电击法转化金针菇菌丝碎片表达报告基因eGFP及GUS的研究

以不完全酶解的金针菇(Flammulina velutipes)菌丝碎片作为转化受体,通过电击转化法将载体pYN6981导入金针菇单核体Dan3基因组中。结果显示:在复筛培养基上生长良好的转化子,其基因组中可扩增出潮霉素基因片段,通过激光共聚焦显微镜可观察到绿色荧光,GUS组织染色显示为蓝色,说明目的载体已经成功插入金针菇基因组中并获得表达。转化效率达16个转化子每10~6个菌丝碎片。有丝分裂稳定性分析显示80%的转化子可以稳定遗传。     

金针菇疏水蛋白编码基因fvh1和fv-hyd1在双、单核菌株不同发育阶段的定量表达研究

以金针菇(Flammulina velutipes)双核菌株G和单核菌株dan3为试验材料,采用实时荧光定量PCR技术,比较fvh1和fv-hyd1基因在不同生长发育阶段中的相对表达量差异。实时荧光定量PCR结果显示:基因fvh1在双核菌株G中,菌丝阶段的相对表达量显著高于原基和子实体阶段,而单核菌株dan3中,测试3个阶段的相对表达量无显著差异;基因fv-hyd1在双核菌株G和单核菌株dan3中,原基阶段相对表达量均显著低于子实体阶段,而菌丝阶段表达量未检测到。     

农杆菌介导的Cas9基因转化金针菇的研究

将酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9序列(SpCas9序列,Addgene#43802)根据金针菇(Flammulina velutipes)的密码子偏好性进行优化,并构建FvCas9双元表达载体,利用农杆菌介导法转化金针菇单核体Dan3,经抗性培养基筛选以及潮霉素和Cas9基因PCR扩增验证,结果显示Cas9基因已经成功转入金针菇菌丝体中,转化率为6.84%。     

构建香菇转化的同源筛选标记的研究

通过比对分析多种导致真菌内源萎锈灵抗性的琥珀酸脱氢酶B亚基(SdhB)氨基酸序列的突变位点,将香菇(Lentinula edodes)SdhB氨基酸序列第243位的组氨酸替换为亮氨酸,构建了香菇萎锈灵抗性同源筛选标记载体,以农杆菌介导转化小米粒培养的香菇菌丝。转化子经5次传代后,PCR扩增验证插入片段,并观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况。结果显示:香菇单核体和双核体菌株经转化后,均能筛选到具有萎锈灵抗性的转化子,单核体菌株的转化率为34%,显著高于双核体菌株(4%);单核体转化子中的同源筛选标记及报告基因稳定性较好。本研究构建的萎锈灵抗性同源筛选标记可有效地在香菇遗传转化体系中应用。     

金针菇转核育种研究

从金针12（黄色）次级菌丝提取细胞核，分别与白色金针菇白雪和白色糙皮侧耳原生质体在高钙、高PH条件下融合。对再生菌丝的研究结果表明，无锁状联合的单核菌丝不形成子实体，但双核化后形成的具有锁状联合的双核菌丝则具有形成子实体的能力。试验结果显示，金针12与白雪组合后代均为黄色金针菇；而金针12与白色糙皮侧耳组合后代中，大多数菌株形成的子实体形态与白色糙皮侧耳类似，仅1%-2%菌株形成的子实体形态与白色金针菇类似。     

农杆菌介导的双孢蘑菇菌丝转化技术探讨

以双孢蘑菇(Agaricus bisporus)As2796液体培养菌丝为农杆菌转化受体,经潮霉素抗性平板筛选,共获得17个阳性转化子,对转化子进行外源插入基因的PCR扩增验证。研究结果表明:以液体培养菌丝为受体的农杆菌转化效率为8%～10%,相比菌褶作为转化受体效率低,但该方法周期短,且能满足实验室的日常转化需求。     

AEC对金针菇菌丝生长和粉孢子萌发的抑制作用

在PDA培养基和基本培养基中添加不同浓度的赖氨酸结构类似物S(2-氨基乙基)-2’半胱氨酸(AEC)，观察其对金针菇IM02单核菌丝和金白1号双核菌丝生长及其粉孢子萌发的抑制作用。结果表明，AEC对金针菇IM02单核菌丝和金白1号双核菌丝生长的抑制作用显著不同。当PDA培养基中AEC浓度为2000mg／L时，对金针菇IM02单核菌丝生长速度的抑制率为56．4％；金白1号双核菌丝对AEC较敏感，AEC浓度为62．5mg／L时，金白1号双核菌丝生长完全受到抑制。当基本培养基中AEC浓度为1200mg／L时，对IM02单核菌丝生长速度的抑制率可达82．5％；而当培养基中AEC浓度为37．5mg／L时，金白1号双核菌丝生长完全受到抑制。当PDA培养基中AEC浓度为2000mg／L时，10d内未见金针菇IM02单核菌丝和金白1号双核菌丝产生的粉孢子萌发。本试验为金针菇高赖氨酸良种的选育奠定了基础。     

不同细胞质的金针菇菌丝差异蛋白分析

以黄色金针菇(Flammulina filiformis)单核菌株Y33和白色金针菇单核菌株W8为供试菌株,采用双向核迁移技术,获得一对具有相同细胞核、不同细胞质的双核菌株Y8-33和W8-33(简称异质双核菌株)。采用菌落形态观察、显微镜检查与分子标记对这两个双核菌株进行验证分析,并以菌株W8-33菌丝样品为对照,采用双向凝胶电泳技术对金针菇异质双核菌株菌丝的蛋白质组进行分析。结果表明:异质双核菌株Y8-33和W8-33菌丝均具有锁状联合结构,在菌落形态上呈现明显差异,但ISSR分子标记的PCR扩增产物具有很高的相似性。在Y8-33菌丝样品中共鉴定出17个差异蛋白,包括8个上调蛋白、9个下调蛋白;其中,14-3-3蛋白、微管蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、果糖二磷酸醛缩酶、ARF/SAR蛋白家族以及热激蛋白HSP90、HSP70和HSS1差异蛋白可能在由于受体细胞不同所导致的不同细胞质环境下,对金针菇的生长生理起到重要的调控作用。     

金针菇单核体DAN3和M与其杂交双核体G1菌丝阶段基因表达差异的转录组初步分析

以金针菇(Flammulinavelutipes)单核菌株DAN3的基因组为参考,完成单核体DAN3和M及其杂交双核体G1在菌丝阶段的转录组测序与数据分析,比较两个样本间的差异基因,并对差异基因进行GO功能分析和KEGG pathway分析.结果表明:两个样本中共有显著性差异表达的基因86个,其中,在G1中呈上调、下调表达的基因数分别为41、45个,有2个基因在G1中特异表达.GO功能分析结果表明,86个差异基因中有40个基因比对上了GO功能注释,其中18个基因在G1中呈上调表达;单一生物过程和催化活性为显著性富集的功能,相关基因在G1中呈上调表达.KEGG pathway分析结果表明,22个差异基因被定位到17条Pathway,其中10个基因在G1中呈上调表达,包括赖氨酸代谢途径对应基因,3_M和G1菌丝样品中赖氨酸含量分别为1.70×103 ng/mg和1.06×103 ng/mg,说明G1中上调的基因可能与之降解相关;DNA复制是显著性富集的代谢途径,相关基因在G1中呈下调表达.     

侧耳与香菇原生质体无性再生株性状研究

本研究以11个菌株为材料,对原生质体无性再生株的单、双核比例、产菇优势及出菇性状进行了研究。结果表明:（1）侧耳、香菇无性再生株以“锁状联合”的有无可区分为无锁状联合的单核株和有锁状联合的双核株,但其比例因菌株不同而迥异;（2）同一菌株的单、双核株的菌丝生长速度、出菇期及菇产量等性状有较大差异,双核株多优于单核株;但原生质体双核株与其亲株双核株相比,优劣因菌株而异;（3）无性单核株是进行细胞融合或常规杂交育种的理想材料,而原生质体双核株可用于选出优质高产菌株。     

超声波辅助发根农杆菌对黄瓜遗传转化的影响

 由于超声波处理可增加农杆菌与外植体之间的接触面积, 提高农杆菌对外植体的转化频率。本试验用野生型发根农杆菌A4 菌株感染黄瓜无菌苗的子叶和下胚轴, 建立了黄瓜的发根遗传体系。并对超声波处理时间、外植体放置方向、预培养时间、外植体类型、乙酰丁香酮等影响因素进行了优化。     

枸杞遗传转化研究进展

枸杞是多棘刺浆果类落叶小灌木,具有“药食同源”型的综合特征.现从遗传转化方法、转化所用的外植体以及导入的外源目的基因等方面总结了枸杞的遗传转化研究进展,分析了枸杞转基因研究中存在的一些问题,并探讨了今后的研究方向及应用前景.     

魔芋的遗传转化研究

 通过农杆菌介导和基因枪法, 首次将AGPS1反义基因导入魔芋基因组, 并对获得的转基因植株进行了PCR和PCR-Southern检测。     

农杆菌介导的蝴蝶兰基因转化系统的建立

 针刺后的蝴蝶兰‘White Hikaru’的类原球茎(PLB)，与含绿色荧光蛋白基因( )和潮霉素磷酸转移酶基因(^p￡)的pCAMBIA 1300一SmGFP的根瘤农杆菌LBA4404 共培养，培育出了转基因的蝴蝶兰。经绿色荧光蛋白检测和Southern印迹，证实了再生植株中含cop基因和hpt基因。     

番茄无选择标记转化体系的研究

以含多毛番茄GGPS 基因的表达载体pBI121-GGPS 和无标记载体pBINMF-GUS 为基础,利用载体pBINMF-GUS 的T-DNA 区无选择标记基因的特点,将目的基因GGPS 连接于pBINMF-GUS 的T-DNA 中,用农杆菌菌株EHA105、C58 介导转化番茄品种中蔬6 号,利用PCR 直接筛选转化体。结果表明：MS+1.0 mg·L^-1 ZT+0.5 mg·L^-1 IAA 为子叶最佳芽诱导培养基,农杆菌菌株EHA105 更利于中蔬6号的转化,获得阳性植株4 株,转化率为3.6%。PCR 及RT-PCR 检测结果表明：目的基因已整合到中蔬6 号基因组中,且在转录水平上得到表达。     

胡萝卜遗传转化研究进展

综述了胡萝卜遗传转化的研究进展,主要介绍了农杆菌介导法和DNA直接转化方法(包括基因枪法、电击法和PEG介导法)的分子机制和进展,并对遗传转化中受体基因型、外植体类型和菌株类型等影响因素进行阐述,以期为建立一个高效胡萝卜遗传转化体系提供理论依据。     

农杆菌介导菜豆铁结合蛋白基因(PvFer)转化番茄的研究

利用农杆菌介导的转化方法将菜豆铁结合蛋白基因（PvFer）导入‘粉红 908’番茄基因组中。经PCR、PCR-Southern、Southern blotting检测证实,外源基因已整合到2株番茄基因组中。半定量式RT-PCR检测表明,外源菜豆铁结合蛋白基因在2株转基因植株中得到了表达。测定番茄果实和叶片中铁、锌、锰含量表明,转ferritin基因株系T1的叶片铁含量提高了174%,果实中的铁含量提高了37%,锌在果实中提高了119%,而锰在果实中的含量却降低了56%。     

板栗低产林改造技术研究

为有效地利用低产板栗树资源,提高其经济效益,在广南的董堡9和莲城镇开展了历时5年的低产板采嫁接改造试验。结果表明,以树龄10年以下,胸径不超过8cm的低产板栗树作砧木,选用与其生境相近的,九家种板栗优良品种作接穗,用劈接或切接方法在砧木的萌芽期媾接,可获得良好的效果。其嫁接成活率75．5％以上,嫁接成活的新植株具有发达的根系,生长适应性强,2年结果,3-4年进入蛊果期,果实品质好,经济价值高。     

农杆菌介导石斛兰遗传转化的研究

利用根癌农杆菌介导转化石斛兰类原球茎（PLBs）,研究了石斛兰对潮霉素的敏感性,并通过gus瞬时表达率比较不同类型农杆菌、侵染液浓度及乙酰丁香酮（AS） 等对石斛兰转化的影响。结果表明：带有pCAMBIA1301的根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105（简称为E1301）比带有相同表达载体的LBA4404（简称L1301）对石斛兰的转化效率更高,前者约为后者的6倍;较高浓度的侵染液转化效率更高（OD₆₀₀为1.0或1.2时的转化效率约为OD₆₀₀为0.6或0.8时的2倍）;在农杆菌生长至OD₆₀₀值为0.8时,添加AS可提高转化效率;而当OD₆₀₀为0.6、1.0和1.2时,添加AS反而不同程度地降低转化效率;在各种处理中,OD₆₀₀为1.0时不添加AS的转化效率最高,达44.4％。经过5~6个月选择培养,抗性小苗经GUS染色、PCR 和 Southern杂交检测证明为转基因植株。     

葡萄糖氧化酶( GO ) 基因在番茄中的遗传转化

 将来自黑曲霉的葡萄糖氧化酶( glucose oxidase, GO ) 基因与病原诱导启动子Prp1-1融合,构建了植物表达载体pCPGO, 该载体具有抗除草剂PPT选择标记。经农杆菌介导转入番茄自交系, 获得了阳性转基因植株58株, Southern杂交结果表明, GO基因已整合到番茄基因组中。通过淀粉- KI显色反应和定量检测, 表明GO基因已经表达。转基因植株花器及开花正常, 种子一旦萌发, 其生长、发育各时期均正常。但结实率有所减少, 种子萌发率有所降低。用番茄叶霉病( Fulvia fulva) 病原菌1.2.3.4生理小种侵染T₁ 代转基因植株, 结果显示转基因番茄植株的抗病性有不同程度的提高, 多数发病时间推迟, 病情明显减轻。经测定与抗病性相关的几个指标, 结果转基因番茄叶片中SOD、POD、CAT的活性和蛋白质含量均增高。