青鱼和草鱼葡萄糖耐量的比较研究

选用典型的淡水肉食性鱼类青鱼(Mylopharyngodonpiceus)和草食性鱼类草鱼(Ctenopharyngodonidellus)为对象进行糖耐量初步实验。青鱼和草鱼的体重分别为(63±3)g和(46±2)g,在实验室适应4周后禁食24h,以高剂量(H)1.67g/(kg体重)和低剂量(L)0.42g/(kg体重)灌喂葡萄糖,比较研究其代谢反应。结果显示,2种鱼灌喂不同剂量葡萄糖后都出现持久的高血糖,青鱼血糖含量高于灌喂相同剂量的草鱼,灌喂剂量越高,血糖含量越高。草鱼组及青鱼L组在灌喂葡萄糖后血浆总氨基酸和甘油三酯先降后升,但青鱼H组口服葡萄糖后血浆总氨基酸和甘油三酯先升高。青鱼H组和草鱼H组在灌喂葡萄糖后最初1h和2h肝糖原含量分别下降至2.62%和5.46%。实验结果提示,青鱼糖耐量比草鱼低;高糖负荷后两种鱼的内分泌调节规律可能不同;较高葡萄糖负荷还引起应激反应,应激反应的强弱可能与糖耐量大小呈反比,与负荷剂量呈正比。     

草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT2 cDNA基因克隆与表达研究

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,克隆y+LAT2基因cDNA序列,并利用实时荧光定量PCR探讨y+LAT2在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)各组织中的表达情况以及饥饿对其mRNA的影响。结果表明,获得的y+LAT2基因的cDNA序列片段为1849bp,含1371bp的核心序列,编码456个氨基酸。预测草鱼氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性高达96.5%,与哺乳动物和两栖动物的同源性在78%～83%,构建的系统进化树与传统形态学分类一致。在草鱼的肌肉、脑、鳃、心、肾脏、肝、后肠、中肠、前肠、脾脏组织均检测到y+LAT2基因的表达。草鱼脾脏、肾脏以及前肠、中肠的y+LAT2 mRNA表达水平对禁食的反应不同,在短期饥饿(14d)期间,其y+LAT2 mRNA表达水平均呈下降趋势。草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT2基因全长cDNA序列的获得,有利于进一步探讨鱼类氨基酸的吸收转运机制。     

草鱼肠道对10种必需氨基酸的跨壁运输量

采用离体灌注实验系统和茚三酮对氨基酸显色的实验方法，对跨过草鱼肠道壁的氨基酸进行定量分析，在相同的实验环境下，分别研究草鱼肠道对lO种必需氨基酸的吸收转运量。结果表明，在60min内草鱼肠道可对灌流的氨基酸进行持续的吸收转运，并在肠道外积累；当肠道内灌流氨基酸浓度逐渐增加时，肠道外只有苏氨酸的浓度与其起始浓度呈正相关变化，其他9种氨基酸在高浓度(10．0mmol／L)时的吸收转运量均显著下降，表现出高浓度氨基酸对吸收转运的“抑制”效应；通过对吸收转运量达到最大值时实验氨基酸的浓度与吸收转运量的比较，以及在氨基酸吸收转运量随时间的变化规律等的比较分析表明，l0种氨基酸在肠道吸收、转运量的变化行为特征有一些共性，也有氨基酸种类特异性。总体表现为，草鱼肠道对苏氨酸、异亮氨酸和亮氨酸等具有很高的吸收转运能力。而对精氨酸、苯丙氨酸、组氨酸等的吸收、转运能力较差。     

鲤肠道sglt1基因的表达与抗体制备

钠/葡萄糖共转运载体1(sodium/glucose cotransporter 1,Sglt1)是协助葡萄糖吸收的主要蛋白。实验首先采用RT-PCR获取sglt1基因全长,克隆至PGME-T载体进行序列及免疫原性分析,选择长度为92个氨基酸(544～637)的多肽作为目的片段(sglt1-P)),扩增sglt1-P,引入双酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ后,连接至pET-32a(+)上,构建表达载体pET-32a(+)-sglt1-P,转化至E.coli Rosetta中,获得重组基因工程菌,通过IPTG诱导表达,获得目标多肽,并以此为抗原制备Sglt1特异性抗体。SDS-PAGE电泳分析表明,目标多肽分子量约为30 ku。采用耳缘静脉结合皮下注射,免疫新西兰长耳兔,免疫总时长为38 d。制备了鲤Sglt1抗体,ELISA测得效价为1∶105;免疫组化结果表明,抗体具有较高亲和力和特异性,可以应用于鲤Sglt1的表达定位研究。该抗体的获得为鲤肠道Sglt1表达及转运活性的系统研究奠定了基础,同时,获取的Sglt1抗体亦可用于其它鱼类Sglt1转运蛋白表达定位和定量研究。     

饥饿及再投喂处理对草鱼生长、葡萄糖代谢和转运蛋白1表达的影响

设置持续投喂组(C,持续投喂8周)、饥饿再投喂组(R,饥饿4周+再投喂4周)和持续饥饿组(S,饥饿8周)3个处理组,研究3种不同饥饿处理对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)血清生化指标、糖原和糖代谢相关酶和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的影响,同时在此实验基础上研究草鱼在急性高糖负荷胁迫下的糖耐受能力、糖代谢相关酶和GLUT1的变化规律,旨在阐明草鱼在饥饿及再投喂处理条件下的糖代谢特征。选取初重为(125.35±0.54)g的草鱼,饲养8周后以30 mg/100 g体重的剂量腹腔注射葡萄糖研究其糖耐受能力。结果显示,S组肝糖原和血清的血糖、甘油三酯含量均最低。饥饿处理对草鱼糖耐受能力影响显著,S组血糖含量在各时间点上显著低于其余两组(P0.05),肝糖原在6 h达到峰值;饥饿处理对草鱼肝脏糖代谢关键酶影响显著,饥饿处理(S组)诱使磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)活性上升但抑制丙酮酸激酶(PK)和果糖-6-磷酸激酶(PFK)的活性(P0.05),而饥饿再投喂(R组)后PEPCK、PK和PFK酶活性恢复到持续投喂(C组)处理水平。注射葡萄糖后S组肝脏GK酶活性增幅最大,PK酶活性呈上升趋势,而R组则呈先下降后上升的趋势;饥饿处理对草鱼肝脏和肌肉GLUT1表达影响显著,注射葡萄糖后,除R组肝脏组织外,其余各组草鱼肝脏和肌肉组织GLUT1表达量均呈先上升后下降的趋势,且S组肌肉GLUT1表达量在各个时间点上均高于其余两组(P0.05)。研究结果表明,在不同饥饿处理下,草鱼可通过消耗肝糖原和甘油三酯及降低肝脏糖酵解相关酶(PK和PFK)活性和促进糖异生PEPCK酶活性来应对饥饿胁迫,而饥饿处理可诱使GK和PK酶活性上升、促进糖原合成和激活GLUT1基因的表达和转运来缓解草鱼急性高糖负荷,从而提高其糖耐受能力。     

草鱼α-淀粉酶基因组织表达特征和早期发育的表达谱

为获知α-淀粉酶(α-amylase,AMY)在鱼体内的组织分布以及在鱼类早期发育过程中的特征,从消化酶的角度阐明鱼类对糖的利用机理,实验在获得草鱼(Ctenopharyngodon idellus)α-淀粉酶基因编码区序列的基础上,应用实时定量PCR(real-time PCR)检测了草鱼α-淀粉酶基因在不同组织和早期发育不同时期的相对表达量。序列分析结果显示:草鱼的α-淀粉酶的ORF框长1 539 bp,编码512个氨基酸,氨基酸同源性比对发现草鱼α-淀粉酶与其它物种的同源性很高,且在关键活性位点处均保守,其中与斑马鱼(Danio rerio)α-淀粉酶氨基酸的同源性最高,为92%,与人的同源性最低,为72%。对血液、心脏、肝胰脏、肾、肌肉、脑、前肠、中肠、后肠9个组织定量分析结果显示:草鱼α-淀粉酶基因在肝胰脏中的表达量最高,在前肠、中肠和后肠能检测到明显的表达,在心脏和肾脏仅能检测到微弱的表达。早期发育定量分析结果显示:从未受精卵到神经胚都没有检测到α-淀粉酶基因的表达,从器官形成期开始检测到微弱的表达,一直到出膜后48 h表达都很微弱,出膜72 h之后表达量升高较明显。对组织分布和早期发育的定量研究结果分析表明:肝胰脏并不是草鱼生成α-淀粉酶的唯一场所,在肠道中也有α-淀粉酶的合成;从出膜72 h仔鱼开口摄食之后,α-淀粉酶基因表达量增加得较明显,推测摄食能够促进α-淀粉酶基因的表达。     

饥饿及再投喂处理对草鱼生长、葡萄糖代谢和转运蛋白1表达的影响

本研究设置持续投喂组(C, 持续投喂8周)、饥饿再投喂组(R, 饥饿4周+再投喂4周)和持续饥饿组(S, 饥饿8周)3个处理组, 研究三种不同饥饿处理下草鱼血清生化指标、糖原和糖代谢相关酶和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的影响, 同时在此实验基础上研究草鱼在急性高糖负荷胁迫下的糖耐受能力、糖代谢相关酶和GLUT1的变化规律, 旨在阐明草鱼在饥饿及再投喂处理条件下的糖代谢特征。选取初重为(125.35±0.54) g的草鱼, 饲养8周后以30 mg/100 g体质量的剂量腹腔注射葡萄糖研究其糖耐受能力。结果显示, S组肝糖原和血清的血糖、甘油三酯含量均最低。饥饿处理对草鱼糖耐受能力影响显著, S组血糖含量在各时间点上显著低于其余两组(Plt;0.05), 肝糖原在6 h达到峰值; 饥饿处理对草鱼肝脏糖代谢关键酶影响显著, 饥饿处理(S组)诱使PEPCK酶活性上升但抑制PK和PFK酶的活性(Plt;0.05), 而饥饿再投喂(R组)后PEPCK、PK和PFK酶活性恢复到持续投喂(C组)处理水平。注射葡萄糖后S组肝脏GK酶活性增幅最大, PK酶活性呈上升趋势, 而R组则呈先下降后上升的趋势; 饥饿处理对草鱼肝脏和肌肉GLUT1表达影响显著, 注射葡萄糖后, 除R组肝脏组织外, 其余各组草鱼肝脏和肌肉组织GLUT1表达量均呈先上升后下降的趋势, 且S组肌肉GLUT1表达量在各个时间点上均高于其余两组(Plt;0.05)。研究结果表明, 在不同饥饿处理下, 草鱼可通过消耗肝糖原和甘油三酯及降低肝脏糖酵解相关酶(PK和PFK)活性和促进糖异生PEPCK酶活性来应对饥饿胁迫, 而饥饿处理可诱使GK和PK酶活性上升、促进糖原合成和激活GLUT1基因的表达和转运来缓解草鱼急性高糖负荷从而提高其糖耐受能力。     

草鱼小肽转运载体PepT1基因的克隆与表达特征

采用同源克隆和RACE技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)PepT1基因的全长cDNA序列。该cDNA全长为2 762 bp,包含141 bp的5′UTR序列,479 bp的3′UTR序列,2 142 bp开放阅读框,编码713个氨基酸;草鱼与鲫(Carassius auratus)、斑马鱼(Danio rerio)的核苷酸同源性分别为77.6%和74.0%,氨基酸同源性分别为78.0%和76.7%;与其他物种的核苷酸同源性为53.9%～59.1%,而氨基酸的同源性为57.2%～61.8%。经预测,其编码蛋白的分子量为79.29 kD,等电点为5.87,该蛋白具有与哺乳动物十分相似的11个螺旋跨膜结构,跨膜区氨基酸高度保守;系统进化分析表明,草鱼PepT1基因与鲫鱼和斑马鱼的亲缘关系最近;利用Real-time PCR技术检测了该基因的时空表达,结果显示,PepT1在草鱼前肠组织表达量最高,其次是肌肉组织;草鱼出膜7 d后PepT1 mRNA表达量相对稳定;昼夜节律研究发现,肠道PepT1基因夜间的表达量较白天高。本研究旨在为小肽转运载体PepT1介导肠道转运小肽调控草鱼对饲料蛋白消化吸收的分子机理提供理论基础。     

企鹅珍珠贝GLUT1基因全长cDNA克隆及其对葡萄糖的表达响应

葡萄糖转运蛋白(GLUTs)是能量代谢的关键因子,为了探索GLUT1(glucose transporter type1)在企鹅珍珠贝(Pteria penguin)中的功能,开展了企鹅珍珠贝GLUT1基因的克隆与功能研究。利用RACE技术克隆出企鹅珍珠贝GLUT1基因,并命名为Pp GLUT1。该基因c DNA全长为2 068 bp,编码522个氨基酸,有2个跨膜螺旋区,N端和C端都在胞质侧,分子量为57.226 4 k D,理论等电点为5.17。不同组织荧光定量结果表明,在肠和外套膜中表达量最高,闭壳肌中的表达量显著低于其他组织。0.5 g·m L-1的高质量浓度葡萄糖注射实验表明,在注射后30 min内,肠Pp GLUT1表达量升高,在30 min之后表达量逐渐降低,注射后第2小时表达量最低。不同浓度葡萄糖注射实验表明,当葡萄糖质量浓度为0.1~0.4 g·m L-1时,Pp GLUT1表达量逐渐上升;质量浓度为0.4g·m L-1时,Pp GLUT1表达量最高;大于0.4 g·m L-1之后,表达量逐渐降低。上述结果表明,企鹅珍珠贝Pp GLUT1主要在肠和外套膜表达,并对葡萄糖注射有表达响应,可能在上述组织的葡萄糖转运过程中发挥作用。     

Cloning and molecular characterization of cationic amino acid transporter y+LAT1 in grass carp (Ctenopharyngodon idellus)

The solute carrier family 7A, member 7 gene encodes the light chain- y⁺L amino acid transporter-1 (y⁺LAT1) of the heterodimeric carrier responsible for cationic amino acid (CAA) transport across the basolateral membranes of epithelial cells in intestine and kidney. Rising attention has been given to y⁺LAT1 involved in CAA metabolic pathways and growth control. The molecular characterization and function analysis of y⁺LAT1 in grass carp (Ctenopharyngodon idellus) is currently unknown. In the present study, full-length cDNA (2,688 bp), which encodes y⁺LAT1 and contains a 5′-untranslated region (319 bp), an open reading frame (1,506 bp) and a 3′-untranslated region (863 bp), has been cloned from grass carp. Amino acid sequence of grass carp y⁺LAT1 contains 11 transmembrane domains and shows 95 %, 80 % and 75 % sequence similarity to zebra fish, amphibian and mammalian y⁺LAT1, respectively. The tissue distribution and expression regulation by fasting of y⁺LAT1 mRNA were analyzed using real-time PCR. Our results showed that y⁺LAT1 mRNA was highly expressed in midgut, foregut and spleen while weakly expressed in hindgut, kidney, gill, brain, heart, liver and muscle. Nutritional status significantly influenced y⁺LAT1 mRNA expression in fish tissues, such as down-regulation of y⁺LAT1 mRNA expression after fasting (14 days).     

草鱼SREBP-1基因的克隆及糖对其在肝脏中表达的影响

固醇调节元件结合蛋白(SREBPs)是调控糖脂代谢相关基因表达的关键核转录因子。为获知草鱼SREBP-1基因的序列及其在肝脏中的表达规律,本实验采用同源克隆和RACE方法获得了草鱼SREBP-1基因的部分cDNA序列,并通过生物信息学方法对该基因及所编码蛋白的结构特征进行了分析;采用实时荧光定量PCR技术,对SREBP-1基因在8种不同组织的表达规律及低糖(糖含量24%)和高糖(糖含量42%)投喂条件下肝脏中的表达水平进行了研究。结果显示,所克隆到的草鱼SREBP-1基因cDNA长4 760 bp,其中包括开放读码框3 426bp,编码1 141个氨基酸;草鱼SREBP-1具有一个典型的碱性螺旋-环-螺旋亮氨酸拉链结构(bHLH-zip);氨基酸序列比对结果显示,草鱼SREBP-1与其他鱼类的同源性在76%~88%之间,与斑马鱼的进化关系最近;草鱼SREBP-1基因在脑中的表达量最高,肝脏和肠次之,在肾脏、脾脏、肌肉、脂肪和性腺中均有少量表达;与对照组相比,SREBP-1基因在高糖诱导下表达量显著提高(P0.05),低糖诱导下没有显著性差异。研究表明,在高糖负荷条件下,草鱼肝脏中SREBP-1可能会促进糖的利用和转化,从而参与糖代谢调节过程,为丰富鱼类糖代谢调控机理提供研究资料,并有望为提高鱼类对饲料糖的利用效率提供理论依据。     

Cloning, characterization and expression of the LECT2 gene in grass carp

An expressed sequence tag of grass carp leukocyte cell–derived chemotaxin 2 (LECT2) gene was screened from an established intestinal cDNA library. Rapid amplification of cDNA ends gave rise to a full-length LECT2 cDNA (gcLECT2) with a complete open-reading frame of 474 bp, encoding 158 amino acids about 17.9 kDa. Homology search and sequence alignment showed that this deduced protein sequence shared a high identity with LECT2 from other vertebrates. Western blotting indicated immunological cross-reactivity occurs between grass carp and human LECT2 protein. This gcLECT2 genomic sequence is 1,868 bp in size, which consists of five exons and four introns. Real-time quantitative PCR analysis revealed that gcLECT2 gene is ubiquitously expressed in different tissues of healthy grass carp including brain, gut, liver, spleen, kidney, muscle and heart, while the expression levels were significantly increased in liver and spleen followed by Aeromonas salmonicida infection. 992 bp 5′-flanking region sequence was cloned and analyzed, where one CAAT box and one GC island were found. Our results showed that the LECT2 is suggested to be most possibly involved in the grass carp’s immune response.     

草鱼3个6-磷酸葡萄糖酶催化亚基的基因表达分析及高糖饲料对其表达的影响

为了探讨6-磷酸葡萄糖酶催化亚基(glucose-6-phosphatase catalytic subunit,G6PC)在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)糖代谢中的作用,采用同源序列比对的方式,在草鱼基因组中获取了3个g6pc基因的序列,通过序列比对和进化树分析,将其分别命名为g6pca、g6pcb1和g6pcb2,其编码的氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和人(Homo sapiens)具有较高的同源性,相似度分别为85%～94%、64%～83%和54%～66%。同线性分析表明g6pc在草鱼染色体上的分布与斑马鱼等高度相似,表明草鱼g6pc基因在进化中具有较高的保守性。利用RT-PCR检测3个基因在鳃、脂肪、脑、心脏、肝、肾、前肠、中肠、后肠和肌肉10个组织中的表达,结果显示, g6pca在脑和肝中表达量较高,脂肪组织次之; g6pcb1在肝中表达量最高,中肠次之; g6pcb2在心脏表达量最高,其次为脂肪组织。同时探讨了高糖饲料对草鱼不同g6pc亚型转录水平的影响,以及不同浓度葡萄糖和胰岛素刺激草鱼肝细胞(L8824)后对g6pca转录水平的影响。结果显示,饲喂高糖饲料(7周)后,与对照组相比,草鱼肝脏g6pca mRNA水平显著升高, g6pcb1和g6pcb2 mRNA水平无显著变化。离体情况,与5 mmol/L葡萄糖组相比,15 mmol/L葡萄糖显著增加了L8824的g6pca mRNA水平,且1 mol/L胰岛素可以抑制这种作用; 30 mmol/L葡萄糖对L8824 g6pca mRNA水平无显著性影响。本研究表明,草鱼g6pc发生加倍后存在功能分化,高糖可以诱导g6pca mRNA的表达,而对g6pcb1和g6pcb2的转录水平无影响,其具体功能还需进一步研究。     

草鱼AdipoR1-B基因克隆、组织分布及其表达的营养调控

为探讨Adipo R1-B在鱼类糖类和脂质代谢中的作用,本实验采用RACE方法获得了草鱼Adipo R1-B的全长c DNA序列(登录号:KP733846),利用生物信息学技术对该基因及其所编码蛋白的结构特征进行了分析;采用实时定量PCR技术,检测了Adipo R1-B在19个不同组织中的表达特性以及高糖(45%)、高脂(8%)和高糖高脂饲喂对草鱼肝脏中该基因表达的影响。结果显示,草鱼Adipo R1-B c DNA全长2186 bp,其中开放读码框为1122 bp,编码373个氨基酸;跨膜结构分析表明草鱼Adipo R1-B为典型的7次跨膜蛋白;同源性分析结果显示,草鱼Adipo R1-B与其他物种的Adipo R1-B高度同源(氨基酸相似度78%以上),并与斑马鱼Adipo R1-B的进化关系最近;组织分布结果显示,Adipo R1-B在草鱼肝脏中表达量最高,中枢神经系统和红肌次之;此外,高脂和高糖高脂饲喂均能够显著提高草鱼肝脏中Adipo R1-B的表达水平。因此,草鱼肝脏中Adipo R1-B的表达水平受到日粮中脂类水平的调控,推测该受体可能在调节鱼类脂质代谢中发挥重要作用。     

Molecular Characterization and Dietary Regulation of the AlaSerCys Transporter 2 in Grass Carp,Ctenopharyngodon idella

AlaSerCys Transporter 2 (ASCT2), a glutamine/amino acid transporter, plays an important role in the absorption of neutral amino acids. In this study, we cloned the full‐length cDNA of ASCT2 from grass carp, Ctenopharyngodon idella, which encodes a 541‐amino‐acid protein. Phylogenetic analysis revealed that the ASCT2 sequence of grass carp clustered with the ASCT2 from Danio rerio. ASCT2 mRNA was differentially expressed in different tissues, with a gradient expression from high to low in tissues of the liver, gill, muscle, midgut, hypophysis, hindgut, kidney, heart, foregut, brain, spleen, and gonad. Meanwhile, the quantitative real‐time polymerase chain reaction results showed that 22% crude protein diets could significantly stimulate ASCT2 gene expression. In addition, ASCT2 was expressed in higher quantities in the soybean meal group than in the fishmeal group. Furthermore, 7.5 g/kg glutamine and 2.5 g/kg glutamine dipeptide remarkably improved the expression of ASCT2. These results suggested that ASCT2 expression is regulated by the dietary protein levels and sources, as well as appropriate concentration of glutamine and glutamine dipeptide additives.     

3月龄草鱼种免疫器官组织学及其免疫后免疫基因的转录差异

为研究处于同一时期但养殖条件不同的草鱼(Ctenopharyngodon idellus)鱼体规格与发育状态间是否具有一致性,观察压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏的显微结构,并对压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼进行腹腔注射疫苗处理,实时荧光定量PCR检测免疫7 d后、14 d后各期草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM与MHCⅠ的表达量。结果显示,压塘3月龄草鱼各组织发育较普通3月龄草鱼迟缓。压塘3月龄草鱼与普通3月龄草鱼在免疫后,头肾、中肾、肠道与脾脏中IgM和MHCⅠ的表达量均有上升,且IgM与MHCⅠ的相对表达量峰值均出现在普通3月龄草鱼免疫14 d后的中肾中(IgM为74.51倍;MHCⅠ为56.02倍。结果表明,草鱼出血病活疫苗可以增强草鱼头肾、中肾、肠道和脾脏中IgM和MHCⅠ的表达,且在3月龄时期进行注射免疫效果最佳。     

Molecular cloning,characterization and expression of FSH and LH beta subunits from grass carp (<Emphasis Type="Italic">Ctenopharyngodon idella</Emphasis>)

Follicle-stimulating hormone beta subunit (FSHβ) and luteinizing hormone beta subunit (LHβ) have been cloned and characterized from the pituitary of grass carp (Ctenopharyngodon idella). The full length of FSHβ and LHβ cDNA was 393 bp and 441 bp, with open reading frame encoding proteins of 130 and 146 amino acids, respectively. Phylogenetic analysis of the proteins of FSHβ and LHβ showed a high homology with other fishes. Homology analysis also indicated that LHβ has higher conservation than FSHβ. The expression analysis of grass carp FSHβ and LHβ by RT-PCR suggested that they were only expressed in the pituitary. Real-time quantitative PCR protocols were developed and validated to measure FSHβ and LHβ mRNAs during ovarian development. The FSHβ and LHβ mRNA level was very low in the pituitaries of early-pubertal fish and significantly increased during the ovulation period. These results suggested that in grass carp the gonadotropins synthesized synchronously in order for asynchronous oogenesis to take place.