黄鳍鲷基因组微卫星的分离

采用磁珠富集法构建黄鳍鲷(Acanthopagrus latus Houttuyn)基因组微卫星富集文库。共挑选60个克隆进行测序,分析发现58个克隆分别含(GA)n或(CA)n两碱基重复单元。进一步通过序列比对,最终获得41个具有特异微卫星序列的阳性克隆。其中,23个克隆含有(GA)n或(CT)n两碱基重复序列,17个克隆含有(GT)n或(CA)n重复序列,另1个含有以上两种重复类型。获得的微卫星序列中,单一型及间断型序列各有20条,另有1条属于复合型序列。序列长度为117~512 bp,平均259 bp。微卫星核心序列两碱基重复5到38次,绝大多数序列重复次数大于10。基于微卫星两端的侧翼序列设计并获得了3对能够在黄鳍鲷基因组有效扩增的微卫星引物。本研究旨为进一步开展黄鳍鲷分子育种及资源评价分析提供基础资料。     

哲罗鱼基因组微卫星富集文库的构建与分析

采用磁珠富集法构建哲罗鱼（Hucho taimen Pallas）荩因组微卫星文库。哲罗鱼基因组DNA经MboⅠ限制性内切酶消化后，选取400-900bp的片段，用生物素标记的简单重复序列（ACA）15作探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，获得目的片段，连接T载体克隆，构建基因组微卫旱富集文库。再用同位素标记的（ACA）15探针进行二次筛选，筛选出686个阳性克隆，阳性克隆率为35．94％。对其中140个阳性克隆进行测序，共获得149个微卫星序列，4个小卫星序列，其GenBank Accession Number为DQ110955～DQ121108。其中perfect（完美型）62个，占41．61％；imperfect（非完美型）92个，占61．74％；compound（混合型）5个，占3．36％，重复次数主要分布于6～45（81．21％），平均重复次数为32．5，这表明（ACA／TGT）。在哲罗鱼基因组DNA中含最非常丰富。本研究旨为从DNA水平上研究哲岁鱼种群结构、遗传多样性及目前群体现状等方面提供有效工具。     

斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究

采用(CA)_(12)(AG)_(12)及(TA)_(16)生物素标记探针及磁珠富集法构建了斑节对虾Penaeus monodon基因组微卫星富集文库。随机挑选254个克隆进行PCR筛选,得到51个候选克隆(20．1%)。其中,32个克隆来源于CA-文库,另19个克隆来源于AG-文库。测序发现48个克隆含有微卫星重复单元,通过序列比对,最终获得40个具有特异微卫星序列的阳性克隆。微卫星(GA/CT)_N及(CA/GT)_n 2碱基重复序列分别占所有分离的微卫星数目的20．7%及60．4%。此外,还检测到其它多种微卫星重复类型,如(AT)_n、(GC)_n、(TGG)_n、(AAG)_n、(AAT)_n、(GAA)_n、(GTGC)_n、(GCGT)_n、(GGTTA)_n、(GTGCGT)_n,占检测到的微卫星数目的18．9%。获得的微卫星序列中属于完全型序列的有76条(68．5%),不完全型序列的有22条(19．8%),另有13条属于复合型序列(11．7%)。微卫星(GT/CA)_n 2碱基重复次数(3～52次)要远大于(GA/CT)_n 2碱基次数(3～27次)。获得的微卫星序列长度大小范围为129～601 bp,平均为286 bp。研究为进一步开展斑节对虾分子育种及资源评价分析提供了基础资料。     

磁珠富集法制备大口鲶的微卫星分子标记

通过磁珠富集的方法分离大口鲶（Silurus meriaionalis）的微卫星分子标记。将基因组DNA酶切，梯度离心收集400～900bp片段并纯化，连接Brown接头，用生物素标记的寡核苷酸（CA）15作探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，然后将这些片段洗脱，PCR扩增，进行克隆构建“基因组文库”，再通过同位素标记的探针（CA）15进行2次杂交筛选，所得到的阳性克隆测序。从所获得593个阳性克隆中选取178个经测序，97．19％（173个）含有微卫星序列，90．60％重复数在10以上，75．98％为完美型。除探针中使用的CA重复单元外，还观察到Cr、GA、ATG的重复序列。设计获得120对微卫星引物，合成40对经PCR筛选，结果31对引物扩增出多态性条带。显示出，磁珠富集法是获得微卫星分子标记的一种有效的方法，可成为今后发展该标记的主要方法。同时，制备出的微卫星标记可为今后研究大口鲶的分子遗传育种提供有用的遗传标记。     

团头鲂微卫星标记的快速制备

采用磁珠富集法与放射性杂交相结合开发团头鲂（Megalobrama amblycephala）基因组微卫星资源。以团头鲂基因组DNA为材料，经Sau 3AⅠ限制性内切酶消化后，选取400～900bp的片段进行PCR全基因组扩增，并利用生物素标记的（CA）15探针进行微卫星片段的富集。将得到的片段与T载体连接后转入DH5α大肠杆菌中，然后利用γ-32P标记的放射性同位素探针进行第二轮杂交。结果表明，共获得微卫星基因组文库2000个菌，杂交前菌落PCR检测阳性克隆率为50％；杂交后得到的阳性克隆为230个，占11．5％。从得到的230个阳性克隆中挑出120个进行测序，有94个克隆含有重复次数大于5次的微卫星序列，其中46个（48．94％）有随机侧翼区，可以设计引物；14个缺乏足够的侧翼序列。在得到的微卫星序列中，重复单元除CA／GT外，还观察到CT、AG、CG、CAA、CTCA等重复单元。在单一型标记中，完美础占53．15％，非完美型为37．84％；混合型标记占9．01％。另外，微卫星重复次数主要集中在5-30次，占75．68％。本研究旨在对团头鲂基因组资源的开发利用起到一定的促进作用，并为团头鲂养殖品系的优化、遗传多样性的检测及遗传图谱的构建等奠定基础。     

溶藻弧菌诱导马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库的构建及分析

为了探讨马氏珠母贝免疫防御机制,筛选免疫防御相关功能基因,以致病性溶藻弧菌人工感染的马氏珠母贝血淋巴为材料,采用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建了溶藻弧菌诱导的马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库;以马氏珠母贝管家基因β-actin作为差减指标检测该文库的差减效率;对选取的600个阳性克隆进行测序及生物信息学分析。结果显示,该文库的差减效率可达210倍;PCR阳性检测显示差减片段为100~750 bp,对随机挑取600个克隆的测序结果显示,共获得414个有效EST序列;通过BLAST同源性比对,有167个EST序列(占40.34%)与NCBI数据库中已知功能蛋白质具较高同源性,其中7个EST序列(占1.69%)与免疫防御相关基因同源;此外,204个EST(占49.28%)在数据库中未发现同源序列。研究表明,SSH技术能有效富集马氏珠母贝血淋巴差异表达基因,研究结果为探索马氏珠母贝免疫基因作用机理和调控机制奠定了基础。     

兰州鲇（CAG）n、（GATA）n微卫星文库构建与鉴定

应用磁珠富集法构建兰州鲇（ Silurus lanzhouensis） CAG重复和GATA重复的微卫星文库,并分析其序列特征。兰州鲇基因组DNA经MseI酶切,选取200～800 bp的片段与生物素标记的探针（CAG）8和（GATA）6杂交,捕获到含有微卫星序列的目的DNA片段连接到pMD19-T载体,转化到大肠杆菌DH5α菌株中构建微卫星富集文库,经PCR检测筛选出阳性克隆进行测序。从126个阳性克隆中随机选取96个进行测序,获得59个微卫星序列（ GenBank登录号： KJ545973～KJ545998, KJ598088～KJ598120）。其中完美型31个（52.54％）、非完美型20个（33.9％）、混合型为8个（13.56％）。根据侧翼序列,成功设计48对引物,选取25对微卫星引物在10个个体进行扩增与多态性筛选,共获得10对多态性引物。结果表明,经优化的磁珠富集法能够高效地获得兰州鲇微卫星标记,这些标记将为兰州鲇种质资源保护、微卫星连锁图谱构建、经济性状的QTL定位及分子标记辅助选育奠定基础。     

磁珠富集法分离草鱼微卫星分子标记

磁珠富集法是一种快速、高效的分离微卫星分子标记的方法。本研究通过该方法分离草鱼的微卫星分子标记。将草鱼（Ctenopharyngodon idella）基因组DNA经Sau3AI酶切，同收纯化400～900bp片段，连上接头，构建“基因组PCR文库”。用生物素标记的简单重复序列（CA）15作探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，经一系列的洗涤过程，去除磁珠表面不含有微卫星的片段。将吸附在磁珠上的片段洗脱，PCR扩增放大，再进行克隆和测序，根据微卫星两端的保守序列设计引物，即可得到微卫星分子标记。本研究义通过同位素标记的探针（CA）15进行二次杂交筛选，获得阳性克隆132个，所得到的阳性克隆经测序，86．36％含有微卫星序列，共获得130个微卫星DNA序列。用引物设计软件Primer Premier5．0没计引物83对。     

马氏珠母贝EST微卫星的筛选

构建了马氏珠母贝的血液、足、鳃、胃、肝、心脏、外套膜、珍珠囊和感染多毛虫马氏珠母贝的血液(血感)等9个组织的cDNA文库,测序获得了6979个EST序列,从中查找到了268个重复序列,隶属于243个EST,含微卫星的EST数占EST总数的3.48%.珍珠囊cDNA文库含微卫星的序列所占比例最高,为6.16%,血感的最低,为1.65%.双碱基重复序列130个,占48.5%,(AT/AT)n类型最常见;三碱基类型的83个,占约31%,其中(AAT/ATT)n和(AAG/CTT)n较多;四碱基重复的有30个,占11.2%,(AAAT/ATTT)n占了该类型的约50%.一共能够设计151对微卫星引物,有130对可以扩增,占合成引物总数的86.09%,其中,多态性引物45对.多态性EST-SSR的筛选将为马氏珠母贝的分子遗传学研究、种质鉴定和野生资源保护等提供可靠的工具.     

马氏珠母贝TLR6基因的克隆、序列分析与表达

为了探究TLR6(Toll like receptor 6)在马氏珠母贝免疫反应中的作用,实验采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得了马氏珠母贝TLR6基因(Pm-TLR6)c DNA全长序列,并且运用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术检测了Pm-TLR6在马氏珠母贝各组织中的表达情况、哈维氏弧菌刺激后和植核移植后血淋巴中的表达模式。结果显示:Pm-TLR6c DNA全长2295 bp,其中5′非编码区(UTR)长94 bp,3′UTR长89 bp,开放阅读框(ORF)长2112 bp,编码703个氨基酸;多序列比对结果表明物种间TLR6具有较高的保守性;PmTLR6具有跨膜域、富含亮氨酸的重复序列(LRRs)和TIR域,符合TLRs家族特征。q RTPCR数据分析表明,Pm-TLR6在马氏珠母贝肝胰脏、血细胞、鳃、性腺、闭壳肌、外套膜中均有表达,其中肝胰脏中表达量最高;哈维氏弧菌刺激后,Pm-TLR6在2 h表达上调,约为对照组(0 h)的9倍,随后的6 h恢复至正常水平,直至16 h表达水平开始回升并于24 h达到最大表达量,是对照组的29.4倍,具有显著性差异;植核移植实验结果显示PmTLR6在植核后5和10 d表达水平没有显著性变化,15和20 d表达量出现上升趋势,但差异不显著,最后于30 d达到最大值,约为空白对照组(0 d)的5倍,具有显著性差异。研究表明,Pm-TLR6可能在马氏珠母贝免疫防御反应中担任着重要的角色。     

马氏珠母贝亲代选择对子一代的影响

研究了马氏珠母贝不同亲本规格对后代的影响,以期为育种和苗种生产中的亲贝选择提供科学的理论指导。试验从来自同一养殖群体的2000个随机个体马氏珠母贝中选取规格最大（壳长55.89±1.65mm）、中等（壳长48.55±0.81mm）、最小（壳长42.22±2.51mm）的性成熟个体各50个作为亲贝（♀∶♂=1∶1）,按规格分成大、中、小3组,分别进行各组内亲本个体群交,在相同环境及试验条件下分析亲本选择对子代生产性能的影响。结果表明,大规格亲贝优于中规格亲贝（P〈0.05）;中规格亲贝优于小规格亲贝（P〈0.05）;马氏珠母贝亲代选择对子一代生产性能具有显著影响（P〈0.05）。这表明马氏珠母贝大规格亲贝群交后代表现出明显的生长优势,截断选择策略有效。     

马氏珠母贝不同地理种群内自繁和种群间杂交子一代形态性状参数及相关性分析

比较分析了马氏珠母贝不同地理种群内自繁产生的3个子一代群体(BB1、DD1、SS1)和不同地理种群间杂交产生的3个子一代群体(BD1、BS1、DS1)的11个形态性状、壳厚指数、壳重指数和肥满度。壳厚、壳重、总体重和绞合线深与壳长幂值之间的相关关系非常显著，壳宽和绞合线长与壳长对数值之间的相关关系非常显著。为解决我国海水珍珠养殖存在的主要问题，提出了我国马氏珠母贝选育的目标应该是提高生长速度和抗病力，兼顾提高珍珠的质量。壳长、总体重和壳重应该在马氏珠母贝选育过程中作为指示生长速度的主要形态性状指标。     

马氏珠母贝转录组数据的重新组装

对本实验室和其他学者已经发表的马氏珠母贝外套膜和珍珠囊的454焦磷酸测序转录组数据以及NCBI中的EST数据进行了重组装、同源序列比对和GO注释分析。重组装获得了30266个contig,平均长度522 bp,其中最长的contig为4144 bp;NR数据库BLAST分析获取了2310个相似性contig(E≤10?5),其中1902个在模式动物(人、小鼠、海胆、线虫、斑马鱼、果蝇或者太平洋牡蛎和珠母贝)中可以查找到同源序列。基因注释(GO)结果表明,注释到生物学过程的3846个contig可分为23个亚类,其中代谢过程蛋白、细胞过程蛋白和生物学调控蛋白为contig数量最多的3个亚类;注释到分子功能的4601个contig共分为11个亚类,其中结合蛋白的contig数量最多,其次是具有催化活性的蛋白和结构分子活性蛋白;注释到细胞成分的2992个contig分为17个亚类,其中细胞和细胞组成部分的contig数量最多,其次分别是细胞器和大分子复合体contig数量。本研究结果有助于开展外套膜和珍珠囊特异性表达基因的大规模筛选。     

马氏珠母贝Bcl-2-like基因克隆及其功能初探

B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma, Bcl-2)基因作为一种重要的细胞凋亡调控基因,在内源性细胞凋亡通路中发挥着重要的调控作用。实验利用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmBcl-2-like基因cDNA全长序列,并对其序列进行生物信息学分析;利用实时定量PCR(qPCR)技术分析了PmBcl-2-like在马氏珠母贝不同组织、不同发育时期以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示,PmBcl-2-like cDNA全长为2 180 bp,开放阅读框长度为1 650 bp,共编码549个氨基酸,分子量为21.62 ku;结构域预测分析表明PmBcl-2-like含有Bcl-2家族典型的BH1-4结构域;多序列比对以及进化树构建结果表明,PmBcl-2-like与其他物种的相似度较高,保守性较强;荧光定量结果表明PmBcl-2-like在马氏珠母贝8个组织中均有表达,在鳃中表达量最高,其次为性腺,表达量最低为中央膜区;在胚胎期表达量较高,受精卵时期表达量最高。机体受到脂多糖(LPS)刺激后,相对表达量在24 h达到最高,72 h降到最低,最高约为最低的2.5倍;肽聚糖(PGN)刺激后,相对表达量在6 h达到最高,48 h降到最低,最高约为最低的7.28倍;聚肌胞苷酸(Poly:IC)刺激后,相对表达量在3 h达到最高,12 h降到最低,最高约为最低的6.49倍。研究表明,PmBcl-2-like可能在马氏珠母贝发育和免疫防御反应中担任着重要的角色。     

合浦珠母贝3个养殖群体的RAPD分析

利用RAPD标记技术检测了广西省北海市、海南省三亚市、广东省深圳市等 3个地理种群养殖合浦珠母贝(Pinctadamartensii)基因组DNA的多态性 ,并对其遗传结构进行了初步分析。从 4 0个随机引物中筛选出 13个10bp引物 ,它们在 3种群中共扩增出了 14 0条DNA片段 ,3种群共有片段 16条 ,DNA片段数分别为 5 8、91和 71条 ,多态性位点比例分别为 4 1 4 % ,6 5 0 %和 5 8 4 %。遗传距离分析表明 ,广西种群与广东种群的亲缘关系较近 ,而与海南种群亲缘关系较远。 13个引物中 ,引物S11和S3 58扩增出的 3种群指纹图谱差异显著 ,可作为 3种群鉴定的分子标记。     

马氏珠母贝Rab7基因的克隆及其表达特征分析

Rab家族基因在囊泡的形成、转运、黏附、锚定和融合等各个阶段发挥重要作用。在已有的马氏珠母贝RabcDNA片段的基础上,采用RACE方法克隆了该基因的全长。cDNA长度2519bp,编码区长618bp,编码206个氨基酸。编码的蛋白质序列分析表明,该基因具有Rab家族的全部保守结构,与人类等其他生物的Rab7亚家族的同源性最高。RT-PCR结果显示,该基因在马氏珠母贝的鳃、足和胃组织中没有扩增产物,在卵、感染和未感染凿贝才女虫Polydora ciliata的马氏珠母贝的肝脏和血液中均检测到了与预期大小相符的扩增产物,存在组织差异性表达。     

利用mtDNACCOI基因序列分析引进的澳洲虫纹鳕鲈群体遗传多样性

根据线粒体COI基因序列分析了虫纹鳕鲈（MaccuUochellapeelii）引进群体的遗传多样性。用PCR技术扩增了线粒体C01的序列,PCR产物经纯化、克隆和测序后得到了652bp的核苷酸片段。运用CLUSTALX（1．83）软件比对了25个个体的序列,共检测到5个多态位点,其中4个为转换位点,1个为颠换位点;运用MEGA5．0软件构建了NJ系统树;用DNASP软件计算出的单倍型个数（H）为5,单倍型多样性（Hd）为0．300,核苷酸多样性（Pi）和平均核苷酸差异数（k）为分别为0．00073和0．473。结果表明,引进群体的虫纹鳕鲈mtDNAC01基因序列的变异程度较小,群体内遗传多样性较低。     

马氏珠母贝丝裂原活化蛋白激酶p38的克隆与表达

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在细胞对细胞外刺激的反应中起着重要作用。它是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过磷酸化级联将细胞外信号传递给细胞。本研究利用cDNA 末端快速扩增(RACE)技术克隆获得PmMAKP p38基因cDNA 全长序列并对其序列进行生物信息学分析；利用实时荧光定量 PCR（qPCR）技术分析了PmMAKP p38在马氏珠母贝不同组织以及不同免疫刺激后的表达水平。结果显示PmMAKP p38 cDNA全长为1516 bp，开放阅读框长度为1071 bp，共编码356个氨基酸，分子量为 40.88 kDa；结构域预测分析表明PmMAPK p38含有MAPK家族典型的S_TKc结构域；多序列比对、进化树构建以及MatGAT计算结果显示PmMAPK p38与其他物种的相似度、保守程度较高；荧光定量分析结果表明该基因在马氏珠母贝中存在广泛表达，在肝胰腺中表达量最高，其次为外套膜，最低是闭壳肌。机体在受到LPS刺激后，相对表达量在2 h达到最高，12 h降到最低，最高约为最低的5倍；哈维氏弧菌刺激后，相对表达量在2 h达到最高，8 h降到最低，最高约为最低的4倍。研究表明，PmMAPK p38可能在马氏珠母贝的免疫反应中起着重要的作用。     

大黄鱼EST微卫星标记初步筛选

通过构建大黄鱼性腺线性化cDNA文库，并经测序后获得3535条EST，对其二碱基至六碱基重复序列进行筛选，共发现微卫星位点150个，占EST序列的4．24％；其中包括二碱基重复序列64条，三碱基重复序列80条，四碱基重复序列5条，五碱基重复序列1条；三碱基重复序列是最丰富的重复单元，占53．3％。在这些微卫星序列中，（TG／GT／AC／CA）n形式在二碱基重复中最为常见，（GAG／AGG／GGA／CCT）n形式在三碱基重复序列中最为常见，分别占微卫星序列总数的26％和14％。选取其中的62条微卫星序列进行引物设计、合成与多态性检测，经过PCR扩增，2．0％的琼脂糖凝胶电泳检测，获得呈多态性微卫星引物8对，多态率为12．9％。本研究为开发大黄鱼EST微卫星分子标记和大黄鱼基因编码区微卫星的功能研究提供有价值的信息。     

马氏珠母贝正常贝肉与黑壳病贝肉成分对比

为了研究黑壳病造成马氏珠母贝肉成份的变化,首先采用水蒸气蒸馏法分别提取正常马氏珠母贝和黑壳病马氏珠母贝肉的挥发性成份进行分析,正常马氏珠母贝肉检测出58种,黑壳病贝肉检测出59种。但黑壳病贝肉中仅有7种化合物与正常贝肉的挥发性成分相同。在黑壳病贝中,含量较高的成分有二十一烷和十八醛,分别为18.52%和17.95%,但在正常贝肉未检出。其次,采用茚三酮作柱后衍生试剂测定氨基酸的方法检测正常马氏珠母贝和患黑壳病的马氏珠母贝肉中牛磺酸的含量,结果分别为72.47mg/g、72.75mg/g,牛磺酸含量基本一致。通过分析黑壳病引起马氏珠母贝体内挥发性成分和牛黄酸成分变化,为研究马氏珠母贝患黑壳病的病变机理提供一定的科学依据。