草鱼3个6-磷酸葡萄糖酶催化亚基的基因表达分析及高糖饲料对其表达的影响

为了探讨6-磷酸葡萄糖酶催化亚基(glucose-6-phosphatase catalytic subunit,G6PC)在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)糖代谢中的作用,采用同源序列比对的方式,在草鱼基因组中获取了3个g6pc基因的序列,通过序列比对和进化树分析,将其分别命名为g6pca、g6pcb1和g6pcb2,其编码的氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和人(Homo sapiens)具有较高的同源性,相似度分别为85%～94%、64%～83%和54%～66%。同线性分析表明g6pc在草鱼染色体上的分布与斑马鱼等高度相似,表明草鱼g6pc基因在进化中具有较高的保守性。利用RT-PCR检测3个基因在鳃、脂肪、脑、心脏、肝、肾、前肠、中肠、后肠和肌肉10个组织中的表达,结果显示, g6pca在脑和肝中表达量较高,脂肪组织次之; g6pcb1在肝中表达量最高,中肠次之; g6pcb2在心脏表达量最高,其次为脂肪组织。同时探讨了高糖饲料对草鱼不同g6pc亚型转录水平的影响,以及不同浓度葡萄糖和胰岛素刺激草鱼肝细胞(L8824)后对g6pca转录水平的影响。结果显示,饲喂高糖饲料(7周)后,与对照组相比,草鱼肝脏g6pca mRNA水平显著升高, g6pcb1和g6pcb2 mRNA水平无显著变化。离体情况,与5 mmol/L葡萄糖组相比,15 mmol/L葡萄糖显著增加了L8824的g6pca mRNA水平,且1 mol/L胰岛素可以抑制这种作用; 30 mmol/L葡萄糖对L8824 g6pca mRNA水平无显著性影响。本研究表明,草鱼g6pc发生加倍后存在功能分化,高糖可以诱导g6pca mRNA的表达,而对g6pcb1和g6pcb2的转录水平无影响,其具体功能还需进一步研究。     

鳜下丘脑神经元细胞培养

通过建立可行,高效的下丘脑神经元细胞技术,为研究鳜鱼的摄食机理与能量代谢奠定基础。分离鳜鱼下丘脑组织,Ⅰ型胶原酶将组织消化成单细胞悬液,用完全培养液进行培养,在培养的第3d、4d、5d、6d观察细胞的形态,结果显示培养第3d时细胞贴壁量少,胞体小并且呈单个分布,在培养第4d细胞的数量显著增多,且具有典型的神经元的形态,胞体饱满,第5d形神经元胞体的融合度进一步增大,突起增长增粗,许多分支互相交错连接而形成密集的神经纤维网络,第6d细胞活性减弱,开始走向凋亡;CCK-8法检测细胞活性,结果显示在培养第5d细胞活性最高;并采用两种方法对神经元细胞进行鉴定,结果显示RT-PCR检测发现培养的下丘脑细胞可以表达神经元特异基因noggin,经免疫荧光鉴定下丘脑神经元细胞纯度为95.9%。这些结果表明通过此培养方法能够获得纯度较高的鳜鱼下丘脑神经元细胞,为进一步在细胞水平研究鳜鱼的摄食机理与能量代谢相关机理奠定基础。     

鳜不同亚型瘦素受体基因克隆与表达分析

以鳜(Siniperca chuatsi)为研究对象,使用cDNA 3′末端快速克隆法扩增瘦素受体基因(lepr)cDNA序列,获得了由mRNA 3′端可变剪切产生的鳜lepr的4个不同亚型,包括编码序列(coding sequence, CDS)长度为3 474 bp、编码1 157个氨基酸的长型受体亚型lepr-L,以及3个短型受体亚型lepr-S1、lepr-S2和lepr-S3,CDS长度分别为1 512、945和915 bp,分别编码503、314、304个氨基酸。对氨基酸序列进行结构域分析和多重比对发现,鳜lepr长型受体亚型包含完整的功能域,短型受体亚型无跨膜区及胞内结构,鳜lepr及其leptin结合域(leptin binding domain, LBD)序列保守程度高。鳜lepr在鳃中表达最高,其次是肾和垂体,腹腔注射鳜leptin B而非leptin A的同源重组蛋白2 h后引起脑lepr表达量的升高(P0.05)。以上结果表明,鳜leptins能引起组织中lepr表达的不同变化而发挥独特的生理功能。