四株产色素温和气单胞菌的鉴定及其特性

1996-2000年从不同来源的病鳖和病鳗体内共分离到四株产生棕色色素的细菌,经细菌常规鉴定法和编码鉴定法确定为温和气单胞菌.进一步对细菌的产生色素特性、毒力因子和致病性进行检测,结果显示(1) 四株细菌均能产生水溶性棕色色素,但在有氧培养条件下细菌产生色素的速度随培养基种类不同而不同,依次为普通琼脂平板＞肉汤培养基＞琼脂半固体高层管.而在厌氧培养条件下细菌不能产生色素.(2)四株细菌均能产生外毒素及胞外蛋白酶二种毒力因子,毒素溶血价为116或132.(3)四株细菌肉汤培养液对小白鼠及本种动物均有致死性,为致病性温和气单胞菌.     

光合细菌同化磷能力的初步探究

研究了培养条件、pH、接种量、含磷量、不同碳源等条件对光合细菌解磷能力的影响。在30℃、光照微好氧培养、培养基以苹果酸为碳源、磷质量浓度为0．35g／L、pH6．0、装液量100mL／250mL、接种量为体积分数10％时，光合细菌生物量和解磷率都可达到最高。     

哈氏弧菌胞外产物对红鳍东方鲀的致病性

采用平板玻璃纸覆盖技术提取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)H-06091菌株的胞外产物(ECP),通过肌肉和腹腔注射2种方式研究其对红鳍东方鲀(Fugu obscurus)的致病性。采用双层纸片法对其主要酶成份进行初步研究;测定其对绵羊红细胞和红鳍东方鲀红细胞的溶血活性;将哈氏弧菌在不同温度下(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃)培养36h和25℃下培养不同时间(12h、18h、24h、36h、48h、60h、72h)后提取其胞外产物并对其蛋白质含量进行测定;经SDS-PAGE分离粗提胞外产物中蛋白成分,并用Dot-ELISA和Western-blot方法对其成分进行分析。实验结果显示,该胞外产物对红鳍东方鲀具有致病性;具有淀粉酶和酪蛋白酶活性,不具有卵磷脂酶、脂肪酶和明胶酶活性;对红鳍东方鲀红细胞有溶血活性,对绵羊红细胞无溶血活性;胞外产物蛋白质总含量在35℃培养36h后出现高值,与温度变化无明显相关性;25℃下培养24h、36h和48h的粗提胞外产物经SDS-PAGE分离,有3条蛋白质条带最明显,分子量分别约为31kD、38kD、60kD;其中分子量约为60kD蛋白条带,经Dot-ELISA和Western-blot方法证实其为半胱氨酸蛋白酶-1。根据以上结果认为哈氏弧菌H-06091菌株胞外产物含有多种毒力因子,与该菌的致病性密切相关。     

2株海水鱼源潜在益生菌的分离、鉴定及特性分析

为筛选用于微生态制剂研发的海水鱼源益生菌，本研究对海捕野生许氏平鲉(Sebastes schlegelii)和大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)的消化道内壁黏膜样品进行细菌分离纯化，获得80株可培养细菌。使用选择性培养基对菌株的产酶能力进行测定，选取海水鱼常见病原菌为指示菌测定分离菌株产物的抑菌活性，筛选出2株潜在益生菌TS2和TH8，并进行菌株的生理生化检测、16S rDNA序列分析、生长特性及其对宿主安全性的研究。结果显示，TS2产蛋白酶(protease)、淀粉酶(amylase)和脂肪酶(lipase)，其无菌培养产物可显著抑制鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harvey)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)的生长。TH8产蛋白酶和脂肪酶，其无菌培养产物可显著抑制鳗弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌、假交替单胞菌、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)的生长。基于细菌生理生化检测和16S rDNA序列比对，鉴定TS2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，TH8为河流漫游球菌(Vagococcus fluvialis)。TS2在温度为15~40 ℃、NaCl浓度为0~0.08 g/L、pH为5~9时生长较快，6 h进入对数期，26 h后进入稳定期；TH8在温度为20~40 ℃、NaCl浓度为0~0.08 g/L、pH为5~12时生长较快，2 h进入对数期，14 h后进入稳定期。菌株对同源宿主的安全性检测发现，TS2和TH8在108 CFU/mL浓度条件下对同源宿主是相对安全的。筛选的枯草芽孢杆菌TS2、河流漫游球菌TH8产酶能力强，其产物能抑制多种病原菌的生长，具有广温、广盐、耐酸碱、生长速度快等优点，可作为候选菌株开发为微生态制剂，研究结果为其在海水鱼养殖业中的应用提供数据支撑。     

中华绒螯蟹苗期丝状细菌病病原HL－1的研究

从江苏省如东县中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)苗期暴发丝状细菌病的蚤状幼体分离得到丝状细菌HL-1，经感染试验证实其为中华绒螯蟹苗期丝状细菌病的病原。对HL-1的细胞形态、生理生化特征、致病性及药物敏感性研究结果表明，HL-1为无色、不分枝的丝状体，在固体培养基上形成指纹状菌落，菌丝可断裂形成微生子，在液体培养基中所形成的微生子可聚集成玫瑰花环样结构；HL-1过氧化氢酶阳性，几丁质酶阴性，需氧，鉴定为毛毒亮发菌(Leucothrix mucor)，其生长的pH适宜范围为5．0～10．0，盐度最适范围为10—40；在常用的32种抗生素中，HL-1仅对乙基西羧霉素高度敏感，而对其他31种抗生素大多数具耐药性。     

益生菌D-1液体发酵工艺的研究

为提高菌体的得率和芽孢转化率,进行了菌株D1最佳培养条件参数和培养基优化的研究及测定此条件下的生长曲线。通过研究发酵温度、接种量、培养基初始pH、溶解氧等因素对菌株D1生长的影响,确定最佳培养条件为:培养温度30℃,培养基初始pH7.0,接种量5%(相对摇瓶装液量),装液量100mL/500mL。在发酵基础培养基成分保持不变的情况下改变氮源、碳源、生长因子、无机盐单因子进行单因子试验,采用L9(3)4正交表设计实验,进行培养基优化,确定最佳培养基配比为玉米淀粉2%,蛋白胨2.5%,NaH2PO40.8%,玉米浆1.5%,MgSO4·7H2O0.05%,3.08%MnSO4水溶液0.1%。在最佳培养条件下,用最优培养基测定了菌株D1的生长曲线,并确定了菌株D1的最佳种龄为18～20h,生产收获时间为26h。     

中华绒螯蟹腹水病病原分析

从六安地区患腹水病的中华绒螯蟹(Eriochersinensis)体内分离到一株病原菌(HX4菌株),经API/ATB半自动化鉴定和分子遗传学鉴定,确定为拟态弧菌(V mimicus)。应用PCR技术、电镜技术、组织细胞模型和动物实验对该菌的毒素共调菌毛(ToxinCoregulatedPilus,TCP)、外毒素和内毒素等毒力因子研究的结果表明,HX4菌株为TCP+株,在pH6 7定居因子培养基中,30℃需氧培养条件下可较好表达TCP;TCP+菌对肠管的黏附率为(32 19±0 14)%、对HEp 2细胞的黏附菌数为16 03±4 66、对中华绒螯蟹的毒力(LD50)为2 08×106CFU·mL-1,均显著高于TCP-菌,其相应值分别为(0 52±0 06)%、6 8±2 06和2 09×107CFU·mL-1;外毒素具有很强的细胞毒性(TCID500 25μg)、肠毒性(皮肤蓝斑直径15mm)和中华绒螯蟹致死性(LD501 40μg),而内毒素对中华绒螯蟹基本无致病性。由此可见,TCP和外毒素是拟态弧菌HX4菌株的2种重要毒力因子,在细菌致病过程中起重要作用。     

鲤肠道嗜水气单胞菌产毒条件的初步研究↑（*）

本文从鲤肠道分离出4t8个溶血毒素产生茵落，用鉴定培养基鉴定，其中27个菌落属气单胞菌属，其中产毒较高的5个菌落均能致病，进行形态和生化鉴定，结果表明其中CCF3、CCF4和CCl42属嗜水气单胞茵。本文还测定了不同pH和糖对毒产生的影响，表明酸性pH和山梨糖能抑制毒素产生。     

一株南海柳珊瑚共附生细菌的鉴定及其产活性物质的培养条件优化

对一株南海柳珊瑚共附生微生物菌株(中科院南海海洋研究所,菌种编号00856)进行了分类,并对其所产的生物活性物质特性进行了研究。依据形态及16SrRNA基因序列分析,海洋细菌00856归于芽孢杆菌属(SCSIO 00856)。利用所选择的细菌培养基,在一定的培养条件(28℃,pH 7.0)下,该菌株的次级代谢产物对酿酒酵母、金黄色葡萄球菌有一定程度的抑制活性。同时,在培养6d时,该菌产生的生物活性物质对酿酒酵母抑菌效果最好。利用滤纸片法测定产物活性,以抑菌物质高产为目标,利用正交试验的方法优化了培养基的配比。结果表明,用酿酒酵母作为指示菌,以海盐素26.25g/L、葡萄糖12g/L、酵母浸粉3g/L、磷酸二氢钾3g/L、麦芽浸粉5g/L为培养基发酵培养6d,海洋细菌00856产抑菌活性物质最多。     

致病性拟态弧菌的敏感药物和拮抗菌的筛选

采用纸片扩散法,系统测试了3株致病性拟态弧菌对8类23种抗菌药物的敏感性与联合用药的敏感性。结果显示:氨基糖甙类、头孢类、喹诺酮类和磺胺类等多种抗菌药物对病原弧菌均有抑制或杀死作用。庆大霉素与四环素类、头孢类、喹诺酮类、红霉素或氯霉素联用以及多粘菌素与头孢类、喹诺酮类、红霉素或氯霉素联用均表现出一定程度的累加或协同作用;同时,采用琼脂平板扩散法从9株非致病菌中筛选对致病性拟态弧菌具有拮抗作用的益生菌并对其抑菌活性进行测定。结果显示:HX-01和HX-05两株细菌的菌液和无细胞上清液对3株致病性拟态弧菌均具有拮抗作用。在拮抗菌—病原菌混合体系中,病原菌经24 h培养,菌数由原来的105CFU/mL增至2ⅹ108CFU/mL,但从第2天开始,随着拮抗菌产生的抗性产物浓度的增加,菌数快速下降,至第6天病原菌完全被杀死。而拮抗菌培养至第6天,菌数仍保持较高水平(2ⅹ107CFU/mL)。表明这两株拮抗菌对致病性拟态弧菌具有较强的拮抗作用。经数值鉴定法确定两株拮抗菌均为产碱杆菌。     

用鼠红细胞膜纯化中华绒螯蟹血清凝集素的方法

本研究建立鼠红细胞膜吸附法纯化中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血清凝集素的方法,并与硫酸铵盐析、凝胶过滤层析和离子交换层析等其他提取方法进行比较。实验结果表明,中华绒螯蟹血清经鼠红细胞膜吸附后,再由EDTA把结合的凝集素从膜上解离,可以获得纯化的高活性凝集素。该纯化物在PAGE中出现2个清晰的区带,一个是大分子的b带,另一个则是由3种大小相近的小分子组成的c区带;在SDS-PAGE中,则显示出3个分子量接近、约为100 000的条带。经50％饱和硫酸铵盐析或用Sephadex G200凝胶过滤层析法可浓缩但不能纯化中华绒螯蟹血清凝集素。经DEAE-Sephadex A50离子交换层析法可获得2个蛋白峰,其中只有1个峰有凝集活性,在PAGE中表现为a蛋白带。凝集活性较高、分子量较大的蛋白带。上述实验结果表明,应用鼠红细胞膜法可纯化中华绒螯蟹血清凝集素。     

蟹源致病性拟态弧菌的粘附及侵袭特性

病原菌对机体的致病作用是由其产生的各种毒力因子共同作用的结果,其中病原菌对组织细胞或粘膜的表面粘附是造成机体感染的首要条件。病原菌的粘附因子主要包括菌毛粘附素和其它非菌毛粘附素(如鞭毛、外膜蛋白和血凝素等),其中以菌毛介导的病原菌对组织细胞的粘附是细菌在体内定居、增殖释放毒力因子发挥致病作用的关键。为了揭示拟态弧菌HX 4的致病机理,以经典粘附模式细胞HEp 2细胞作为体外细胞模型,探讨蟹源致病性拟态弧菌HX 4株的粘附特性以及受体物质和抗全菌抗体对细菌粘附作用的影响,同时采用庆大霉素清洗裂解培养法测定该菌对HEp 2细胞的侵袭力。结果显示,HX 4菌株能粘附HEp 2细胞,对HEp 2细胞具有侵袭力。细菌对HEp 2细胞的粘附方式为集聚性粘附,最佳粘附时间为1h,甘露糖和抗体能显著抑制该菌的粘附,表明HEp 2细胞上含有甘露糖样受体。该菌的粘附素除了主要是菌毛外,可能还含有鞭毛、外膜蛋白、血凝素等多种成分。     

恩诺沙星及其代谢产物在中华绒螯蟹血淋巴中的比较药代动力学

研究了不同水温(16℃、25℃)、不同给药剂量(10 mg/kg、20 mg/kg)和不同给药方式(肌注、口灌)等条件下,恩诺沙星及其代谢产物环丙沙星在中华绒螯蟹体内的药代动力学,比较了不同条件下药物在蟹血淋巴中的吸收、分布和代谢的差异。结果表明,恩诺沙星在蟹血淋巴中的药-时数据符合开放式二室模型。16℃时以10 mg/kg剂量肌注给药后,恩诺沙星在蟹血淋巴的主要药代动力学参数为:AUC96.818 mg/(L.h),Cmax6.54μg/mL,t1/2α0.851 h,t1/2β95.415 h;25℃时以10 mg/kg剂量肌注给药后,恩诺沙星的主要药代动力学参数为:AUC168.457 mg/(L.h),Cmax7.12μg/mL,t1/2α0.58h,t1/2β88.833 h;25℃时以20 mg/kg剂量肌注给药后,恩诺沙星的主要药代动力学参数为:AUC155.612 mg/(L.h),Cmax11.045μg/mL,t1/2α5.239h,t1/2β88.378 h;25℃时以10 mg/kg剂量口灌给药后,恩诺沙星的主要药代动力学参数为:AUC86.525 mg/(L.h),Cmax3.469μg/mL,t1/2α8.071h,t1/2β61.842 h。不同条件下,恩诺沙星在蟹血淋巴中的主要药代动力学参数差异较大。恩诺沙星的活性代谢产物环丙沙星在各种给药条件下的蟹血淋巴中均能检出,但含量均处于较低值,且药-时数据不能用房室模型拟合,表明恩诺沙星在蟹体内只有极少部分代谢为环丙沙星。     

水体pH对中华绒螯蟹幼蟹蜕壳生长及其相关基因表达的影响

为了解养殖水体p H值对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)蜕壳生长及其相关基因表达的影响,在试验室水槽条件下,设定p H=7、8、9、10(均无水草)为实验组,以种植适量水草(p H值为8.2~9.1)为对照组,研究中华绒螯蟹幼蟹(均重0.43 g±0.09 g)在不同p H值水体中饲养一个蜕壳周期(37 d)的蜕壳生长及其相关基因(蜕皮抑制激素MIH,蜕皮激素受体EcR,维甲类X受体RXR,胰岛素样生长因子IGF2)表达情况。结果显示,对照组河蟹的成活率和增重率均显著高于实验组,其中,p H10的河蟹成活率和增重率最低。荧光定量PCR检测显示,MIH、EcR和RXR基因在不同p H水体的表达存在显著差异,IGF2基因在不同p H水体中的表达无显著差异;不同p H水体幼蟹的增重率与成活率之间存在显著正相关,EcR、RXR与IGF2基因相互间的表达量存在显著正相关,表明这三个基因的表达具有协同作用。通过对成活率、增重率和基因表达的综合分析认为幼蟹生长的最适p H为8~9。     

Effect of poly-β-hydroxybutyrate on Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis, larvae challenged with pathogenic Vibrio anguillarum

This study investigated the protective effect of poly-β-hydroxybutyrate (PHB) on Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis, zoea larvae challenged with pathogenic Vibrio anguillarum. PHB was delivered to the crab larvae through rotifer and Artemia bioencapsulation. Zoea 3 larvae were challenged with V. anguillarum at a final concentration of 10(5) CFU mL(-1). PHB-enriched rotifers and Artemia nauplii were added to the culture water 24 h prior to, upon and 24 h after challenge. The results confirmed that PHB could enhance the survival and growth of unexposed E. sinensis larvae. Moreover, PHB protected larvae from the pathogen as the larvae fed PHB-enriched live food showed the highest survival and development rate in all challenged groups (P < 0.05). Furthermore, larval performance was the best when PHB was delivered to the larvae 24 h before challenge (P < 0.05). In conclusion, our results indicate that PHB can be used as part of an effective strategy to protect E. sinensis larvae from V. anguillarum resulting in higher survival and better growth, especially when applied before the challenge.     

腐败假单胞菌人工感染河蟹的毒性试验及药物敏感性实验

介绍了从不同的养殖区内,采集河蟹病蟹样品。在濒死的蟹体内分离检出的菌株,经系统生化鉴定有１２株菌,被鉴定为假单胞菌属;腐败假单胞菌。为研究证明腐败假单胞菌对河蟹的致病性及其毒力的强度,用人工注射的方法进行试验观察。     

pH胁迫对中华绒螯蟹5种非特异性免疫指标的影响

测定了不同pH(4.5,6.0,7.5,9.0,10.5)胁迫1、4、7、10d后中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血细胞呼吸爆发(RP)、血细胞破碎物上清液(HLS)酚氧化酶(PO)、血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)及碱性磷酸酶(ALP)活性的变化.结果表明:在pH胁迫后第1天,pH4.5组...     

中华绒螯蟹病害的流行态势及其对产业持续发展的思考

中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)养殖业是我国水产养殖支柱产业之一。随着中华绒螯蟹养殖产业飞速发展,病害问题也愈加严重,并逐渐成为了产业发展的"瓶颈"问题。本文就我国近年来中华绒螯蟹病害流行的态势、病害流行原因以及应对措施进行剖析,以期为推动该产业的持续发展提供相应的参考。     

3种微生态制剂对养殖水体水质影响的比较研究

对3种微生态制剂改善河蟹养殖池水质的效果进行分析比较。实验组各池中分别加入超浓缩光合细菌(PSB)、西菲利活菌生物净水剂、活菌净水剂以及3种微生态制剂组成的混合制剂。观察氨态氮、亚硝态氮、硫化氢、溶解氧、化学耗氧量、pH及异养菌总数等水质指标。结果表明:3种微生态制剂均能改善水质,抑制异养菌的过度增长,但对水质指标的改善各有侧重,混合制剂优于单一制剂。     

中华绒螯蟹“蟹黄”与“蟹膏”的营养成分比较分析

本试验对中华绒螯蟹"蟹黄"与"蟹膏"的粗蛋白、氨基酸、粗脂肪、脂肪酸、卵磷脂和维生素等营养成分进行了测定分析。试验结果表明,蟹黄与蟹膏中的粗蛋白质含量为29.79%和9.64%,蟹黄显著高于蟹膏(P0.05);至少共含有17种氨基酸,蟹黄中的必需氨基酸显著高于蟹膏(P0.05),4种致鲜氨基酸比例明显高于蟹膏(P0.05);蟹黄、蟹膏中粗脂肪含量为44.3%和34.9%,差异不显著(P0.05),不饱和脂肪酸含量丰富,蟹黄高于蟹膏,差异不显著(P0.05);蟹黄中卵磷脂、维生素A、D、E的含量均显著高于蟹膏(P0.05)。试验表明,蟹黄比蟹膏具有更高的营养与食用价值。