农杆菌介导的Cas9基因转化金针菇的研究

将酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9序列(SpCas9序列,Addgene#43802)根据金针菇(Flammulina velutipes)的密码子偏好性进行优化,并构建FvCas9双元表达载体,利用农杆菌介导法转化金针菇单核体Dan3,经抗性培养基筛选以及潮霉素和Cas9基因PCR扩增验证,结果显示Cas9基因已经成功转入金针菇菌丝体中,转化率为6.84%。     

草菇基因枪法遗传转化体系的建立

 草菇菌株V1308对潮霉素、卡那霉素、遗传霉素、膦丝菌素的抗性测验结果表明, 该菌株对潮霉素敏感, 而对其它三者不敏感。进一步测定结果显示, 潮霉素的最低筛选浓度在PDSA固体培养基上为75 μg·mL ^{- 1} , 在PDSB液体培养基中为50μg·mL ^{- 1}。以含有35S启动子、gus报告基因、潮霉素抗性基因的质粒pCAMB IA1301为表达载体, 采用基因枪法对草菇菌丝体进行遗传转化。结果表明, 基因枪的最佳轰击参数为: 氦气压力1 100 Psi, 真空压力87.88 kPa, 靶距离6 cm, 轰击次数1次。Southern杂交结果显示, gus基因已整合进V1308基因组中。GUS组织化学检测结果证明, gus基因在V1308菌丝体中获得了表达。草菇出菇试验结果显示, 转基因草菇和对照都能正常形成子实体, 子实体组织分离长出的菌丝体经GUS组织化学检测, 证明了外源基因gus能够在转基因草菇的菌丝体中稳定表达。     

基于CRISPR系统的双孢蘑菇基因编辑体系建立及应用

根据CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)基因编辑技术,设计AbPPO4特异性导向RNA,构建双孢蘑菇(Agaricus bisporus)基因编辑载体pAbGEB1-AbPPO4,再通过农杆菌介导转化双孢蘑菇菌丝体建立基因编辑体系,观察菌丝生长状况。结果表明:获得12株转化子,1号和7号的菌丝体中存在潮霉素抗性基因,且AbPPO4基因的相对表达量较低,分别为0.28±0.04和0.47±0.02,与对照组相比,组间差异均具有统计学意义(P0.05),说明1号和7号转化子的菌丝体AbPPO4基因表达受到了抑制;与对照组相比,1号和7号转化子的菌丝体中AbPPO4基因均发生了突变,1号和7号分别产生了4 bp和11 bp的碱基缺失,证明设计的CRISPR/Cas9系统在双孢蘑菇内对AbPPO4基因成功地进行了编辑;同时发现AbPPO4基因突变后对双孢蘑菇菌丝体的生长产生了不利影响。     

电击法转化金针菇菌丝碎片表达报告基因eGFP及GUS的研究

以不完全酶解的金针菇(Flammulina velutipes)菌丝碎片作为转化受体,通过电击转化法将载体pYN6981导入金针菇单核体Dan3基因组中。结果显示:在复筛培养基上生长良好的转化子,其基因组中可扩增出潮霉素基因片段,通过激光共聚焦显微镜可观察到绿色荧光,GUS组织染色显示为蓝色,说明目的载体已经成功插入金针菇基因组中并获得表达。转化效率达16个转化子每10~6个菌丝碎片。有丝分裂稳定性分析显示80%的转化子可以稳定遗传。     

农杆菌介导法转化金针菇不同受体的效率比较

以金针菇(Flammulina velutipes)单核体菌株Dan3和双核体菌株G1的菌丝碎片以及原生质体分别为转化受体,根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404为侵染菌株,潮霉素为筛选标记,绿色荧光蛋白编码基因(egfp)为外源基因,进行农杆菌介导转化金针菇。结果显示:金针菇双核体菌株G1的菌丝碎片作为受体时转化效率最高,为40.31%;单核体菌株Dan3的原生质体作为受体时转化效率最低,为21.87%。     

胡萝卜筛选标记选择及遗传转化

以常用的筛选剂潮霉素(Hyg)、除草剂Basta和卡那霉素(Kan)对胡萝卜愈伤组织进行敏感性试验,结果表明:胡萝卜愈伤组织对潮霉素和除草剂Basta非常敏感,筛选浓度分别以8mg/L和2mg/L较为合适;卡那霉素合适的筛选浓度应为150mg/L.以带bar基因的质粒载体对胡萝卜愈伤组织进行遗传转化,获得抗性愈伤组织和再生植株.     

利用CRISPR/Cas9敲除葡萄VviPDS1基因的研究

选择葡萄八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene desaturase)基因VviPDS1为靶标,利用CRISPR/Cas9系统构建基因敲除载体,瞬时转化葡萄叶片原生质体,检测到不同类型的突变。通过农杆菌介导转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织,筛选获得卡那霉素抗性植株71株。经PCR鉴定,其中53株为阳性植株,阳性率为74.64%。测序结果表明,共有20株在靶点发生不同类型的突变,编辑效率为37.74%;其中9株产生了双等位基因突变。对其进行氨基酸序列预测,在第202位氨基酸之后发生了不同程度的变异。利用CRISPR/Cas9系统敲除VviPDS1获得的突变体植株呈现整体矮化,其叶片出现不同程度白化。表明CRISPR/Cas9系统可以通过细胞中的瞬时或稳定表达进行基因编辑,可以实现在葡萄编辑植株中产生纯合敲除。     

外源抗药性基因导入香菇体内的研究

利用PEG转化法将携有潮霉素抗药性基因的质粒载体导入香菇原生质体内，获得了抗性转化子，但转化率较低，每微克DNA仅有0．5个转化子。点杂交证实，外源基因已整合到香菇染色体；不同转化子在抗笥平板上生长速率不同，且转化子有丝分裂是稳定的。香菇转基因技术的成功，为利用该技术克隆香菇内源基因及启动子，将外源有益目的基因导入香菇体内，为培育香菇基因工程菌株提供了可能。     

利用CRISPR/Ca9技术靶向编辑芥蓝BoaZDS

以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。     

几种抗生素对柑桔胚性愈伤组织,原生质体生长的影响

本文试验了４种抗生素对柑桔胚性愈伤组织，原生质体生长的影响，认为在柑桔的遗传转化中宜选用潮霉素磷酸转移酶（Ｈｐｔ）基因为选择标记基因，以潮霉素作为筛选剂，即使是使用新霉素磷酸转移酶基因作为选择标记基因，也不宜使用卡那霉素作为筛选剂，同时确定了柑桔遗传转化后的筛选时宜采用的抗生素浓度。     

RNAi法分析香菇色氨酸合酶基因的功能

色氨酸合酶(tryptophan synthase,TrpB)是生物体内一种重要的功能蛋白,在生物抗逆应激反应过程中发挥着重要的调控作用。本研究以香菇(Lentinula edodes)耐热栽培菌株S606为实验材料,采用双向启动子(Leactin和Legpd)启动LetrpB蛋白β亚基功能结构域的反向互补片段(400 bp),构建了LetrpB基因的RNAi载体,利用农杆菌介导法将该载体转入香菇菌丝中,在潮霉素培养基上筛选转化子,再通过PCR检测片段是否插入,获得了稳定的阳性转化子。实时荧光定量PCR结果显示,与野生型菌株相比,转化子的LetrpB基因表达量显著下调,转化子LeALDH、LeamiE等基因的表达量也显著下调,而LeYuccA的表达量显著上调。40℃高温处理24 h后,野生型S606的菌丝体在25℃条件下可以恢复生长,而RNAi转化子的菌丝体则不能恢复生长。研究结果表明,香菇菌株S606的LetrpB基因参与了热胁迫应激反应。     

以潮霉素为筛选标记猕猴桃遗传转化体系的初步建立

以带潮霉素筛选标记基因的质粒载体通过农杆菌介导法分别转化猕猴桃的叶片、叶柄和茎段,并获得转化再生植株.结果表明:筛选时潮霉素浓度以2 mg/L合适;叶片预培养以光照为适合,而叶柄和茎段差别不大;就转化率而言,茎段明显高于叶柄和叶片;经PCR检测初步证实转化植株为阳性植株.     

应用CRISPR/Cas9体系对番茄PSY 1基因的定点编辑

基于NCBI数据库提供的番茄八氢番茄红素合成酶基因(PSY 1)全长,并根据基因序列中PAM(proto adjacent motif)的位置设计特异性sg RNA,构建CRISPR/Cas9 Level 1、Level 2载体;将设计好的载体转化农杆菌,继而转染番茄子叶,利用PCR产物测序法检测sg RNA在番茄基因组中的敲除效率。结果表明,36个转基因植株中有22个PSY 1基因目标区出现不同数目的碱基缺失、增加或互换,初步估计基因敲除效率为61%。本试验在番茄中初步建立了CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除。     

银耳芽孢内源gpd启动子的克隆与功能鉴定

利用反向长距离PCR技术从银耳(Tremellafuciformis)芽孢gpd基因出发克隆上游gpd启动子序列,将预测的gpd启动子片段与多功能纤维素基因(mfc)连接构建表达载体,与潮霉素抗性质粒pBgGl-hph共转化银耳芽孢,对拟共转化子进行酶活发酵试验。结果表明:4轮反向长距离PCR克隆得到了1761bp的上游序列,经预测启动子落在上游1000bp左右区域内,包含两个高分值的起始转录位点,将gpd启动子分成gpd-Tre1(885bp)、gpd-Tre2(708bp)、gpd-Tre3(466bp)3段区域,分别与多功能纤维素基因(mfc)构建表达载体pgTre1-mfc、pgTre2-mfc和pgTre3-mfc。拟共转化子酶活发酵试验结果发现3个表达载体的转化子均能检测到多功能纤维素酶活,转化子T1-2包含gpd-Tre1启动子大片段,整体酶活最高,CMC酶活为14.12U/mL,比出发菌株Tr01提高34.3%,比工程菌株yLes3提高25.7%,木聚糖酶活为34.8U/mL,比Tr01酶活提高26.3%,略低于yLes3。3个启动子片段均具有表达活性,相比之下885bp的大片段gpd启动子表达活性更高。     

高渗处理对根癌农杆菌介导转化平菇菌丝体的影响

采用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens,EHA105菌株)介导法,对平菇(Pleurotus ostreatus)菌丝体遗传转化的最佳试验条件进行研究,结果表明:当平菇菌丝体与甘露醇和山梨醇的混合液预处理20min,且与农杆菌共培养60min时,转化效率高且用时较少。经PCR和Southern Blotting检测表明,转移DNA(transferred DNA,T-DNA)中的潮霉素抗性基因hph已整合到转化子基因组中。     

CRISPR/Cas9技术在天目地黄RcPDS1基因编辑中的应用

为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。     

萝卜过氧化物酶基因RsPrx1在毕赤酵母中的表达及其抗性

从成熟心里美萝卜肉质根的皮中提取总RNA,采用RT-PCR方法获得过氧化物酶基因RsPrx1的cDNA,将其克隆到pGEM-T载体中,并构建毕赤酵母重组表达载体pPIC9KH-RsPrx1。用L iC l法转化野生型毕赤酵母GS115获得重组转化子。用不同浓度的NaC l和H2O2处理重组毕赤酵母转化子,结果表明该转化子具有一定的抗盐和抗氧化能力。建立了RsPrx1重组毕赤酵母表达体系,能够有效表达具有生物活性的外源过氧化物酶。     

根癌农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立

以寒富苹果组培苗叶片为外植体,利用植物表达载体上含潮霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBI-A1301)和含卡那霉素抗性基因的根癌农杆菌EHA105(pCAMBIA2301)对影响寒富遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,寒富叶片对潮霉素反应敏感,在附加潮霉素的培养基上寒富叶片褐化较为严重。潮霉素和卡那霉素适宜的筛选质量浓度分别为4 mg.L-1和25 mg.L-1。农杆菌介导寒富苹果转化体系的建立以MS+TDZ 2.0 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1培养基为叶片离体再生芽培养基。适宜的转化条件为:菌液浓度D 600nm=0.5、叶片外植体在菌液浸泡8 min、共培养时间为3～4 d、推迟4 d进行筛选培养。抗性基因对转化效率具有明显的影响,EHA105(pCAMBIA2301)的平均抗性芽再生率(0.96%)比EHA105(pCAMBIA1301)的平均抗性芽再生率(0.58%)高出几乎50%,EHA105(pCAMBIA2301)的抗性芽再生率最高达1.87%。GUS组织化学染色和PCR鉴定结果表明本研究获得了寒富苹果转基因植株。     

金针菇假定蛋白E3泛素连接酶基因的鉴定与表达分析

以金针菇基因组与转录组数据为基础,通过本地BLAST方法鉴定金针菇假定蛋白E3泛素连接酶基因,命名为GENE5116,并对其结构、编码蛋白的基本性质与表达模式进行了分析,以期了解其在金针菇子实体生长发育过程中的作用。结果表明:该基因有9个外显子,8个内含子,基因总长为1998 bp,共编码438个氨基酸残基,相对分子质量为48987.36,等电点8.83;系统进化分析结果表明该基因与真菌E3泛素连接酶具有高度同源性,与陶兰柱担菌(Cylindrobasidium torrendii)亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果表明该基因在菌柄的表达量最高且菌柄上部基因表达量显著高于下部,在菌丝的表达量最低,所以推测该基因可能与子实体菌柄伸长有关。     

运用基因枪法进行蛹虫草遗传转化的研究

采用蛹虫草[Cordyceps militaris（L.）Link]野生型菌株CM01为供试材料,以金粉包裹质粒pDHt-gpdA-GFP-bar,运用基因枪法转化,经草铵膦抗性筛选,最终在靶距离6 cm或9 cm,氦气压力7.58 × 106 Pa或8.96 × 106 Pa条件下,获得2个遗传稳定的转化子Gfp2与Gfp3,转化效率为0.4 cfu ? μg-1。PCR鉴定与Southern杂交分析显示,草铵膦抗性基因Bar已经以单拷贝或者多拷贝方式整合到蛹虫草转化子的基因组中。蛹虫草转化子的菌丝在荧光显微镜下可以观测到绿色荧光,表明载体携带的绿色荧光蛋白基因在蛹虫草转化子中得到表达。研究结果表明可以把基因枪法应用于真菌蛹虫草,建立了一种简便有效的遗传转化方法,而转化效率需要通过优化基因枪参数设置、受体材料制备等途径进一步提高。