嗜水气单胞菌单克隆抗体的制备及特性分析

利用杂交瘤单克隆抗体技术制备了AHYT—1和AHl05012株嗜水气单胞菌的菌体单抗，筛选出11个能稳定分泌抗嗜水气单胞菌单克隆抗体的细胞株，并对这些单抗进行了特性分析。经单抗类型测定，这些单抗分属IgM、IgG2a2个亚类，且均具有ELISA反应特性，腹水抗体效价在1：10^4—1：10^6，其中单抗4G4、2H4、GH9具有免疫荧光特性。ELISA特异性分析结果表明，4G4、2H4、FA4、GH9、CF2为嗜水气单胞菌血清型特异性单抗，4G4、2H4识别同一种血清型的嗜水气单胞菌分离株，而FA4、GH9、CF2却识别另外一种血清型的嗜水气单胞菌，并且与其他血清型的嗜水气单胞菌、温和气单胞菌以及鳗弧菌、爱德华氏菌、克鲁氏耶尔森菌、大肠杆菌、荧光假单胞菌均不反应。Western-blot结果表明，单抗4G4、2H4、FA4所针对的抗原是菌体脂多糖(LPS)，且它们所识别的LPS抗原表位不同。菌体单抗研究结果表明，4G4、2H4和GH93株单抗可应用于嗜水气单胞菌的诊断和血清分型。本研究目的旨为建立一种快速诊断鱼类嗜水气单胞菌病的方法和血清分型方法。     

运动性气单胞菌分离、鉴定方法的研究与应用

通过碱性蛋白胨水（APW）的增菌效果与气单胞菌培养基（RYAN）的选择性效果试验，以及对运动性气单胞菌（Motil aeromonads）的培养特性、鉴定特征的比较观察，建立了运动性气单胞菌细菌学分离和鉴定的实验室检测程序。对8个模拟阳性样品进行检测，结果感染菌包括4株嗜水气单胞菌（A.hydrophila）、2株温和气单胞菌（A.sobia）和2株豚鼠气单胞菌（A.cavias）全部被分离到。对鱼粉、肉骨粉、牛肉粉、蛤蚧等60个动物产品样品，5个饲养牛蛙、鲫鱼和泥鳅的水样；6个牛蛙、鲫鱼、金鱼的病料进行检测，结果分离到20株运动性气单胞菌，其中8株嗜水气单胞菌，8株温和气单胞菌和4株豚鼠气单胞菌，实验表明，所建立的分离和鉴定方法是一种简便、快速和敏感的方法，其检测程序不仅运用于进出境动物产品和环境样品的检测，也可用于动物以及淡水养殖动物气单胞菌病的诊断和监测。     

耐喹诺酮类药物嗜水气单胞菌的分离鉴定及电镜观察

本研究对吉林省内12个水域采集和送检的66尾病鱼进行细菌分离鉴定,共检出46株嗜水气单胞菌疑似株,通过生化试验和PCR扩增气溶素基因aer鉴定法,确定其中22株为嗜水气单胞菌。进一步采用纸片扩散法和双倍稀释法测定嗜水气单胞菌分离株对多种抗生素的耐药性,其中部分菌株存在不同程度的耐药性,22株嗜水气单胞菌中有4株对喹诺酮类药物耐药,并且为交叉耐药。其对喹诺酮类药物的抑菌圈均小于19mm。嗜水气单胞菌耐喹诺酮类药物的检出率为18 2%。将病料中分离的8株嗜水气单胞菌在电镜下观察发现,2株耐药菌表面发现均匀分布的球形结构,而6株敏感菌表面未见此结构。     

鳖三种气单胞菌的分离与药物敏感试验

在1997～2001年对广东、湖南等地70个鳖养殖场进行常见病的调查研究、分离纯化病原后进行生化试验，鉴定出11株嗜水气单胞菌、11株豚鼠气单胞菌、6株寡源气单胞菌等，经过毒力试验后．选出较强毒力的11株细菌，用15种药物进行敏感性试验筛选出敏感药物，为药物的临床应用提供依据。     

嗜水气单胞菌温敏胞外蛋白酶基因eprJ的克隆与检测

根据已发表的人源嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)温敏胞外蛋白酶基因eprA1的核甘酸序列,设计合成一对引物,以嗜水气单胞菌鱼源株Ah J-1基因组DNA为模板,通过PCR扩增得到1 005 bp的胞外蛋白酶基因eprJ1,将该基因片段连接到pMD18-T载体中,构建克隆载体pMD-eprJ1。序列分析发现,其与发表的Ah AH1的胞外蛋白酶eprA1基因的同源性有91%。根据测序结果在保守区重新设计一对引物以增强特异性,扩增片段大小为387 bp。对1990~2004年15年间从浙江、福建、湖北及江苏等地不同患病水产动物肝肾等脏器分离到的23株Ah检测结果显示,从中国东南地区分离的21株Ah水生动物致病性菌株扩增均为阳性,2株Ah非致病性菌株为阴性,推测该基因普遍存在于致病性Ah中。检测模板DNA的灵敏度可达1.5×10-3ng/μL。     

鱼源气单胞菌的毒力基因检测、分型及致病力

为调查鱼源气单胞菌毒力基因与其致病力的相关性,以2009—2018年从不同患病鱼分离的173株气单胞菌为研究对象,通过检测毒力相关基因、测定溶血活性、腹腔注射感染异育银鲫等方法开展评价。通过管家基因gyrB分子鉴定结果显示,173株气单胞菌中维氏气单胞菌(119/173,68.9%)和嗜水气单胞菌(50/173,28.9%)是主要流行的菌株。10个毒力基因aer(162/173,93.64%)、act(131/173,75.72%)、ast(55/173,31.79%)、alt(58/173,33.53%)、lip(152/173,87.86%)、exu(154/173,89.02%)、fla(143/173,82.66%)、gcaT(148/173, 85.55%)、 eprCAI(41/173, 23.70%)和ahyB(51/173, 29.48%)普遍存在于173株气单胞菌中。依据检测到的毒力基因数量从多到少分布情况,这些菌株可分为7大类(Ⅰ～Ⅶ)53个毒力基因型。大部分嗜水气单胞菌检测到8～10个毒力基因,主要分布于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类基因型;维氏气单胞菌的eprCAI、ahyB、 ast和alt等4个毒力基因检测率低,主要分布于Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ类基因型。大部分气单胞菌(94.22%,163/173)具有溶血活性。代表性毒力基因型的38株维氏气单胞菌和20株嗜水气单胞菌腹腔注射异育银鲫攻毒结果显示,3.0×106 CFU/尾的剂量下,3株维氏气单胞菌使鲫死亡率达80%～100%,16株嗜水气单胞菌使鲫死亡率达90%～100%。研究表明,维氏气单胞菌是目前最主要流行的气单胞菌,但其检测到的毒力基因普遍少于嗜水气单胞菌,且对异育银鲫的致病力普遍弱于嗜水气单胞菌。本研究能够为气单胞菌败血症的流行病学调查和疫苗研究提供理论依据。     

日本鳗鲡体表溃疡病病原菌的分离、鉴定及单克隆抗体制备

从日本鳗鲡(Anguilla japonica)体表溃疡病的肝脏分离到一株优势细菌JS70322NA,经人工感染证实为引起日本鳗鲡体表溃疡病的病原菌.通过形态学观察、API 20E细菌鉴定试剂盒鉴定、生理生化试验和16S rRNA特异性基因分析,鉴定该菌为嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila).JS70322NA为典型的β-溶血,血清型为O∶9.以甲醛灭活的JS70322NA为抗原免疫Balb/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备出3株抗嗜水气单胞菌的单克隆抗体,分别命名为:1A5、1B8、1F3;其腹水效价分别达1.0×10-6、1.0×10-5、1.0×10-6;细胞亚型分别为IgG2a、IgM、Ig2a;3株单克隆抗体与温和气单胞菌(Aeromonas sobria)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)等6种水产常见致病菌无交叉反应,特异强,可应用于日本鳗鲡嗜水气单胞菌特异性检测.     

14株患病水生动物气单胞菌属细菌的分离鉴定与最佳治疗药物筛选试验

从患病甲鱼、河蟹、牛蛙、鲫体内共分离到14株气单胞菌属细菌,对它们进行了生化鉴定和药敏试验。根据药敏试验结果,选取1株嗜水气单胞菌(J50503-1)和1株温和气单胞菌(NT712-10)作了最小抑菌浓度试验和人工感染及治疗试验。结果表明,氟苯尼考对上述细菌有很好的防治作用。     

嗜水气单胞菌气溶素单克隆抗体的制备及初步应用

以1％福尔马林灭活的嗜水气单胞菌纯化的气溶素免疫8周龄的BALB／C小鼠，取其脾细胞与SP2／0细胞融合，经间接ELISA筛选，获得1株稳定分泌气溶素单克隆抗体的杂交瘤细胞，命名为A2D3。腹水单抗ELISA效价为1：16，384（1：2^14），其能特异性抑制气溶素的溶血活性并且腹水单抗有中和特性，抑制效价和中和效价分别为1：128（1：2^7）和1：128（1：2^7）。以此单抗建立了检测嗜水气单胞菌气溶素的问接ELISA方法，对临床分离的50株嗜水气单胞菌培养上清检测，有48株呈阳性反应。     

微量菌鉴系统在水产养殖中的应用

运用专门检测发酵性革兰氏阴性杆菌的微量菌鉴系统——CDRC-菌鉴系统，鉴定水产养殖中分离自患病动物血液、肝胰腺和养殖水体的9个菌株，鉴定结果为9个菌株均为弧菌科细菌，其中4株属于气单胞菌属，分别为嗜水气单胞菌、温和气单胞菌和豚鼠气单胞菌，其余5株属于弧菌属，为副溶血性弧菌和溶藻弧菌。     

齐口裂腹鱼败血症的病原分离与鉴定

从发生败血症的齐口裂腹鱼体内分离出2株致病菌，通过细菌的形态特征、培养特性和生化实验鉴定为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。经人工感染健康鱼表现出与自然病鱼相同的症状，并从人工感染死亡鱼中分离获得同种细菌，证实齐口裂腹鱼败血症的病原为嗜水气单胞菌和温和气单胞菌。药敏实验结果表明新霉素、头孢三嗪、庆大霉素对其高度敏感，红霉素、羧苄青霉素、氮苄青霉素和磺胺等不敏感。     

嗜水气单胞菌细胞外膜蛋白及S层蛋白分析

用十二烷酰肌氨酸盐抽提结合超速离心纯化，制备了19株典型嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)和1株温和气单胞菌（A.sobria)的主要外膜蛋白（MOMP）。根据SDS-PAGE图谱，将其中的14株菌分为3个MOMP组，I组的主要蛋白带为40kD和43kD，Ⅱ组的主要蛋白带为40kD和50kD,Ⅲ组的主要蛋白为40kD、46kD和50kD.MOMP组和血清型间没有严格的关系。用兔抗嗜水气单胞菌体抗原为第一抗体进行免疫印迹实验。结果显示，所有被试菌株都能产生强阳性反应，其中40kD的蛋白带为大多数菌株所共有，且具有相似的免疫原性，是构成菌体抗原的重要免疫原。用0.2mol/L甘氨酸缓冲液（pH4.0)处理上述菌株培养物，结果仅有嗜水气单胞菌ZY01-g3能够分离到丰富的S层样蛋白，其分子量约为52kD，而分子量约为52kD，而其他菌株未能分离到典型的S层样蛋白，表明S层蛋白的分布有限。     

嗜水气单胞菌及其致病机制

嗜水气单胞菌(Aeromonas hyrdochila)足一种革兰氏阴性发酵性杆菌，在伯杰氏系统鉴定细菌学手册第九版中属弧菌科气单胞菌属。该菌在自然界中的分布极为广泛，几乎有水。导在的地方，都能分离检测到该细菌，嗜水气单胞菌的致病性非常广泛。这种广泛性表现在两方面。     

27株嗜水气单胞菌致病性及ERIC—PCR指纹图谱分析

从福建省淡水养殖鱼类体内分离到27株嗜水气单胞菌,根据嗜水气单胞菌16SrDNA基因和气溶素基因（aerolysin）的保守序列,设计2对引物,对所分离到的27株嗜水气单胞菌进行双重PCR扩增,扩增结果表明,其中18株为含有Aer毒力基因的潜在致病性嗜水气单胞菌,占总菌数的66．67％。应用ERIC-PCR分型技术对27株嗜水气单胞菌菌株进行分析,以相似度54．00％为限,所有菌株可分为Ⅰ和Ⅱ两大聚类,以76．00％相似度为界,27株嗜水气单胞菌可分为11个聚类,同一个聚类中菌株分离区域基本相同。分析结果表明,分离的嗜水气单胞菌基因型的多样性和分离地域具有一定的关联,也表明ERIC-PCR可以有效应用于嗜水气单胞茵分子流行病学调查。     

鲤隐性败血症病原菌的分离与鉴定

本文对东北地区流行的鲤隐性败血症进行了病原菌的分离、人工感染、病原菌生理、生化特性和药物敏感性的测定,观察了病理组织变化等。从病鱼内脏分离到场22株致病菌,其中标7株的生长及生化特性均符合嗜水气单胞菌种的特性,嗜水气单胞菌hec毒素检测呈阳性。有3株菌V—P(-)、赖氨酸(-)、葡萄糖产气(-)是区别嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)及温和气单胞菌(A．Sobrie)主要特征,这三株菌符合豚鼠气单胞菌(A．Caviae)种的特征。     

豫北地区主要淡水鱼类感染嗜水气单胞菌的流行病学调查

对豫北地区嗜水气单胞菌引起的细菌性败血病进行流行病学调查,分离鉴定致病性嗜水气单胞菌菌株,并对致病性嗜水气单胞菌菌株进行毒力验证和药敏试验。采集4个养殖场病鱼标本及水样,每月进行流行病学调查,利用生理生化及分子生物学方法检测嗜水气单胞菌的分布状况。结果显示,筛选出52株为嗜水气单胞菌,其中32株为致病性嗜水气单胞菌,20株为非致病性嗜水气单胞菌,且致病性嗜水气单胞菌主要分布在7—9月份,毒力验证试验表明,32株致病性菌株的毒力大小差异明显,筛选出强毒株XDMG(4),为后期试验的疫苗株做准备;药敏试验表明,不同菌株对同一种药物的药敏结果不同,但大部分药物的药敏结果基本一致,70%以上的致病性菌株对头孢哌酮、氟本尼考、菌必治、阿米卡星等抗菌药物表现为高度敏感,对青霉素类药物表现为高度耐药性,耐药率达100%,对氨基糖苷类(不包括阿米卡星)、磺胺类、四环素等药物呈现不同程度的耐药性,具有多重耐药性。本试验旨在丰富本地区的鱼类细菌性败血病的病原资料,并为该菌引起的人类疾病的防控提供科学依据。     

水族箱气单胞菌的鉴定及致病特性分析

为了确定南京市某渔场发病鱼感染的病原,本研究采集患鱼脏器,采用平板培养、生化实验和特异性gyrB基因扩增测序等方法进行细菌的分离鉴定;利用PCR技术检测分离株毒力基因的分布,分析其生物学特性,并进一步通过动物实验确定菌株致病力.结果分离到1株水族箱气单胞菌,命名为LK-25.该菌株携带5种主要毒力基因:气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(act)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、温敏胞外蛋白酶(epr)和丝氨酸蛋白酶(ahp),其溶血性和溶蛋白能力较强,对斑马鱼的半数致死量为1.02×103 CFU/尾,确定为强毒株.进化树分析表明,水族箱气单胞菌与嗜水气单胞菌达卡亚种亲缘关系较近.本研究在国内首次报道发现水族箱气单胞菌,为进一步预防该菌所引起的相关疾病的发生和传播提供理论基础.     

Identification and antibiotic sensitivity experiment of Aeromonas hydrophUa isolated from skin ulcer of artificial breeding Anguilla anguilla

从福建诏安患病的人工养殖欧洲鳗鲡体内分离到1株致病菌,人工回归感染实验显示分离的菌株能使欧洲鳗鲡致病死亡,且临床症状与自然病例相似。分离菌具有β-溶血性;可在含盐量4%的培养基上生长;革兰氏染色呈阴性,短杆状,具有运动性;其生化反应特性与其他水生动物源的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）相同;16S rRNA基因序列分析结果显示：分离菌株在系统发育树上与A.hydrophila属同一分支,相似性达99.8%。根据分离菌株的形态、生理生化特性,结合16S rRNA序列测定（GenBank登录号为JN391411）与系统发育分析,将其鉴定为嗜水气单胞菌（A.hydrophila）。药敏试验结果表明分离菌对头孢噻肟钠、氟苯尼考、复方新诺明、奥复星、头孢吡肟、头孢孟多、左氟沙星等高度敏感。     

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

中华鳖气单胞菌菌细胞苗和菌化学成份疫苗研制

利用分离自中华鳖的嗜水气单胞菌Ａｈ９６１００４、Ａｈ９６０９１６和Ａｈ９７０５１６与温和气单胞菌Ａｓ９７０５１０菌体及其上清制备灭活苗细胞苗和化学成份疫苗。肌肉注射中华鳖进行免疫，加强免疫１５ｄ后，用菌株Ａｈ９６１００４腹腔注射进行攻击，观察２０ｄ。结果表明，温和气单胞菌Ａｓ９７０５１０株的菌苗及其胞外分泌物（ＥＣＰ）苗组和嗜水气单胞菌Ａｈ９６１００４株的外膜成份组对嗜水气单胞菌的攻击的保护率最高