利用CRISPR/Cas9系统敲除葡萄中VviEDR2提高对白粉病的抗性

利用CRISPR/Cas9系统定点编辑葡萄白粉病感病基因VviEDR2（Enhanced disease resistance 2），在VviEDR2的DUF1336结构域设计靶位点VviEDR2-T1，构建CRISPR/Cas9敲除载体，通过农杆菌介导法转化‘无核白’葡萄胚性愈伤组织。对PCR阳性植株进行靶位点扩增测序，结果表明，共有8个转基因植株在靶位点处发生不同类型的双等位基因突变，编辑效率为32%；突变体植株生长势较弱，叶片较小，茎秆丛生、细弱。进一步对突变体植株进行抗病检测，结果表明，接种葡萄白粉菌（Erysiphe necator Schw.）5 d后，突变体植株叶片上白粉菌孢子仅能萌发出少量较短初级菌丝，表皮细胞产生大量明显的H2O2，而野生型叶片中白粉菌萌发出大量初级菌丝、次级菌丝和吸器，无明显H2O2产生。这些结果表明，可以利用CRISPR/Cas9技术编辑葡萄感病基因VviEDR2，提高葡萄白粉菌抗性。     

利用CRISPR/Cas9技术敲除青花菜BoSP11创制自交亲和系

通过CRISPR/Cas9技术敲除SRK基因或者SP11基因可以直接将甘蓝类蔬菜自交不亲和材料改造成自交亲和材料。本研究中根据全基因组重测序获得青花菜(Brassica oleracea var.italic) BoSP11基因序列,构建双靶位点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法对BoSP11进行敲除。结果显示,获得的29株转基因植株中有23株发生基因突变,编辑效率为79.3%。TA克隆测序结果表明有4株为纯合突变,19株为杂合突变。统计纯合突变T₀代自交结籽情况发现花期自交亲和指数高达6.82,为目前所报道的能获得的亲和性最高指数。T₁代植株在隔离大棚中通过蜜蜂授粉平均单株采收种子24.8 g,完全实现不需要人工干预完成亲本材料的自交繁育。     

利用CRISPR/Ca9技术靶向编辑芥蓝BoaZDS

以芥蓝(Brassicaoleraceavar.alboglabra)为材料,以ζ–胡萝卜素脱氢酶(ζ-Carotene desaturase,ZDS)基因为目标基因,建立其CRISPR/Cas9基因组编辑体系。在BoaZDS的编码区近5′端选择靶位点,构建了CRISPR/Cas9表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化方法获得了19个芥蓝转基因阳性植株,Sanger测序分析发现其中13株成功突变,CRISPR/Cas9载体在芥蓝上的突变效率为68.42%,且所有突变植株均表现出明显的白化表型。     

利用CRISPR/Cas9技术创制番茄粉果和无绿肩材料

以栽培番茄品种（系）Ailsa Craig(AC)、B5和B9为试材，利用CRISPR/Cas9双元表达载体系统，对番茄品质调控关键基因SlGLK2和SlMYB12进行定点敲除。获得AC背景下SlGLK2和SlMYB12的基因编辑植株各9株，B5背景下SlGLK2的基因编辑植株3株，B9背景下SlMYB12的基因编辑植株4株。通过对靶点测序发现，在靶位点的PAM上游3～4 bp处发生了不同形式的碱基缺失、插入或替换，主要以1～10 bp的缺失和单碱基G和T的插入为主；也产生了两靶点间的大片段缺失，最大片段为334 bp。AC背景下敲除SlMYB12产生粉色果实，敲除SlGLK2基因，果实肩部的绿色明显变浅，B5背景下的3株基因编辑番茄均无“绿肩”。本研究中利用CRISPR/Cas9技术在不同番茄种质中成功创制了敲除SlGLK2或SlMYB12的基因编辑材料，以期为番茄品质育种提供优良种质。     

利用发根农杆菌体系检测西瓜CRISPR/Cas9系统的靶位点

西瓜遗传转化技术周期长,过程复杂,CRISPR/Cas9基因编辑系统又存在着一定的脱靶效应,为了保障所选择的靶位点的可行性,本研究选择西瓜ClSPO11-1基因(ID:Cla003301)为靶标,利用CRISPR/Cas9基因编辑系统构建双靶点的基因敲除载体,利用发根农杆菌Ar. Qual菌株侵染西瓜子叶外植体,通过简单的组培过程,使西瓜外植体长出不定根,在不定根中检测到了在靶位点1处发生了不同程度的碱基缺失,经过与野生型氨基酸序列比对分析后发现均造成了翻译提前终止和氨基酸的突变,成功实现了对西瓜不定根的基因编辑,该方法周期短,操作简便,实现了快速鉴定在西瓜中选择的靶位点的靶向效率,为研究西瓜基因功能和遗传改良提供了保障。     

CRISPR/Cas9技术在天目地黄RcPDS1基因编辑中的应用

为了研究CRISPR/Cas9技术在天目地黄基因编辑中的应用，克隆了天目地黄（Rehmannia chingii）的八氢番茄红素脱氢酶基因（Rc PDS1），利用PCR方法扩增其c DNA序列和基因组DNA序列。通过构建单靶点CRISPR/Cas9载体，利用根癌农杆菌介导的遗传转化方法侵染天目地黄无菌苗叶盘，通过TA克隆测序法分析基因编辑的类型。结果显示，克隆获得了1个天目地黄Rc PDS1的全长c DNA序列，其具有1个长度为1 743 bp的开放阅读框，编码580个氨基酸残基，基因组DNA序列长度8 041 bp，包含14个内含子和15个外显子。通过遗传转化共获得57个转基因再生株系，其中具明显白化表型的株系有20个（35.09%）。TA克隆测序结果显示，Rc PDS1靶位点突变类型主要包括碱基缺失、替换和插入。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在天目地黄中成功实现了对Rc PDS1基因的靶向敲除。     

梨愈伤组织双靶点CRISPR/Cas9基因编辑系统的建立

为了在梨愈伤组织中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,将proDAM3:GUS转入‘茄梨’愈伤组织,通过构建双靶点的CRISPR/Cas9基因编辑载体,利用农杆菌介导的遗传转化法侵染proD AM3:GUS转基因梨愈伤组织,通过测序及GUS染色的方法检验敲除效果,分析靶基因突变类型。结果表明,共有4个转基因株系在靶位点处发生了基因突变,编辑效率为66.7%。对所有基因编辑株系的有效克隆进行分析,结果显示sgRNA1在靶位点GUST1的突变频率达到71.4%,高于sgRNA2在靶位点GUST2突变频率的46.4%,说明sgRNA1可以更有效地与靶位点结合。测序结果表明,4个基因编辑株系中GUS基因均被敲除,基因突变的类型包含碱基缺失、插入及两个靶点之间大片段的缺失,不存在碱基替换。GUS染色结果显示,基因敲除后的GUS转基因愈伤完全呈白色,说明利用CRISPR/Cas9多靶点基因编辑系统可以在梨愈伤组织中实现高效的基因敲除。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在果树作物中的应用研究进展北大核心CSCD

成簇规律间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白9(Cas9)已成为一种有价值的基因组编辑工具,能够在特定选择的位点改变DNA序列,可以在作物基因组的靶点位置精确地实现删除、替换或插入特定序列,引入理想的目标性状。该工具具有简单、高效、成本低以及功能强大等特性,在柑橘、葡萄、香蕉和草莓等果树中已实现多种类型的应用,包含产生白化表型、调控童期和花期、调控果实品质以及创造矮化和抗病虫害品种等。综述了CRISPR/Cas9系统及其作用过程,介绍了新开发的精准编辑技术,包括单碱基编辑器、引导编辑及CRISPR/Cpf1多基因编辑系统,并详细阐述了CRISPR/Cas9系统在果树基因组编辑中的应用进展,包括果树种类、目标基因及目标性状等,归纳了CRISPR/Cas9系统实现高效编辑所遇到的遗传转化和再生体系、脱靶效应和启动子选择问题,最后提出了不断优化遗传转化和再生体系、合理选择靶位点和设计sgRNA、植物内源启动子及新编辑技术的解决策略。     

应用CRISPR/Cas9体系对番茄PSY 1基因的定点编辑

基于NCBI数据库提供的番茄八氢番茄红素合成酶基因(PSY 1)全长,并根据基因序列中PAM(proto adjacent motif)的位置设计特异性sg RNA,构建CRISPR/Cas9 Level 1、Level 2载体;将设计好的载体转化农杆菌,继而转染番茄子叶,利用PCR产物测序法检测sg RNA在番茄基因组中的敲除效率。结果表明,36个转基因植株中有22个PSY 1基因目标区出现不同数目的碱基缺失、增加或互换,初步估计基因敲除效率为61%。本试验在番茄中初步建立了CRISPR/Cas9介导的基因敲除技术,该技术能够稳定的在番茄中实现基因敲除。     

基于CRISPR系统的双孢蘑菇基因编辑体系建立及应用

根据CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)基因编辑技术,设计AbPPO4特异性导向RNA,构建双孢蘑菇(Agaricus bisporus)基因编辑载体pAbGEB1-AbPPO4,再通过农杆菌介导转化双孢蘑菇菌丝体建立基因编辑体系,观察菌丝生长状况。结果表明:获得12株转化子,1号和7号的菌丝体中存在潮霉素抗性基因,且AbPPO4基因的相对表达量较低,分别为0.28±0.04和0.47±0.02,与对照组相比,组间差异均具有统计学意义(P0.05),说明1号和7号转化子的菌丝体AbPPO4基因表达受到了抑制;与对照组相比,1号和7号转化子的菌丝体中AbPPO4基因均发生了突变,1号和7号分别产生了4 bp和11 bp的碱基缺失,证明设计的CRISPR/Cas9系统在双孢蘑菇内对AbPPO4基因成功地进行了编辑;同时发现AbPPO4基因突变后对双孢蘑菇菌丝体的生长产生了不利影响。     

CRISPR/Cas9介导柑橘CsLOB1基因启动子的多位点编辑

为了获得CsLOB1启动子较大片段删除的突变体,利用CRISPR/Cas9技术对CsLOB1启动子进行多位点编辑。通过在CsLOB1启动子的EBEPthA4区域及其上、下游设计不同的靶标位点,构建了2个植物表达载体pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites,分别对CsLOB1启动子同时进行2个位点和3个位点的编辑。测序结果表明pCas9CsLOB1:2sites和pCas9CsLOB1:3sites的基因编辑效率分别为64.7%和80.0%,突变体植株在2个sgRNA之间发生了DNA片段的删除。进一步的分析发现,不同的sgRNA具有不同的突变效率,其差异是由于不同的sgRNA对CsLOB1-识别和结合能力的差异造成的。本结果表明对CsLOB1启动子进行多位点编辑可以获得删除较大DNA片段的突变体。     

A simple and efficient CRISPR/Cas9 platform for induction of single and multiple,heritable mutations in barley (<Emphasis Type="Italic">Hordeum vulgare</Emphasis> L.)

Background

Genome editing of monocot plants can be accomplished by using the components of the CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR associated Cas9) technology specifically optimized for these types of plants. Here, we present the development of RNA-guided Cas9 system for simplex and multiplex genome editing in barley.

Results

We developed a set of customizable RNA-guided Cas9 binary vectors and sgRNA modules for simplex and multiplex editing in barley. To facilitate the design of RNA-guided Cas9 constructs, the pBract derived binary vectors were adapted to Gateway cloning and only one restriction enzyme was required for construction of the sgRNA. We designed a synthetic, codon optimized Cas9 gene containing the N terminal SV40 nuclear localization signal and the UBQ10 Arabidopsis 1st intron. Two different sgRNAs were constructed for simplex editing and one polycistronic tRNA-gRNA construct (PTG) for multiplex editing using an endogenous tRNA processing system. The RNA-guided Cas9 constructs were validated in transgenic barley plants produced by Agrobacterium-mediated transformation. The highest mutation rate was observed in simplex editing of the cytokinin oxidase/dehydrogenase HvCKX1 gene, where mutations at the hvckx1 locus were detected in 88% of the screened T₀ plants. We also proved the efficacy of the PTG construct in the multiplex editing of two CKX genes by obtaining 9 plants (21% of all edited plants) with mutations induced in both HvCKX1 and HvCKX3. Analysis of the T₁ lines revealed that mutations in the HvCKX1 gene were transmitted to the next generation of plants. Among 220 screened T₁ plants we identified 85 heterozygous and 28 homozygous mutants, most of them bearing frameshift mutations in the HvCKX1 gene. We also observed independent segregation of mutations and the Cas9-sgRNA T-DNA insert in several T₁ plants. Moreover, the knockout mutations of the Nud gene generated phenotype mutants with naked grains, and the phenotypic changes were identifiable in T₀ plants.

Conclusions

We demonstrated the effectiveness of an optimized RNA-guided Cas9 system that can be used for generating homozygous knockout mutants in the progeny of transgenic barely plants. This is also the first report of successful multiplex editing in barley using a tRNA processing system.

     

中国野生毛葡萄芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23调控抗白粉病的研究

利用同源克隆法得到抗白粉病的中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23的开放阅读框，并构建过表达载体；通过器官发生途径诱导不抗白粉病的欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织并采用农杆菌介导法对其进行转化；经过PCR检测和Western blot鉴定，获得了5株VqSTS11超量表达植株和3株VqSTS23超量表达植株；人工接种白粉菌发现，转基因植株中白粉菌菌丝生长速度慢，孢子萌发受到一定的抑制，并且转基因植株中芪合酶基因相对表达量升高，抗病相关基因表达上调，芪类物质含量积累增多。本研究结果进一步证明中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23对白粉菌具有抗性，‘丹凤–2’可以为改良欧洲葡萄品种抗病性提供抗病基因，作为抗病育种的资源。     

矮牵牛花发育相关基因PhTs2的克隆及功能分析

从矮牵牛‘幻想’中克隆了花发育相关基因PhTs2，该基因CDS长855 bp，编码284个氨基酸，具有保守的adh-short结构域。进化分析表明，PhTs2蛋白与同科植物烟草和番茄的同源蛋白亲缘关系较近。实时荧光定量PCR分析发现该基因在矮牵牛花药发育的早期特异性表达。为分析其功能，构建PhTs2超量表达载体，转化了烟草，并对转基因烟草进行了鉴定：表型观测发现其花药形态异常，花粉数量减少；花粉活力和萌发率极显著降低；扫描电镜观测发现其花粉粒畸形，外壁纹饰不规则；半薄切片显示其绒毡层发育过程紊乱。该研究为培育雄性不育系提供了潜在的基因资源。     

苹果蔗糖转运蛋白MdSUT2调控花青苷积累的研究

从‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)中克隆蔗糖转运蛋白基因MdSUT2(序列号:MDP0000277235),该基因包含1 704 bp开放阅读框,编码566个氨基酸,蛋白大小为56 kD。构建MdSUT2表达载体并利用农杆菌介导法侵染拟南芥,半定量RT-PCR证明Md SUT2在拟南芥中异源表达。构建瞬时表达载体,‘红星’苹果进行Md SUT2瞬时表达,其花青苷含量增多,而沉默该基因花青苷含量明显降低。     

STTM技术沉默马铃薯Stu-miR156对其侧根发育的影响

为了阐明Stu-miR156在马铃薯侧根发育中的生物学功能,以马铃薯栽培品种‘Desiree’为试验材料,利用短串联靶标模拟物(Short tandem target mimic,STTM)技术,成功构建了Stu-miR156沉默表达载体,通过农杆菌介导法转化马铃薯获得了转化植株,qRT-PCR技术检测Stu-miR156及其靶基因StSPL9在转基因植株中的表达量。并通过构建pCAM-GFP-StSPL9融合蛋白表达载体转化烟草,发现靶基因StSPL9位于细胞质和细胞核中。q RT-PCR分析结果表明:在马铃薯转基因株系L1和L2中,Stu-miR156表达量受到严重抑制,在根、茎和叶中均不同程度地下调,其靶基因StSPL9均上调表达。表型分析表明:与野生型对照相比,转基因植株的侧根数量显著减少,生长受到抑制。