝细菌.冰鲜组大口黑鲈肠道中的特异性菌归属为拟杆菌、肉食杆菌、魏斯氏菌和邻单胞菌;饲料组大口黑鲈肠道中的特异性菌归属为黄杆菌、鲸杆菌、柠檬明串珠菌、缺陷短波单胞菌.研究表明,与投喂冰鲜杂鱼的大口黑鲈相比,人工配合饲料降低了大口黑鲈肠道菌群多样性,也抑制了拟杆菌等有益菌在大口黑鲈肠道内的分布.推测饲料组大口黑鲈生长较慢可能与其肠道菌群中拟杆菌与厚壁菌的比值下降有关.研究结果提示,在今后大口黑鲈养殖或者人工配合饲料研制过程中,添加拟杆菌等益生菌也许可促进大口黑鲈的生长和营养吸收.     

刺参消化道内含物细菌群落组成的PCR-DGGE分析

利用PCR-DGGE技术研究刺参(Apostichopus japonicus)前肠、中肠和后肠内含物的细菌群落组成。通过软件Bio-rad Quantity one分析DGGE指纹图谱,发现刺参后肠内含物的条带数目显著高于前肠和中肠(P=0.003,P=0.016),表明刺参后肠内含物的细菌多样性最高,其次是中肠;前肠内含物的细菌多样性最低。UPGMA聚类分析发现,不同刺参个体其后肠的细菌群落组成差异最小,前肠的细菌群落差异最大。经DGGE分离、条带切割和序列测定,共获得了13条序列,系统发育分析表明,刺参消化道内含物的细菌群落可主要归属于5大类群,即α-变形菌纲(α-proteobacteria)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)、δ-变形菌纲(δ-proteobacteria)、拟杆菌纲(Bacteroidetes)和柔膜菌纲(Mollicutes)。刺参前肠、中肠和后肠内含物的优势菌群均为γ-proteobacteria。Blast分析显示,其中12条与之亲缘关系最近的序列来自从海洋环境中获得的细菌克隆,表明刺参消化道的细菌群落可能直接或间接来源于刺参的栖息地环境。     

对两种不同投料方式的大黄鱼肠道菌群结构分析

为了解在不同投喂方式下大黄鱼的肠道微生态结构,研究采用高通量测序的方法对投喂冰鲜饲料和投喂颗粒饲料的大黄鱼的肠道菌群进行高通量测序,分析了肠道菌群结构差异。研究表明:变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、蓝藻门(Cyanobacteria)是大黄鱼肠道的主要菌群,其中变形菌门的丰度超过了30%;不同投喂组的大黄鱼肠道菌群结构存在一定差异,投喂冰鲜料组大黄鱼肠道内菌群OTUs和菌群的α多样性略低于投喂颗粒料的。     

浙南海水网箱主养鱼类配合饲料试验和推广探讨

为了在浙南海水网箱养殖中推广配合饲料,选择浙南海水网箱主养鱼类品种鲈鱼、大黄鱼、美国红鱼、黄姑鱼等进行配合饲料、冰鲜小杂鱼投喂养殖对比试验。试验结果:投喂冰鲜小杂鱼的饲料系数为8.22~10.21,投喂配合饲料的饲料系数为1.28~2.64;投喂配合饲料养成每千克鱼的平均饲料成本为18.63元,养成每千克鱼的总成本为25.64元;当小杂鱼的价格为每千克2.08元时,投喂小杂鱼和投喂配合饲料养殖每千克鱼的饲料成本相同,均为18.64元。试验结果表明,投喂配合饲料同样能养好海水鱼,冰鲜小杂鱼的价格是配合饲料推广的关键因素。     

青岛陆源排污口邻近海域异养细菌的组成与分布

对青岛近海度假区、港口区、养殖区、工业区4类排污口邻近海域异养细菌的组成与分布进行了调查研究,采用海洋异养细菌平板涂布培养法分离细菌,基于16S rDNA的扩增性DNA限制性酶切片段分析(ARDRA)进行聚类筛选并测序鉴定。结果显示,青岛排污口邻近海域可异养培养的菌株分布于变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)4个细菌类群,变形菌门细菌数量占总测序数量的68%,其中γ-变形菌纲的数量在变形菌门中占88%;不同海域中细菌组成与分布有所不同,放线菌门和拟杆菌门的细菌种类较少且各海域分布有所不同,但γ-变形菌纲的弧菌属细菌(Vibrio sp.)在4类海域中均被发现,占总检测量的18.54%,其中溶藻胶弧菌(Vibrio alginolyticus)占弧菌总量的25%。不同海域也检测到V.parahaemolyticus、V.harveyi、V.campbellii、V.parahaemolyticus等水产养殖业的潜在致病菌。根据16S rDNA系统进化关系和细菌门类聚类分析得到的结论推断,工业区与养殖区海域的细菌组成和分布相似度较高,推断各海域的细菌组成与排污口类型有一定相关性。     

大黄鱼微卫星标记的富集与筛选

根据生物素与链霉亲和素的亲和原理，采用生物素-磁珠富集微卫星，与传统放射性同位素杂交法相结合，构建筛选大黄鱼的微卫星文库。用生物素-微卫星捕捉单链限制性酶切片段（含有接头和大黄鱼微卫星序列），经PCR扩增单链目的片段形成双链，然后连接至T载体上，转化感受态细胞。将移至硝酸纤维素膜的重组菌用^32P标记的放射性同位素探针50[γ-^32P]ATP（CA）15筛选出阳性克隆菌。测序结果发现，阳性克隆率为71.9％，105个微卫星位点。其中选取设计合成30对并筛选出22对可用引物。说明所建大黄鱼微卫星文库是一个高质量的文库，可为大黄鱼基因组结构分析、大黄鱼精密微卫星连锁图谱构建、分子进化和系统发育研究、分子标记辅助育种以及经济性状的QTL定位提供大量的微卫星标记。     

高蛋白配合饲料替代饲喂对拟穴青蟹肠道菌群的影响

为探明蟹公寓养殖模式下,高蛋白配合饲料替代杂鱼饲喂对拟穴青蟹菌群的影响,采用16S rRNA高通量测序技术,比较分析养殖过程中不同饵料组拟穴青蟹的肠道菌群结构。结果显示,各饵料组中优势菌群均为变形菌门、厚壁菌门、梭杆菌门和拟杆菌门,占操作分类单元总数85.84%以上。不同饵料组共有细菌操作分类单元(695个)占总数的18.92%,其序列数占总序列数的95.39%。主坐标分析显示不同饵料组肠道菌群的群落结构未产生显著分化。共现性网络分析显示,随养殖过程推进,微生物互作网络复杂度降低。功能预测分析显示,细菌次生代谢产物的生物合成、转运和分解代谢等功能主要在养殖前期出现显著性差异,而养殖后期饵料组间无显著性差异。试验结果表明,蟹公寓养殖过程中,不同饵料会对拟穴青蟹的肠道菌群造成影响。与杂鱼组相比,高蛋白配合饲料在维持肠道菌群多样性方面有一定优势,同时未显著影响肠道细菌群落结构和功能。     

大黄鱼选育子二代生长性状研究

通过对选育和未选育2个群体大黄鱼（Larimichthys crocea）繁育得到的子代的卵径、油球径和口径进行测量,以及对其子代养殖过程中的生长性状进行测量比较,分析选育效果。结果显示,选育大黄鱼子代（XY-F2）和未经选育大黄鱼子代（HB-F1）平均卵径、平均油球径和平均口径之间差异不显著（P〉0.05）。拟合1~10月龄XY-F2和HB-F1的体长（x）、体质量（y）的生长曲线及体长（x）与体质量（y）的关系表明,两群体间体长（x）与体质量（y）的关系存在差异;XY-F2在体长（x）和体质量（y）的生长在后期高于HB-F1。分析其数量性状,选育子一代（XY-F1）2龄鱼体长、体质量现实遗传力分别为0.26、0.18,而XY-F2的体长、体质量现实遗传力分别为0.029、0.134。结果说明选育具有一定的作用,今后选育应该结合家系选择和家系内选择进行。     

围网与普通网箱养殖大黄鱼营养成分的比较与分析

大黄鱼Larimichth ys crocea (Richardson)是我国重要的海洋经济鱼类,传统养殖的大黄鱼肉质已明显不如野生大黄鱼.本实验采用临近海区不同的养殖模式(围网与普通网箱)养殖的大黄鱼肌肉来研究其营养成分(包括常规营养成分和游离氨基酸)的含量与营养评价.结果表明:围网养殖大黄鱼的粗蛋白、氨基酸总量、呈...     

基于生长和死亡参数变化的官井洋大黄鱼资源现状分析

依据2010—2011年福建官井洋水域渔业资源监测调查资料,对2 098尾大黄鱼的体长、体质量、生长、性腺进行测定。据此,利用von Bertalanffy生长方程和死亡参数分析官井洋大黄鱼资源现状,并讨论了拐点年龄,临界年龄等渔业生物学特征。结果表明,目前官井洋大黄鱼平均体长132.6 mm,优势体长组为110～150 mm,占55.96%;平均体质量45.1 g,优势体质量组为10～50 g,占61.77%,大黄鱼幼鱼和补充群体已成为渔业生产的主要捕捞对象。大黄鱼体长—体质量间的关系式为W=2.001×10-5L3.006。用ELEFAN技术拟合的von Bertalanffy生长方程参数分别为L∞=385.4 mm、k=0.43及t0=-0.32a,拐点年龄为2.2龄。对照20世纪80年代福建近海海域大黄鱼群体L∞值从555.4 mm下降到现在的385.4 mm,拐点年龄由2.97下降到2.2,均表明当今大黄鱼群体小型化且低龄化严重。生长系数k由0.36增长到0.43表明大黄鱼的生长速度加快。总死亡系数(Z)为3.12,自然死亡系数(M)为0.45,捕捞死亡系数(F)为2.67,资源开发率(E)为0.856。大黄鱼M值出现上升,可能与福建近海环境质量下降有关,而高强度的捕捞促使大黄鱼捕捞死亡系数由0.84上升到2.67,说明大黄鱼资源已经处于过度开发状态。在官井洋大黄鱼现行资源状态下,应努力降低捕捞死亡水平,保护大黄鱼生存环境,而对目前以小型化和低龄化为主的大黄鱼群体,建议以控制大黄鱼的开捕年龄(t0)为主。     

Intestinal Microbiota in Large Yellow Croaker,Larimichthys crocea,at Different Ages

The polymerase chain reaction–denaturing gradient gel electrophoresis (PCR‐DGGE) of 16S ribosomal RNA gene was used to investigate bacterial communities in the intestines of large yellow croaker at six different ages (12 d, 18 d, 26 d, 40 d, 3 mo, and 1 yr old) as well as within the corresponding feed and culture water. In addition, Illumina Miseq sequencing was utilized to compare intestinal microbiota between 12‐d‐old and 1‐yr‐old individuals. PCR‐DGGE results revealed that the culture water had the highest bacterial diversity, followed by the feed, while the intestines had the lowest diversity. The intestinal microbiota at six ages changed severely; however, the change did not follow any trend. The large yellow croaker intestines harbored specific bacterial communities that differed from those in both feed and water. Illumina Miseq sequencing results revealed that the diversity of intestinal bacteria in 12‐d‐old fish was higher than that in 1‐yr‐old fish, and the bacterial composition differed significantly between them. γ‐Proteobacteria and Pseudoalteromonas supplied the most abundant phylum and genus in the 12‐d‐old fish intestine. However, in the 1‐yr‐old fish intestine, Firmicutes and Clostridium were the most dominant, respectively. The study may contribute to a better understanding of gut microbiota and dynamics of the large yellow croaker and the relationship with their surrounding environment.     

应用RFLP和DGGE技术分析工厂化养殖凡纳滨对虾肠道微生物群落特征

本研究应用PCR-RFLP(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism)和PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术,对工厂化养殖的凡纳滨对虾肠道菌群进行多样性分析。RFLP结果显示,8月样品中不同的克隆子为5个,其中以不可培养细菌(Unculturable bacteria)为主要优势菌,其次为鲁杰氏菌属菌种Ruegeria spp.和Rhodobacterales spp.。依据微生物多样性的覆盖率分析结果表明,所构建16S rDNA克隆文库的覆盖率为97.5%。10月样品中克隆子为8个,其中以不可培养细菌、芽孢杆菌属Bacillus spp.和弧菌属Vibrio spp.为主要优势菌属,其次为Photobacterium spp.和Neptunomonas spp.;所构建16S rDNA克隆文库的覆盖率为90.8%。应用DGGE分析8月和10月对虾肠道样品,菌群以不可培养细菌和弧菌属为主,其次为Streptomyces spp.、Ruegeria spp.、Enterococcus spp.和Photobacterium damselae。     

大黄鱼（♀）与黄姑鱼（♂）人工杂交子代的胚胎发育

2008年10月,在福建宁德水产技术推广站进行了大黄鱼（Pseudosciaena crocea,♀）×黄姑鱼（Nibea alb-iflora,♂）杂交,观察了杂交子代胚胎发育。大黄鱼和黄姑鱼亲鱼平均体质量和体长分别为405 g、27.9 cm和390g、24.8cm,采用干法人工授精。受精卵浮性,为单油球端黄卵,卵径1060～1500μm,油球379.8μm左右。在水温25.8～26.2℃,盐度26的条件下,经18h55min半数受精卵破膜,胚胎发育分为卵裂期、囊胚期、原肠期、肌节出现期、心跳期、肌肉效应期、出膜前期和出膜期,初孵仔鱼全长2.75～2.98mm,受精率约为14.4%,孵化率约为31.9%,畸形率约为30%。共培育杂交初孵仔鱼5万尾。3日龄仔鱼开口摄食轮虫,7日龄开始摄食小型挠足类。     

大黄鱼（♀）与黄姑鱼（♂）人工杂交子代的胚胎发育

2008年10月,在福建宁德水产技术推广站进行了大黄鱼（Pseudosciaena crocea,♀）×黄姑鱼（Nibea alb-iflora,♂）杂交,观察了杂交子代胚胎发育。大黄鱼和黄姑鱼亲鱼平均体质量和体长分别为405 g、27.9 cm和390g、24.8cm,采用干法人工授精。受精卵浮性,为单油球端黄卵,卵径1060～1500μm,油球379.8μm左右。在水温25.8～26.2℃,盐度26的条件下,经18h55min半数受精卵破膜,胚胎发育分为卵裂期、囊胚期、原肠期、肌节出现期、心跳期、肌肉效应期、出膜前期和出膜期,初孵仔鱼全长2.75～2.98mm,受精率约为14.4%,孵化率约为31.9%,畸形率约为30%。共培育杂交初孵仔鱼5万尾。3日龄仔鱼开口摄食轮虫,7日龄开始摄食小型挠足类。     

饲料中添加甘氨酸可提高大黄鱼(Larimichthys crocea)的抗氧化和抗应激能力

为研究饲料甘氨酸对大黄鱼(Larimichthys crocea)抗氧化和抗应激反应的影响,将初始体重为(130.35±8.37)g的大黄鱼随机分成6组,每组3个重复,每个重复(网箱)50尾鱼.在基础饲料中分别添加不同梯度的甘氨酸(0、0.6％、1.2％、2.4％、4.8％和6.0％),配制出甘氨酸实测含量分别为(1.58％、2.15％、2.75％、3.96％、6.33％和7.51％)的6种实验饲料.经过30 d养殖后,对大黄鱼进行拖网应激实验.结果表明,养殖实验结束后,饲料处理未对大黄鱼的存活和体成分产生显著影响.肝脏总抗氧化能力在饲料甘氨酸含量为2.75％时达到最大值,而丙二醛的含量在甘氨酸含量为3.96％时达到最小值,但与2.75％组无显著差异(P＞0.05).以肝脏总抗氧化能力为评价指标,根据二次曲线回归模型得出大黄鱼饲料中甘氨酸的适宜含量为3.57％.血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶的活性均在饲料甘氨酸含量为2.75％时呈现最小值(P＜0.05).在拖网应激前,饲料甘氨酸含量为2.75％时,大黄鱼血清皮质醇的含量最高.在拖网应激后,该处理的大黄鱼血清皮质醇的变化幅度最小,而此时的血糖维持在较高水平.综合考虑大黄鱼的抗氧化和抗应激能力,本研究推荐大黄鱼饲料中甘氨酸的适宜含量为2.75％-3.57％.