湖栖鳍虾虎鱼皮肤和眼睛转录组比较

为了对湖栖鳍虾虎鱼的皮肤和眼睛进行转录组比较分析,实验通过测序原始数据,经denovo拼接、组装共获得103686个单基因(unigene), N50和平均长度分别为1 456和2 490 bp。在Nr、Nt、KO、SwissProt、PFAM、GO及KOG数据库中对上述unigenes进行注释,分别有57 380、 37 343、 31 700、 51 277、 47 020、 47 555和25 604个unigenes获得注释。对差异基因进行KEGG富集发现,在黑色素生成途径中,tyr、tyrp1和tyrp2等基因在皮肤中明显下调。基因表达差异分析显示,在湖栖鳍虾虎鱼皮肤和眼睛中共有8 113个差异表达基因(DEGs),其中3 174个DEGs在皮肤中上调,4 939个DEGs在眼睛中上调。通过实时荧光定量PCR(qPCR)对10个DEGs的验证,确定了RNA-Seq分析正确。本研究丰富了湖栖鳍虾虎鱼的体色研究,为湖栖鳍虾虎鱼遗传资源的利用提供了数据,也为进一步研究鱼类绚丽的体色形成机制提供了参考。     

壬基酚致红鲫发育畸形的机制

壬基酚(nonylphenol，NP)是广泛存在于水体中的环境内分泌干扰物，对生物体的生长发育造成影响。为了探究壬基酚致红鲫发育畸形的机制，本研究以红鲫为研究对象，采用Illumina HiSep 2500对正常神经胚期胚胎(NC)、正常21体节期胚胎(SC)和暴露5 μmol/L NP中发育畸形的神经胚期胚胎(NNP)、畸形21体节期胚胎(SNP)进行转录组测序(RNA-seq)，并结合实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异表达基因(differential expression gene, DEG)。RNA-seq共得到89 166条高质量unigenes，其中30 319条unigenes获得注释结果。NC、SC、NNP和SNP两两比较分析发现，NC/NNP中DEGs 153个，SC/SNP中DEGs 10个，NC/SC中DEGs 6 121个，NNP/SCP中DEGs 7 270个。KEGG分析发现，上述DEGs多数聚集在细胞过程、环境信息处理和新陈代谢通路上。利用qRT-PCR验证了生长、发育、细胞骨架及心血管循环相关的25个DEGs，它们的表达变化在qRT-PCR和RNA-seq中结果一致，一方面说明了RNA-seq结果可靠，另一方面初步挖掘出NP胁迫致红鲫胚胎发育畸形的候选基因，为后续深入探讨NP致畸的分子机制研究提供前期数据。     

壬基酚致红鲫发育畸形的机制

壬基酚(nonylphenol,NP)是广泛存在于水体中的环境内分泌干扰物,对生物体的生长发育造成影响。为了探究壬基酚致红鲫发育畸形的机制,本研究以红鲫为研究对象,采用Illumina HiSep 2500对正常神经胚期胚胎(NC)、正常21体节期胚胎(SC)和暴露5μmol/L NP中发育畸形的神经胚期胚胎(NNP)、畸形21体节期胚胎(SNP)进行转录组测序(RNAseq),并结合实时荧光定量PCR(qRT-PCR)验证差异表达基因(differential expression gene,DEG)。RNA-seq共得到89 166条高质量unigenes,其中30 319条unigenes获得注释结果。NC、SC、NNP和SNP两两比较分析发现,NC/NNP中DEGs 153个,SC/SNP中DEGs10个,NC/SC中DEGs 6 121个,NNP/SCP中DEGs 7 270个。KEGG分析发现,上述DEGs多数聚集在细胞过程、环境信息处理和新陈代谢通路上。利用qRT-PCR验证了生长、发育、细胞骨架及心血管循环相关的25个DEGs,它们的表达变化在qRT-PCR和RNA-seq中结果一致,一方面说明了RNA-seq结果可靠,另一方面初步挖掘出NP胁迫致红鲫胚胎发育畸形的候选基因,为后续深入探讨NP致畸的分子机制研究提供前期数据。     

草鱼核因子E2相关因子2基因克隆分析及其对呼吸爆发的调控作用

呼吸爆发过程可以产生大量的活性氧,核因子E2相关因子2(Nrf2)在此过程中起着重要作用。本文克隆和分析了草鱼的Nrf2基因,随后制备了Nrf2蛋白的多克隆抗体,研究了其和呼吸爆发的关系。草鱼Nrf2基因cDNA长度为1994 bp,开放阅读框为1782 bp,编码593个氨基酸(aa)。氨基酸序列比对发现,草鱼Nrf2基因与鲤鱼的同源性最高,为87%;草鱼Nrf2基因含有6个进化过程中保守的Neh(Nrf2-Epoxy chloropropane(ECH)homology)区。实时定量PCR(qRT-PCR)和蛋白印迹法(WB)检测结果表明,Nrf2基因在检测的草鱼8个组织中均有表达。Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(t BHQ)处理草鱼肾细胞(CIK)后,CIK细胞总抗氧化力显著上调,产生的活性氧下调,Nrf2及其下游的HO-1和GST基因的mRNA表达上调。WB和免疫荧光(IF)检测结果表明,tBHQ处理CIK后,Nrf2的蛋白表达也上调,并伴随着入细胞核现象。综上结果表明,保守的草鱼Nrf2基因在机体中广泛表达,能通过上调自身及其下游抗氧化基因的表达下调细胞活性氧的产生,从而参与调控呼吸爆发过程。     

基于血液转录组分析的长江江豚雌雄两性免疫适应性

为阐明长江江豚两性免疫系统特征及免疫适应性机制，本研究以 3 头雌性和 3 头雄性长江江豚(Neophocaena asiaeorientalis)血液为实验样本, 经 BGISEQ-500 测序平台进行 mRNA 和 microRNA 测序。结果显示, 从 6 个样本中共获得了 15878 个 unigenes 和 985 个 microRNAs, KEGG 分析发现有 1534 个 unigenes 注释到免疫系统相关类别并显著富集于 20 个常见免疫通路(P＜0.05)。将两性血液转录组进行比较, 鉴定了 539 个差异表达基因(DEGs)和 160 个差异表达 miRNAs (DEMs), 其中有 299 个是雌偏好表达基因, 240 个是雄偏好表达基因。GO 和 KEGG 富集分析显示, 雌性长江江豚中血液基因与免疫反应和能量代谢功能显著相关, 而雄性长江江豚中血液基因与免疫反应和细胞生长功能显著相关。此外, 通路富集分析还发现 FoxO 和 Hippo 两条免疫相关信号通路在雌性长江江豚血液中被激活。基于 DEGs 和 DEMs 的联合分析, 预测了 45 对 miRNA-mRNA 负调控关系, 包括 13 个 DEMs 和对应靶向关系的 37 个免疫相关 DEGs。研究表明, microRNAs 通过调控基因表达参与长江江豚两性免疫系统, 且成年雌性长江江豚可能具有更强的免疫力及维持机体内稳态的能力。本研究旨在利用 RNA-seq 测序技术从基因表达调控水平解析长江江豚两性免疫适应性机制, 并为阐释雌雄长江江豚对多样生境的适应能力从免疫角度提供新视角, 同时为长江江豚保护提供科学借鉴。     

白藜芦醇对脂多糖诱导草鱼肾脏细胞炎症的抑制作用

为评价白藜芦醇(resveratrol)对脂多糖诱导损伤草鱼(Ctenopharyngodon idella)肾脏细胞(CIK)的保护作用,本研究通过脂多糖(LPS)诱导细胞炎症损伤,测定和分析白藜芦醇对CIK细胞抗氧化因子活性和抗氧化、炎症相关基因表达变化的影响。结果表明,与对照组相比,LPS处理导致CIK细胞活力降低(P<0.05),乳酸脱氢酶(LDH)活性升高(P<0.05),降低了细胞内过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性,并导致还原型谷胱甘肽(GSH)浓度降低(P<0.05)和丙二醛(MDA)含量升高(P<0.05)。此外,LPS处理能引起CIK细胞的CAT、TNF-α、IFN-γ、IL-1基因表达显著上调(P<0.05),而对IL-10和SOD基因的转录表达无显著影响(P>0.05)。通过向培养基中添加白藜芦醇(4μg/mL)可以显著减弱LPS对CIK细胞造成的损伤,维系细胞抗氧化能力,抑制TNF-α等炎症相关基因的表达(P<0.05),促进CAT基因的表达(P<0.05)。研究认为白藜芦醇对LPS造成的CIK细胞损伤有明显的干预作用,主要原因可能是由于白藜芦醇对CIK细胞的抗氧化能力的改善以及对促炎因子表达的抑制。本研究可为白藜芦醇应用于鱼类炎症、氧化损伤相关疾病的防治提供理论依据。     

草鱼核因子E2相关因子2基因克隆分析及其对呼吸爆发的调控作用

呼吸爆发过程可以产生大量的活性氧,核因子E2相关因子2(Nrf2)在此过程中起着重要作用。实验克隆和分析了草鱼的Nrf2基因,随后制备了Nrf2蛋白的多克隆抗体,研究了其和呼吸爆发的关系。草鱼Nrf2基因cDNA长度为1994 bp,开放阅读框为1782 bp,编码593个氨基酸(aa)。氨基酸序列比对发现,草鱼Nrf2基因与鲤的同源性最高,为87%;草鱼Nrf2基因含有6个进化过程中保守的Neh[Nrf2-Epoxy chloropropane(ECH)homology]区。实时定量PCR(q RT-PCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测结果表明,Nrf2基因在检测的草鱼8个组织中均有表达。Nrf2激活剂叔丁基对苯二酚(t BHQ)处理草鱼肾细胞(CIK)后,CIK细胞总抗氧化能力显著上调,产生的活性氧下调,Nrf2及其下游的HO-1和GST基因的m RNA表达上调。Western blot和免疫荧光(IF)检测结果表明,t BHQ处理CIK后,Nrf2的蛋白表达也上调,并伴随着入细胞核现象。研究表明,保守的草鱼Nrf2基因在机体中广泛表达,能通过上调自身及其下游抗氧化基因的表达下调细胞活性氧的产生,从而参与调控呼吸爆发过程。     

虹鳟免疫诱导型基因Cathelicidin2启动子功能分析

本研究通过实时荧光定量PCR实验对虹鳟(Oncorhynchus mykiss)Cathelicidin2(Cath2)基因的转录模式进行了分析。结果显示,该基因在鳃、头肾等与机体免疫防御功能密切相关的组织内转录,在细菌和病毒感染后,转录水平均显著升高。对基因上游调控序列进行启动子和转录因子结合位点预测,发现该启动子具有真核生物典型的TATA盒和CAAT盒结构,基因上游直至第一内含子区域内,密集存在多个免疫相关转录因子结合位点,其中,2个核因子κB(Nuclear factor kappa B,NFκB)预测结合位点均位于核心启动子正链区域。在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)肾组织细胞系内,绿色荧光蛋白和萤火虫荧光素酶基因都能够在该启动子驱动下表达,表明其具有启动子活性,且启动子活性在受到免疫诱导后增强,包括细菌脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)模拟的细菌感染和聚肌胞苷酸(Polyinosinic polycytidylic acid,Poly I:C)模拟的病毒感染。双荧光素酶报告基因检测显示,启动子活性在与NFκB转录因子表达时,增强至4.39倍,证明Cath2基因受NFκB通路调控。研究表明,虹鳟Cath2基因能够在多种免疫刺激诱导下表达,其启动子可以应用为免疫诱导型的基因工程元件,驱动外源免疫基因在鱼体内适时表达,抵御外界病原感染,同时,避免非必要条件下的过度表达形成生长负担。     

草鱼呼肠孤病毒诱导ＦＨＭ细胞发生凋亡的研究

为探究草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)能否引起细胞凋亡,采用GCRV分别感染草鱼肾细胞(Ctenopharyngodon idellus kidney cell,CIK)和胖头鲤细胞(Fathead minnow cell,FHM),在不同时间观察细胞病变效应.结果表明,GCRV能感染这2种细胞并引起细胞病变,且CIK细胞对GCRV更为敏感;GCRV感染可以导致CIK细胞的快速融合并裂解,而FHM细胞感染后则很少有细胞融合;利用DAPI、Annexin V-FITC染色和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记[terminal deoxynucleotidyl transferase(TdT) dUTP nick end labeling,TUNEL]技术进一步证实GCRV能够诱导FHM细胞发生凋亡,但不诱导CIK细胞发生凋亡.本研究发现GCRV可以诱导FHM细胞发生凋亡,并推测GCRV在感染不同类型的细胞时,可以通过不同机制促使细胞死亡,从而为进一步研究GCRV的致病机制提供线索.     

盐度驯化影响虹鳟鳞组织基因表达的转录组分析

合理选择盐度驯化方式是目前虹鳟(Oncorhynchus mykiss)养殖生产所要解决的重要问题之一。本研究通过分析盐度驯化对虹鳟幼鱼外骨骼(鳞组织)中基因表达水平的影响,重点探讨了盐度对鱼类骨代谢的影响机制。首先,分别采集海水(盐度28)驯化7 d和常规淡水养殖(对照)条件下的虹鳟鳞组织,采用Illumina HiSeq 4000测序平台进行转录组测序(RNA-Seq)。以log2|fold change|≥1且P<0.05作为显著差异表达基因(DEGs)筛选条件,共筛选出1714个DEGs,其中,484个基因显著上调,1230个基因显著下调。GO功能注释分析结果显示,上述DEGs主要被注释在细胞膜、细胞质、细胞核、运输、信号转导、金属离子结合和ATP结合等功能中。KEGG通路富集分析结果显示,DEGs在氧化磷酸化、药物代谢–细胞色素P450、蛋白酶体、p53信号通路和心肌收缩等通路中显著富集。利用实时荧光定量PCR (RT-qPCR)对随机选取的8个DEGs的表达量进行验证,结果显示,RT-qPCR与RNA-Seq结果一致,表明RNA-Seq数据可靠。结果表明,以4/d的盐度提升速率对虹鳟进行盐度驯化,对其Mmp-2、Mmp-9、Acp5b、Alpl、Osteocalcin、OPG和Col12a1等骨代谢相关基因及NF-kB、MAPK-(JNK、p38、ERK1/2和STAT3)、Wnt/β-catenin、BMP/Smads和OPG-RANK-RANKL等骨代谢相关信号通路影响不显著,说明本研究所采用的驯化模式较为合理。本研究结果可为虹鳟的养殖生产实践提供参考,所获得的基因信息、功能注释和通路富集信息可为探究硬骨鱼类骨代谢的调控机理及其应对环境变化的演化规律提供新视角。     

透明草金鱼的皮肤转录组分析

采用Illumina HiSeq技术对体长(45.00±5.42)mm的透明草金鱼和不透明草金鱼皮肤组织透明性状相关基因进行转录组测序.6个组织共产生309364078条过滤序列,组装后获得72083个unigene,平均长度为1321 bp.DESeq分析共筛选出181个差异表达基因(DEGs),其中上调基因66个、...     

急性盐度胁迫对日本黄姑鱼肌肉组织转录组的影响

盐度是影响鱼类各种生理活动的重要环境因素,为探讨急性盐度胁迫对经济海水鱼类日本黄姑鱼基因表达水平的影响,实验基于Illumina HiSeq~(TM) 2500高通量测序平台,对不同盐度条件下日本黄姑鱼幼鱼肌肉组织进行转录组测序并开展生物信息学分析。结果显示,高盐组、低盐组和对照组分别获得46 379 598、36 130 844和38 715 820条Clean reads,总碱基数分别为5.27、4.87和5.53 GB。经组装得到91 667条转录本,去冗余后拼接得到61 601条Unigenes。与对照组相比,高盐组和低盐组分别有2 230和1 377个差异Unigene上调,1 959和2 447个差异Unigene下调,随机选取6条差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,结果与转录组测序一致。通过对显著差异表达基因进行筛选,在高盐组和低盐组中分别发现21和41个差异表达基因与离子通道相关,共有的离子通道相关基因为15个,其中14个基因表达趋势一致。而在高盐组和低盐组发现的离子转运体基因分别为6和10个。GO功能富集分析发现,差异基因显著富集在蛋白酶体、补体激活方面,KEGG通路富集分析发现,差异基因富集在绑定、催化活性、信号传导和分解代谢等方面。研究表明,日本黄姑鱼对急性盐度胁迫的适应可能是一个涉及多组织和多基因的复杂过程,盐度变化能够影响肌肉组织的离子通道、离子转运体,蛋白降解和免疫系统功能。研究结果为今后深入开展日本黄姑鱼盐度适应的调控机制及养殖育种研究提供了参考。     

福瑞鲤2号不同生长速率个体肌肉组织转录组分析

鱼类通过选育获得优良生长性状的遗传分子机制目前尚不清楚。实验分析比较了2种不同生长速率福瑞鲤2号肌肉组织的转录组文库。组装后共获得392 238条测序序列(contigs)。其中可比对上斑马鱼、弓斑东方鲀、青鳉、三刺鱼、尼罗罗非鱼和松浦镜鲤的蛋白序列的比例为56.01%～77.71%。2种不同生长速率福瑞鲤2号肌肉转录组比较,获得749个差异表达基因,包括348个上调基因和401个下调基因。鉴定出了与肌肉生长相关关键基因,如mb、myl2b、tnni1、fhl1、lamb3和pdk2等。研究结果为后续基因功能的研究以及鱼类新品种优良生长性状的分子机制解析奠定了基础。     

巨须裂腹鱼水霉菌的分离鉴定及其对脾脏转录组的影响

为分析感染水霉菌对巨须裂腹鱼脾脏转录组的影响，探索水霉菌感染巨须裂腹鱼的分子机制，实验随机选取生活在同一水域中的5尾健康和5尾感染水霉菌的巨须裂腹鱼，采用PDA琼脂培养基和分子生物学方法对巨须裂腹鱼水霉菌进行分离鉴定，并采用Illumina HiSeqTM 2000 高通量测序平台，对健康和感染水霉菌的巨须裂腹鱼脾脏组织进行转录组测序，并对测序数据进行拼接、注释和差异表达基因分析。结果显示，从巨须裂腹鱼皮肤上分离鉴定得到3株水霉菌；转录组数据显示，健康组和感染水霉病组分别获得46 619 504 条和43 912 876 条数据，与健康组相比，感染水霉菌组共有1 889 个基因发生差异表达，其中1 414 个基因上调，475 个基因下调，随机选取6个差异表达基因进行实时荧光定量PCR (RT-qPCR)验证，验证结果与转录组测序一致。对健康组和感染水霉菌组的差异表达基因进行GO功能富集发现，上调基因主要富集于241个功能中，下调基因主要富集于60个功能中，上述基因主要涉及分子功能类、细胞组分类和生物过程类等生理功能；KEGG通路富集分析发现，差异表达基因主要富集在免疫疾病、内分泌和代谢疾病、病毒感染性疾病、消化系统及排泄系统等。研究表明，感染水霉菌会影响巨须裂腹鱼脾脏组织多种基因的表达量，实验结果为进一步探索巨须裂腹鱼水霉菌的感染机制奠定了基础。     

草鱼SGLT1/2基因克隆及葡萄糖处理对其mRNA表达的影响

作为重要的转运载体,SGLTs(钠依赖性葡萄糖协同转运蛋白,sodium-glucose cotransporters)在物质的吸收过程中发挥着关键的作用。SGLT1和SGLT2作为SGLTs家族的重要成员,参与调节体内的葡萄糖吸收,从而维持血糖的稳态。为研究SGLT1和SGLT2在草鱼葡萄糖吸收过程中的作用,本实验利用RT-PCR技术从草鱼前肠和肾脏中分别克隆了基因sglt1和sglt2,对其进行生物信息学分析,并利用荧光定量PCR技术检测其mRNA的表达。结果显示,草鱼sglt1和sglt2的开放阅读框(open reading frame,ORF)分别为1 977和1 989 bp,并分别编码658和662个氨基酸。经过预测,草鱼SGLT1和SGLT2蛋白均为14次跨膜结构。氨基酸序列比对及系统进化树分析结果显示,草鱼sglt1和sglt2与金鱼、金线鲃中sglt1和sglt2的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,sglt1在草鱼肠道和肾脏组织中表达量较高,在其他组织中表达量较低;sglt2在草鱼肾脏组织中表达量最高,在其他组织中表达量较低。葡萄糖灌喂实验结果显示,草鱼前肠中sglt1和肾脏中sglt2的表达量在灌喂1 h后显著增加。在离体实验中,葡萄糖处理CIK细胞能够显著增加sglt1和sglt2的表达量。本研究为完善SGLTs在调控鱼类血糖稳态方面具有的功能提供了理论依据。     

草鱼肝细胞外泌体的分离鉴定及其对肝细胞miR-122/33和免疫相关基因表达的影响

外泌体是具有磷脂双分子膜结构的纳米级囊泡,能够参与机体多种生理过程。实验探讨了草鱼肝细胞外泌体的分离鉴定方法,并初步研究外泌体对草鱼肝细胞中miRNAs及免疫相关基因表达的影响。实验以草鱼肝细胞L8824为材料,通过超速离心获得外泌体,利用电子显微镜观察外泌体形态,采用纳米颗粒示踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)技术检测外泌体粒径和数量,同时利用Western blot分析其标志蛋白CD63的表达,最后用正常肝细胞和油酸诱导的脂肪肝细胞源外泌体孵育草鱼肝细胞,通过Real-time qPCR技术检测两种不同来源的外泌体对草鱼肝细胞中miR-122/33及免疫相关基因(TNF-α,NF-κB,IL-1β,IL-6和IL-10)转录水平的影响。结果显示,草鱼肝细胞外泌体为30~150 nm的不均匀囊泡,呈圆形或椭圆形,有完整的膜结构;外泌体标志蛋白CD63呈阳性表达;NTA技术检测显示外泌体囊泡占所有囊泡的50%以上;脂肪肝细胞源外泌体显著提高了肝细胞中miR-122及炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA转录水平。研究表明,通过超速离心法可成功分离草鱼肝细胞外泌体,且脂肪肝细胞源外泌体在草鱼肝细胞免疫调节中可能发挥重要作用。