萝卜遗传转化体系的建立

系统研究了影响根癌农杆菌介导的萝卜(Raphanus sativus L.)遗传转化的若干因素,建立了萝卜遗传转化体系:即切取萝卜带柄子叶外植体,先进行2 d预培养,用OD600为0.3~0.5的EHA105农杆菌菌液侵染5~7 min后,再进行5 d共培养,然后将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1的培养基上进行7 d延迟筛选,再将外植体转接到MS+6-BA 6 mg.L-1+NAA 0.05 mg.L-1+Cef 500 mg.L-1+Hyg 5 mg.L-1的培养基上进行10 d的抗性筛选。结果共获得126个抗性芽,其中8个抗性芽经PCR检测扩增出目的基因的启动子BcA9,约850bp,阳性率为6.3%,初步验证目的基因已经转入萝卜再生芽中。     

农杆菌介导菊花双菌共转化法中部分影响因素的研究

用XhoI酶切质粒pCAMBIA1301自身环化后得到T-DNA区只含GUS基因的重组质粒pCAMBIA1301-GUS,通过液氮冻融法将质粒pCAMBIA1301-GUS,pCAMBIA1300转入农杆菌LBA4404和EHA105中,并对菊花进行叶盘共转化实验,根据共培养3d后叶片中GUS的瞬间表达及其稳定共转化率,测定了不同农杆菌菌株搭配及其不同浓度配比对共转化效率的影响,结果表明：在两种农杆菌菌液浓度比为1：1时,其中EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA1301-GUS组合,共转化效率要高于其它菌株的组合,而在EHA105/pCAMBIA1300与EHA105/pCAMBIA1301-GUS组合中,两种菌液浓度比为1：2时共转化效率最高.     

草莓主栽品种再生和转化的研究

 建立草莓主栽品种高效、稳定的离体再生体系和遗传转化体系, 获得了转基因植株。‘弗吉尼亚’和‘森嘎拉’的叶片离体再生芽频率达到100 %。试管苗叶片与农杆菌菌株EHA105 共培养3 d。共培养后的叶片在附加卡那霉素40 mg/L 的再生培养基上选择培养4周后, 外植体再生出转化芽, 弗吉尼亚的转化芽再生频率可达6. 8 %。采用组织化学染色法对随机选取的10 个GUS 基因转化植株进行基因表达测定, 结果5 个植株强烈表达GUS 活性。转bar 基因植株在附加除草剂草丁膦10 mg/L 的培养基上能够正常分化, 在田间对草丁膦表现出强烈抗性。转基因植株开花、结果正常。     

农杆菌介导萱草植株CHS基因的转化

以萱草‘香宝’愈伤组织为外植体,以10 d为继代周期,将携有PSN1301-CHS的农杆菌EHA105菌株侵染受体材料,使CHS基因导入到萱草‘香宝’中。建立萱草遗传转化的适宜条件:抑菌剂以浓度为350 mg/L的羧苄青霉素为宜;潮霉素为转化子的筛选剂,25 mg/L为适宜的作用浓度;转化中宜选择预培养时间为2 d;农杆菌菌液浓度OD600在0.6左右,选用重悬液为MS+3%糖;侵染时间为15 min;在菌液和共培养基中同加100μmol/L的乙酰丁香酮;共培养基时间为2 d。     

小西葫芦黄花叶病毒外壳蛋白基因导入西瓜的遗传转化

研究了西瓜品种ZKM的再生体系和农杆菌介导小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellowmosaic virus,ZYMV)的外壳蛋白(cp)基因导入西瓜的遗传转化体系。结果表明,质量分数0.6%琼脂是适宜种子萌发的基本培养基,切取5d龄的西瓜无菌苗子叶为外植体,接种在MS+BA2.0mg/L诱导培养基上,诱导不定芽效率最高。选用75mg/L卡那霉素筛选西瓜抗性芽较为合适,外植体经预培养2～3d,菌液浓度以OD600nm值为0.4,共侵染10min有利于提高西瓜转化的效率。经PCR检测,ZYMVcp基因已经导入西瓜植株,转化频率为0.15%。     

根癌农杆菌介导的‘魏可’葡萄遗传转化体系的优化

以‘魏可’葡萄离体叶片为外植体,利用植物表达载体上含有卡那霉素抗性基因(nptⅡ)的根癌农杆菌LBA4404(pCAMBIA2301)对影响‘魏可’葡萄遗传转化效率的因素进行系统研究。结果表明,最佳农杆菌介导‘魏可’葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,卡那霉素质量浓度5 mg·L-1,羧苄青霉素质量浓度200 mg·L-1。采用此体系对‘魏可’葡萄进行转化,共获得9株抗性苗。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法检测,结果表明,有4株通过了PCR检测,1株通过了RT-PCR检测,初步证明nptⅡ基因已经整合进入‘魏可’葡萄基因组中。将PCR产物回收,经测序验证nptⅡ基因完全整合进入‘魏可’葡萄基因组中。对CK及经PCR检测呈阳性的株系进行卡那霉素抗性鉴定,发现PCR呈阳性的株系均比CK抗Kan的能力明显增强。     

Prd29A:PaDREB2植物表达载体的构建及转化新疆杨的研究

PaDREB2是从银新杨(Populus alba×P.albavar.pyramidalis)中克隆得到的DREB类转录因子,该研究将逆境诱导型rd29A基因的启动子和PaDREB2构建到植物表达载体pCAMBIA1301上,并以新疆杨(Populus albavar.pyramidalis)试管苗的叶片外植体为受体,利用根癌农杆菌介导的方法进行遗传转化。筛选得到110株潮霉素抗性植株,经PCR检测,其中25株抗性植株存在目的基因Prd29A:PaDREB2。     

根癌农杆菌介导蓝猪耳转化系统的建立

 通过对影响根癌农杆菌介导蓝猪耳转化效果各种因素的研究, 建立了蓝猪耳高效稳定的遗传转化系统。研究结果表明, 农杆菌侵染叶片外植体效率最高; 外植体预培养不利于农杆菌的侵染; 乙酰丁香酮能大大提高根癌农杆菌转化蓝猪耳的效率。另外, 菌液浓度、侵染和共培养的时间及再生的途径等均对转化效率有一定的影响。叶片外植体与农杆菌共培养后, 经过抗性芽的诱导、根的再生, 70 d左右就可以获得抗性苗。抗性植株经GUS染色、PCR分析和Southern blot检测, 外源基因已经整合到蓝猪耳基因组中, 转化频率为7%～8%。     

甜蛋白基因MBLII 对莴苣的遗传转化

 以4 日龄莴苣(Lactua sativa L.) 无菌苗子叶为外植体, 通过根癌农杆菌介导,成功地进行了马槟榔甜蛋白基因MBLII 对莴苣的遗传转化。抗生素浓度和子叶外植体与农杆菌的共培养时间是影响转化的重要因素。附加卡那霉素( Kan) 50 mg/ L 的诱芽培养基MS I(MS+ NAA 0. 1 mg/ L+ 6􀀁BA 0. 1 mg/ L+ 羧卞青霉素500 mg/ L) 最适于侵染后子叶外植体的诱芽培养。在外植体与农杆菌共培养0~ 7 d 的范围内, 以共培养3 d 最佳( 生芽率58. 3%, 白化率29%) 。1~ 2 cm 再生芽移入诱根培养基MS II (MS+ NAA 0. 05 mg/ L+ Kan 50 mg/ L+ 羧苄青霉素300 mg/ L) 中, 诱根率可达100%。获得的抗性植株经组织化学及PCR 特异扩增鉴定和统计, 7. 6%阳性。Southern blot 结果证明MBL II 基因已整合到莴苣基因组中。     

樱桃矮化砧木''吉塞拉6号''基因转化体系的建立

采用'吉塞拉6号'甜樱桃矮化砧木(Prunus cerasus×P. canescens)离体叶片外植体,在再生培养基附加生长素的条件下通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(p35SGUS intron)介导研究了β-葡萄糖醛酸酶基因(GUS)的瞬时表达、稳定表达和转基因植株再生,证明了培养基中生长素(IBA或NAA)的存在可促进基因转化,转化效率比对照提高2倍以上.将500个叶片外植体与EHA105(p35SGUS intron)株系在含有生长素的培养基中共培养,获得了11个转基因株系.采用PCR分析和Southern Blotting核酸杂交,确定GUS基因已整合到矮化砧木'吉塞拉6号'植株的染色体上.组织化学染色确定了GUS基因在植株体内的表达.     

虾青素合成关键酶基因bkt 在‘Brookfield Gala’苹果中的遗传转化及表达

 虾青素是一种氧化型酮式红色类胡萝卜素,具有更强的抗光氧化能力。将β–胡萝卜素酮化酶（虾青素生物合成的关键酶）基因bkt构建入表达载体pCAMBIA1301中,获得植物表达载体p1301-bkt,转化根癌农杆菌EHA105,获得工程菌,以黄肉苹果‘Brookfield Gala’无菌试管苗叶片为受体,进行遗传转化。筛选压确定结果表明：‘Brookfield Gala’对潮霉素（Hyg）很敏感,叶片再生最佳Hyg选择压为3 mg · L^-1,试管苗增殖为4 mg · L^-1,生根为2 mg · L^-1;头孢霉素（Cef）浓度≤400 mg · L^-1时对叶片再生芽数的影响不明显。GUS染色、PCR和RT-PCR检测结果表明,有8株转基因植株整合bkt基因并获得了表达,其表型有红色产生;转基因植株类胡萝卜素的HPLC测定显示,虾青素和角黄素在叶片中的积累量达到2.85和1.79 μg · g^-1。本研究结果显示有望通过调控代谢途径,在苹果中合成虾青素,提高果实自身的抗光氧化能力,防止日灼。     

山茶花CjAPL1基因正义表达载体的构建及对拟南芥的转化分析

 为研究山茶花CjAPL1基因对于重瓣花形成的作用,构建了pCAMBIA1300-CjAPL1正义植物表达载体,酶切结果显示,CjAPL1基因正向插入pCAMBIA1300的启动子和终止子之间,表明CjAPL1植物表达载体构建成功。将pCAMBIA1300-CjAPL1采用农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥,获得转基因阳性植株65株。随机挑选表型变异明显的3株进行PCR扩增都得到了目的条带,Southern杂交鉴定进一步确认为转基因阳性植株。同时荧光定量检测到在转基因植株中CjAPL1基因表现出较对照显著提高6 ~ 25倍的表达量。转基因阳性植株表型变异明显,花柱和雄蕊数相比野生型各增加1枚和1 ~ 4枚,萼片边缘发育成白色的瓣化状,表明在拟南芥中过量表达CjAPL1基因可以引起花器官形态的变异和数量的变化,因此该基因在花器官形成和重瓣花发育中具有显著的调控功能。     

黄瓜Rubisco 活化酶基因CsRCA 表达载体构建与遗传转化

 核酮糖–1,5–二磷酸羧化/加氧酶（Rubisco）是光合碳循环中的关键酶,为了探明其在植物体内的活化机制,用农杆菌介导法将Rubisco活化酶（RCA）基因CsRCA导入黄瓜,分别用PCR、real-time PCR和Western杂交法进行分子检测,分析转基因植株的表达量。酶切鉴定结果显示,CsRCA正向插入植物表达载体pCAMBIA1301的CaMV 35S启动子和NOS终止子之间,成功构建CsRCA的正义表达载体。将pCAMBIA1301-CsRCA导入黄瓜自交系‘08-1’,获得7株转基因植株,拷贝数均为2（非转基因植株的拷贝数为1）,转化率约为3.5%。表达分析结果表明,7株T0代转基因植株叶片的CsRCA mRNA表达量为野生型（WT）的1 ~ 1.98倍,在蛋白水平的表达信号显著强于WT。T1代转基因植株的叶片叶绿素和类胡萝卜素含量、光合速率（P_n）及可溶性糖和淀粉含量均显著高于WT。研究结果表明,利用农杆菌介导法获得了稳定遗传的黄瓜CsRCA转基因植株,CsRCA过量表达能显著提高黄瓜叶片的P_n,增加干物质积累。     

基于颠茄发根的外源基因表达系统的建立

 用携带植物高效表达载体pCAMBIA1304 ⁺ “解除武装”的重组C58C1工程菌转化颠茄无菌苗真叶, 发根诱导率达100%。PCR检测证实发根型质粒pRiA4和表达型质粒pCAMBIA1304 ⁺均能整合到颠茄发根基因组内, 共转化率达30%。建立了基于颠茄发根的高效外源基因表达系统, 为将托品烷类生物碱东莨菪碱的生物合成关键酶基因导入颠茄, 实现其次生代谢工程及开展分子育种奠定了基础。     

草菇开伞相关基因反义表达载体构建

以质粒pCAMBIA1301和pBI121为基础构建草菇表达载体pCB。把已克隆的草菇开伞相关基因DNA片段正反向插入pCB,获得pCB—opn15和pCB—opn39,经测序证实,pCB—opn15为正向插入,pCB—opn39为反向插入。     

中国野生葡萄醛脱氢酶基因在拟南芥中的过量表达

将质粒pWR306中包含ED35s启动子、Omega元件及TNOS终止子的一段核苷酸序列定向克隆到质粒pCAMBIA1300,构建了植物中间表达载体pWR-II;将重组质粒pGEM-T-ALDH的醛脱氢酶(ALDH)基因片段定向克隆到pWR-II,构建了葡萄ALDH基因的植物过量表达载体pWR-II-ALDH。采用改进冻融法将其导入农杆菌EHA105,采用花序浸蘸法转化拟南芥,获得了潮霉素抗性的转化拟南芥植株。PCR检测证明外源基因已整合进拟南芥基因组,Real-timePCR结果表明ALDH基因在转化植株的表达量远高于野生种。转化植株和野生植株在形态上有一定的差异,说明葡萄ALDH基因在拟南芥中表达对其生长发育有一定影响。     

Efficient production of transgenic plants using the bar gene for herbicide resistance in sweetpotato

Efficient production of transgenic sweetpotato (Ipomoea batatas (L.) Lam.) plants using the bar gene for herbicide resistance was achieved through the use of embryogenic suspension cultures and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. Cell aggregates from embryogenic suspension cultures of sweetpotato cv. Lizixiang were cocultivated with A. tumefaciens strain EHA 105 harboring a binary vector pCAMBIA3300 with the bar gene and uidA gene. Selection culture was conducted using 0.5 mg/l PPT. A total of 1431 plants were produced from the inoculated 870 cell aggregates via somatic embryogenesis. GUS assay and PCR analysis of the regenerated plants randomly sampled showed that 86.5% of the regenerated plants were transgenic plants. Stable integration of the bar gene into the genome of transgenic plants was confirmed by Southern blot analysis and transgene expression was demonstrated by Northern blot analysis. The copy number of integrated bar gene ranged from 1 to 3. Transgenic plants exhibited functional expression of the bar gene by in vivo assay for herbicide resistance. This study also provides a simple and efficient transformation system of sweetpotato based on the use of bar gene as a selectable marker gene, which can be combined with other agronomically important genes for the improvement of sweetpotato.     

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI-aPG上切下大小约2.3kb的目的基因,将它定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上,构建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体pCB-aPG。采用直接转化法将pCB-aPG导入根癌农杆菌菌株LBA4404,采用该菌株对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株,经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定,证实了该反义基因已导入烟草基因组中。此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。