多重PCR检测猪伪狂犬病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型的研究

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病毒(PRV)的gH基因、猪细小病毒(PPV)的VP2基因序列和猪圆环病毒2型(PCV2)的ORF2基因序列,设计合成了3对特异引物,分别建立了PRV,PPV和PCV2的单项PCR诊断方法;通过对扩增条件的筛选,建立了PRV,PPV,PCV2的复合PCR诊断方法,利用1次PCR反应,即可同时扩增PRV的355 bp,PPV的195 bp和PCV2 487 bp的特异性片段,而猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、正常细胞(PK-15)扩增结果均为阴性,对PRV,PPV,PCV2的最低检出量分别为100 fg,1 pg和10 pg的DNA.该方法适合对PRV,PPV和PCV2的联合检测和鉴别诊断.     

猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎双重一步法RT-PCR诊断试剂盒的研制

根据GenBank中的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ORF7N基因、猪乙型脑炎病毒（JEV）NS1基因序列,设计了2对引物,通过反应条件的优化,成功研制了检测PRRSV和JEV的双重一步法RT-PCR诊断试剂盒,扩增产物分别为245、504 bp。敏感性、 特异性结果显示,该RT-PCR诊断试剂盒对2种病毒的最低核酸检测量分别为PRRSV0.2ng/L、JEV 0.4ng/L,而对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒的扩增结果均为阴性。对52份疑似病猪样品的检测结果表明,该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明该双重一步法RT-PCR诊断试剂盒具有很好的特异性和敏感性,可用于临床猪繁殖与呼吸综合征和猪乙型脑炎的检测。     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪细小病毒VP2保守区基因194 bp片段,并克隆到pGEM T载体上,纯化质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪细小病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.0×102拷贝/μL,与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒和猪流感病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对10份疑似病料和阴性病料进行了检测,发现10份均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出7份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床猪细小病毒(PPV)的检测.     

猪Ⅱ型圆环病毒-伪狂犬重组病毒活疫苗SA215(C)株的构建(初报)

根据GenBank发表的PCV2序列设计一对特异性引物,采用PCR方法,扩增PCV2 ORF2基因,将ORF2基因插入到含有EGFP报告基因的转移载体质粒pPI-2.EGFP,获得重组中间转移质粒pPI-2.EGFP-ORF2。采用脂质体介导法,将重组中间转移载体pPI-2.EGFP-ORF2与伪狂犬病毒SA215株基因组共转染真核ST细胞,通过空斑纯化得到了表达猪Ⅱ型圆环病毒ORF2基因和绿色荧光蛋白基因的重组伪狂犬病毒SA215(C)。经检测,重组病毒能表达具有生物活性的ORF2基因蛋白和绿色荧光蛋白。并且重组病毒及亲本株在同一细胞上的增殖滴度基本相同,表明EGFP和PCV2 ORF2基因的插入不影响PRV SA215的增殖。该重组病毒可作为猪Ⅱ型圆环病毒和伪狂犬病毒候选疫苗毒株。     

猪圆环病毒 2型 LAMP 诊断方法 的建立及初步应用

根据 GenBank 中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列,设计合成 2 对引物,通过对环介导等温,LAMP 扩 增条件的优化袁敏感性、特异性试验,成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAMP 诊断方法。 敏感性结果显示,建立的 LAMP 诊断方法最低核酸检测量为 0.30 pg/L袁而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/L曰特异性结果显示,猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95 份自然感染病猪样 品的检测结果表明,该 LAMP 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95.8%。 整个扩增反应可在 30 min 内完成,结 果肉眼可见,为猪圆环病毒 2 型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法,能够满足基层现场快速检疫的需要。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪传染性胃肠炎病毒SYBR-Green I荧光定量PCR检测方法,利用RT-PCR技术扩增出猪传染性胃肠炎病毒N基因中324 bp的片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,纯化的质粒作为模板进行SYBR Green I荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪传染性胃肠炎病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达5×101拷贝数.μL-1,与猪伪狂犬病毒、猪蓝耳病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床TGEVN基因的检测.     

猪圆环病毒Ⅱ型ZZ株ORF2基因的扩增、测序

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒（PCV-2）ORF2基因特异性引物,对郑州分离株（ZZ）猪圆环病毒PCV-2型的ORF2基因进行了扩增。经测序后,并在GeneBank注册。     

一种改良的猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]利用SYBR Green Ⅰ荧光染料建立一种快速、灵敏的用于检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法.[方法]根据猪圆环病毒2型ORF2保守区的基因片段,扩增目的基因645 bp插入至PUC57载体,以重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应条件优化及灵敏度、特异性等验证.[结果]建立的猪圆环病毒2型绝对定量检测方法与猪圆环病毒1型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪博卡病毒无交叉反应.检测猪圆环病毒2型的灵敏度是5.0×101 copies/μL,建立的标准曲线回归方程的相关系数0.999,扩增效率105.403％.[结论]成功建立一种特异性强、敏感性高、稳定性良好的绝对定量检测猪圆环病毒2型的荧光定量PCR方法,可以用于临床样品猪圆环病毒2型的检测.     

检测猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR方法的建立

针对猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2的序列设计两对特异性引物及TaqMan探针,以感PCV2的PK-15细胞培养上清的DNA提取物为模板,分别扩增499 bp和131 bp的片段,建立了检测PCV2的TaqMan荧光PCR方法。结果表明:TaqMan荧光PCR检测PCV2的最佳探针浓度为0.5 pmol·μL-1;TaqMan荧光PCR两步法操作快捷,扩增131 bp的引物PCF1101/PCR1232检测敏感性高(3.17×102拷贝·μL-1),重复性好。在诸多检测样品中,除检测到PCV2检测指标出现阳性外,猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV),日本乙型脑炎病毒(JEV),猪伪狂犬病毒(PRV),猪瘟病毒(CSFV)及PK-15细胞等检测指标均为阴性,表明特异性强;与普通PCR的检测结果(2/10)比较,本法的敏感性和对临床样品的阳性检出率(3/10)更高。上述研究表明,本方法快速、敏感、特异,具有很高的重复性,且可实时监测,能有效检测PCV2。     

猪圆环病毒和猪伪狂犬病毒混合感染的诊治

猪圆环病毒和猪伪狂犬病毒都是猪易感的病毒性传染病,猪圆环病毒是一种免疫抑制病毒,可以干扰疫苗的免疫效果,猪伪狂犬病毒主要引起猪发热和脑脊髓炎,各种年龄的猪都易感,感染猪有神经症状,出现转圈运动。猪圆环病毒和猪伪狂犬病毒混合感染的情况经常发生,2019年3月,灌云县同兴镇某猪场发生疾病,生猪表现为消瘦,共济失调等神经症状,经过临床和实验室诊断,确定为猪圆环病毒和猪伪狂犬病毒混合感染,经过积极治疗,疫情得到有效控制。     

Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒

选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测.     

SYBR Green I实时定量PCR方法检测2型猪圆环病毒

利用PCR技术扩增出2型猪圆环病毒(PCV)ORF2保守区基因107 bp片段,并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行荧光定量PCR,并绘制标准曲线。再以提取的PCV-2、PCV-1、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR检测。结果表明:建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与样本阈值循环数(Ct)值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2为0.997,Ct值为11.9~26.9。PCV-2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV-1、PPV和PRV均不能扩出。对32份健康猪和32份断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)可疑猪样品定量检测:健康猪阳性率为44%(14/32),病毒载量均小于104拷贝.μL-1;PMWS可疑猪阳性率96.8%(31/32),病毒载量均大于105拷贝.μL-1。实时荧光定量PCR方法可用于2型猪圆环病毒定性及定量的检测。     

猪伪狂犬病毒SYBR-GreenⅠ实时定量PCR检测方法的建立

利用PCR技术扩增出猪伪狂犬病毒gH基因中187 bp的片段,并克隆到pGEM T栽体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线.建立了猪伪狂犬病毒的荧光定量PCR检测方法.该方法检测灵敏度可达1.26×102拷贝·μL-1,与猪圆环病毒,猪细小病毒,猪繁殖与呼吸综合征病毒,猪瘟病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对15份疑似病料进行了检测.发现均为荧光定量PCR阳性,而常规PCR只能检测出6份阳性.结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRV感染的检测.     

2种猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立及比较

[目的]实现在体外对猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）的定量检测。[方法]设计合成2组特异性引物和 TaqMan探针,构建分别包含 PCV2 ORF1和 ORF2基因全长的重组质粒作为标准品,经过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,建立2种检测PCV2的分别基于 PCV2 ORF1和 ORF2的TaqMan荧光定量PCR方法。[结果]所建立的2条标准曲线的 Ct值与模板拷贝数的对数之间具有良好的线性关系,相关系数 R均在0.99以上,扩增效率均在90%~110%;重复性好,组内变异系数均小于5%;特异性强,以猪细小病毒（PPV）、猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）为模板时均无扩增;敏感性高,ORF1方法可达1.0×101 copies/μl,ORF2方法可达1.0×102 copies/μl。用建立的2种荧光定量PCR方法分别对80份临床样品进行检测并对结果进行比较,结果表明,其中72份临床样品的定量结果数量级基本一致,有8份临床样品的定量结果数量级不一致。利用 SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法对8份样品进行了检测,证明这8份样品中确实存在 P1的感染。[结论]基于ORF1建立的定量检测方法更为准确,可用于PCV2的快速诊断和定量检测。     

猪圆环病毒PCR实验报告研讨

根据猪圆环病毒2型（PCV-2）01KF1基因序列，设计并合成了一对特异性引物，以PCV-2为模板，建立了检测PCV-2的PCR方法。用本方法对猪细小病毒（PPV），猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRR-SV）及PK-15细胞进行同条件检测．均未有条带出现，结果均为阴性。表明该方法具有良好的特异性：敏感性试验表明，该方法能够检测到的最低DNA模板浓度为4．2pg；对保定、安新、定州、正定送检的四份临床样品进行检测。检测结果表明，四份临床样品均呈阳性。     

猪圆环病毒2型的PCR快速检测及其临床应用

根据GenBank中发表的猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)基因组序列,设计了2段特异性核苷酸引物.通过对已知PCV2和对照病毒(PCV1、伪狂犬病毒、猪细小病毒)的PCR扩增,证明所设计的引物可用于PCV2的特异性PCR检测.采集来自江苏扬州和泰州地区的157头份临床门诊病料(每头份均为脾脏和腹股沟淋巴结双份病料)进行PCR检测,发现仅从腹股沟淋巴结检出PCV2的占21.65%,仅从脾脏检出PCV2的占7.64%,从脾脏和淋巴结均可检出PCV2的占41.40%,其中扬州市地区感染率为73.47%,泰州地区感染率为66.10%.通过对扬州某屠宰场的32份腹股沟淋巴结的检测,结果表明临床健康猪的PCV2隐性感染率也高达71.88%.     

酵母双杂交筛选与杨树 Subgroup 4MYB 转录因子相互作用的蛋白质

根据 GenBank中的猪圆环病毒 2 型 ORF2 基因序列、设计合成 2对引物、通过对环介导等温（LAM P）扩 增条件的优化、敏感性、特异性试验、成功建立了猪圆环病毒 2 型 LAM P 诊断方法。 敏感性结果显示、建立的 LAM P 诊断方法最低核酸检测量为 0. 30 pg/ L、而 PCR 诊断方法最低核酸检测量为 30 pg/ L;特异性结果显示、猪圆环病毒 1 型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒的扩增结果均为阴性。 对 95份自然感染病猪样 品的检测结果表明、该 LAM P 方法检测结果与 PCR 检测结果符合率为 95. 8% 。 整个扩增反应可在 30 mi n内完成、结 果肉眼可见、为猪圆环病毒 2型的现场快速诊断提供了一种简便可行的方法、能够满足基层现场快速检疫的需要。     

猪乙型脑炎病毒SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立猪乙型脑炎病毒(JEV)的定量检测方法,根据E基因序列,设计1对特异性引物,建立检测JEV的荧光定量PCR方法。结果显示,该方法灵敏度达到10~3拷贝/μL,对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病毒(PRV)均无交叉反应,具有良好的特异性和重复性;采用JEV攻毒小鼠,荧光定量PCR比普通PCR更能灵敏地检出组织带毒量。该方法可用于组织样品中乙脑病毒的定量检测以及临床乙脑病毒感染的早期检测和定量分析猪乙脑病毒感染程度。     

猪圆环病毒2型ZZ株ORF1基因的扩增与测序

合成一对猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)ORF1基因特异性引物,对分离到的郑州分离株(ZZ株)猪圆环病毒PCV- 2型的ORF1基因进行了扩增,经测序后,对所测序列进行分析。结果显示,PCV-2 ORF1所表达的蛋白质具有良好的抗原性。     

猪肺炎支原体PCR检测方法的建立及初步临床应用

根据GenBank中猪肺炎支原体（Mhp）J株P36蛋白基因（登录号X67286）的核苷酸序列设计1对引物,建立了快速检测Mhp的PCR方法。该方法能扩增出948bp的Mhp特异性条带,其敏感性达到可检测出0．735ng的MhpDNA,但对鸡毒支原体、猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒均未检测出相应目的条带;将克隆获得的目的片段与GenBank已发表的MhpJ株的P36基因进行比较,同源性达到99．9％。采用所建立的PCR方法对42份疑似猪支原体肺炎（MPS）病料进行临床诊断,发现有13份呈阳性（31．0％）。可见,该PCR方法适合于MPS的临床诊断,可为其防控提供可靠依据。