胡杨(Populus euphratica)盐相关基因的克隆

以2年生胡杨实生苗为研究材料，通过用119mmol／L的NaCl溶液浇灌处理1h，分别收集NaCl处理前后的细嫩白根设立对照样品与处理样品，分离rnRNA。用抑制性扣除杂交技术建立胡杨盐处理的cDNA扣除文库，并以cDNA阵列杂交技术用。。P标记探针进行杂交，共筛选672个有效克隆，从中确认3个探针进行了序列分析，其中1个为盐抑制表达基因片段，2个为盐诱导表达基因片段。分析表明，1个盐诱导表达基因片段为1含188氨基酸开放阅读框的EST，该EST具有1079个核苷酸。该结果与我们早先检测到的1个胡杨盐诱导表达蛋白大小相符。     

马铃薯块茎低温反应抑制差减文库的构建及鉴定

本研究以4℃(Tester)和20℃(Driver)处理的马铃薯野生种Solanum berthaultii的无性系CW2-1块茎为材料,构建马铃薯块茎低温反应抑制差减文库以进一步筛选差异表达基因。通过PCR鉴定后,获得了含有2 112个阳性克隆的差减杂交文库。采用反向Northern方法对差减文库进行筛选鉴定,得到274个含有显著表达差异基因（P/N>3）的阳性克隆。从274个克隆中挑选了53个克隆进行测序和同源比对分析,合并后获得29个代表不同基因的非重复序列片段,表明文库具有较高质量。并随机选取了其中4个EST进行基因表达分析,结果显示,在耐低温糖化的S. berthaultii块茎中,4℃下贮藏的块茎基因表达强度高于20℃贮藏的块茎;同在4℃贮藏条件下,S. berthaultii和易低温糖化栽培种E1的块茎中基因的表达量亦存在差异,证明所构建的差减文库富集了马铃薯块茎对低温响应的基因。     

受PVY诱导的烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp的克隆与分析

【目的】通过筛选并克隆烟草抗马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)相关基因,分析其在不同诱导时间的相对表达量,揭示烟草抗病毒诱导的分子机理,以期为烟草抗病毒病育种奠定基础。【方法】通过抑制差减杂交和cDNA芯片从PVY诱导的抑制差减杂交文库中筛选上调表达(Ratio2)的基因中间片段,用RACE技术克隆其cDNA全长,并利用实时荧光定量PCR分析其在不同诱导时期的相对表达量。【结果】从受PVY诱导的烟草叶片中筛选一条595bp的基因中间片段并克隆得到一个全长为1770bp的天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp(GenBank登录号为GU144571),该基因编码506个氨基酸。多序列比对结果显示,该基因的编码产物与其它植物天冬氨酸蛋白酶家族成员具有高度的同源性,具有植物天冬氨酸蛋白酶典型的结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,Ntasp在PVY接种早期上调表达。【结论】克隆得到一个烟草天冬氨酸蛋白酶基因Ntasp,其表达受PVY侵染诱导。     

应用抑制差减杂交法分离玉米幼苗期叶片土壤干旱诱导的基因

 【目的】分离土壤干旱胁迫条件下玉米幼苗期叶片诱导表达的基因。【方法】本研究利用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）的方法，以耐旱自交系CN165为材料，构建了土壤干旱胁迫下玉米幼苗叶片的正向抑制差减cDNA文库。【结果】在这个文库中，随机挑取了672个阳性克隆，并进行PCR验证，对所有的单克隆进行了测序。得到了598个有效序列，经过EST聚类分析后，共得到了80个uniESTs。其中57个为contigs。23个为singlets。BLASTN的结果表明，所有的uniESTs都可以在玉米的核酸数据库中找到同源序列。BLASTX的结果表明：68个uniESTs和已知功能的蛋白有高度的相似性，8个uniESTs为未知功能蛋白和假定蛋白，4个uniESTs没有蛋白质的相似性。【结论】在这个cDNA文库中发现了大量抗旱相关的基因，这些基因涉及到植物代谢的多种途径。     

青稞抗黄矮病抑制差减文库的构建及差异表达基因的分离

本研究应用抑制差减杂交方法构建了感染黄矮病毒早期,高抗病和高感病青稞种质的差减cDNA文库,共获得了143个带有插入片断的克隆。以构建的抗黄矮病抑制羞减文库的62个片段为基础,对抗病青稞品种52号和感病青稞品种品引5号在感染黄矮病后24h的差异表达基因进行了杂交筛选,获得了9个差异表达的基因片段。对这些片段进行序列分析和同源对比,获得了5个抗性相关基因片段。片段U3,U24在感染后24h的抗性品系中表达增强,同时在EST序列比对中没有发现同源序列,可能为新的抗性相关基因。片段U58,U62为分别在抗性和感性品种中高表达的叶绿体相关基因。片段U23为多胺代谢通路相关基因。通过对这些基因片段的分析,对青稞感染黄矮病早期抗性的机制进行了初步的探索。     

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及鉴定

为筛选罗非鱼链球菌疫苗免疫前后白细胞表达变化基因及探讨鱼类白细胞免疫机理,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,以链球菌疫苗免疫前后罗非鱼白细胞cDNA为材料,构建了罗非鱼免疫前后正、负2个cDNA差减文库,并采用地高辛(DIG)标记差减文库cDNA作为探针,进行差异表达片段的筛选鉴定。结果显示:2个文库重组率均在90%以上,插入片段在300～900 bp,接头连接效率超过50%,差减效率非常高效,阳性率均超过70%。杂交筛选后正、负文库各挑选30个阳性克隆进行测序组装聚类,正、负文库各获得16和18条非冗余EST(unigene),所得序列经GenBank同源性分析,正、负文库各有10和11条unigene获得功能注释,且各有6和7条unigene没有同源性匹配,为未知新基因。     

金鱼头瘤形成相关基因差减文库的构建与分析

采用差减抑制杂交技术(SSH)以1龄红狮头金鱼(Carassius auratus)的头瘤组织为检测子(Tester),40日龄红狮头金鱼幼鱼的头顶上皮组织为驱动子(Driver),构建金鱼头瘤相关基因的差减cDNA文库。以鲫管家基因α-tubilin为参照检测差减效率,结果表明该文库差减效率达210倍,效率较高。随机挑选阳性克隆进行接头特异引物的PCR检测,结果表明插入片段均在0.1~2.0kb之间。利用斑点杂交对PCR检测结果为单一条带的阳性克隆进行筛选并测序,获得高差异性的有效序列93条。通过生物信息学方法对文库序列进行比对、分类和注释,发现若干结缔形成基因和原癌/抑癌基因等与金鱼头瘤形成相关的功能基因,表明cDNA文库构建成功。     

应用抑制消减杂交技术克隆鼻咽癌转移调控基因

目的：分离并鉴定高低转移表型不同的人鼻咽癌细胞株差异表达cDNA序列,了解鼻咽癌转移抑制基因或具有抑制活性的核苷酸序列。方法：以具有高低转移潜能不同的人鼻咽癌细胞株为研究对象,应用抑制消减杂交技术（suppression subtractive hybridization,SSH）和T／A克隆法构建差异表达cDNA消减文库,对差异表达的cDNA进行测序和生物信息学分析。结果：成功构建人鼻咽癌细胞克隆株差异表达cDNA消减文库,从随机测序10个克隆中获得6个在低转移鼻咽癌细胞株中高表达cDNA序列,它们都与已知的人类基因片段具有高度同源性。结论：应用抑制消减杂交技术,从一对具有高低转移表型差异的鼻咽癌细胞株中获得6条可能与肿瘤转移抑制相关的cDNA序列,它们可能在维持肿瘤细胞的稳定和抑制肿瘤转移中起重要作用。     

白粉菌诱导的中国野生毛葡萄抑制消减文库构建及EST序列分析

【目的】构建白粉菌诱导下中国野生毛葡萄"商-24"的抑制消减文库,获得抗白粉病差异表达基因EST序列。【方法】应用抑制消减杂交(Suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建白粉菌诱导下高抗白粉病的中国野生毛葡萄"商-24"叶片SSH-cDNA文库,通过生物信息学方法对文库中的EST序列进行分析。【结果】成功构建了白粉菌诱导的中国野生毛葡萄"商-24"抑制消减cDNA文库,对消减文库测序后获得了200个EST序列,大小为300～1000bp;BLAST分析表明,其中19个EST序列与已知功能基因序列同源性很高,分别参与了植物的防卫反应、胁迫反应、细胞解毒和信号转导等。【结论】获得了葡萄抗白粉病的EST序列,这为进一步克隆抗葡萄白粉病基因、探明其抗病分子机理奠定了基础。     

根癌农杆菌胁迫下多花蔷薇（Rosa multiflora'Inermis 4'）的基因表达分析

  多花蔷薇无刺4号（Rosa multiflora'Inermis 4'）对根癌病有较强抗性。以根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)接种多花蔷薇无刺4号为目的材料,刺伤处理为对照,采用抑制差减杂交（suppression subtractive hybridization,SSH）方法,构建了富集多花蔷薇根癌病抗性相关基因的差减cDNA文库。差异筛选差减cDNA文库后,随机选取增强表达的92个克隆进行测序,去除冗余的cDNA和病菌的基因片段,共得到53个单一序列。利用GenBank数据库进行核酸和蛋白质同源性比较,获得的cDNA片段功能涉及：细胞分裂、生长（22个克隆）,逆境防御、信号转导及激素调节（11个克隆）以及初生与次生代谢（10个克隆）。另有10个基因片段功能未知,可能为新的EST。根据测序及比对分析结果,对多花蔷薇无刺4号抗根癌病的分子机理进行了探讨。     

感染与未感染桃拉病毒凡纳宾对虾基因差异表达文库的构建

为了寻找对虾抗桃拉病毒(TSV)相关基因信息,研究对虾抗TSV分子机理。应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建TSV感染后存活凡纳宾对虾与未感染凡纳宾对虾的基因差异表达文库,并通过相对定量PCR以及斑点杂交分别对SSH的效率以及文库的可靠性进行验证。结果表明,SPR凡纳宾对虾和SPF凡纳宾对虾攻毒后的死亡率分别为12%和90%;在SSH系统中,相对于未进行杂交的cDNA样品,杂交后的cDNA样品的β-肌动蛋白(β-actin)几乎没有被检测出,说明SSH操作系统是高效率的。通过文库构建则获得正负2个文库,其中正库含阳性克隆1051个,负库含阳性克隆580个;而经斑点杂交验证,共获差异表达克隆321个,其中攻毒组高表达克隆270个,未攻毒组高表达克隆51个。可见,SPR凡纳宾对虾具有较强的抗TSV能力,以之为基础构建的对虾基因差异表达文库具有高度的可靠性,由文库得到的基因信息对获取对虾抗(TSV)相关基因具有潜在的应用价值。     

参与紫云英共生固氮的1个上调表达结瘤素基因AsB6的分离与鉴定

基于接种华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R的紫云英(Astragalus sinicusL.)感染根与未接种对照根在转录水平上的差异,利用抑制差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),建立了紫云英结瘤固氮过程中的差异表达cDNA文库,共获得527个有效克隆,其中增强或特异性表达的上调文库中包含341个克隆,抑制表达的下调文库包含186个克隆。对其中的1个上调表达cDNA克隆AsB6利用RACE(rapid amplification of cDNAends)方法获得了其基因全长序列,利用BLAST在线软件和GenBank,Gen-Bank EST和Tigr Porcine EST等数据库进行同源序列比较,表明AsB6与苜蓿的β-酮酯酰合成酶及依赖于SAM(S-adenosgl methiomine,S-腺苷蛋氨酸)的羧甲基转移酶具有66%的同源性,同时利用实时荧光定量PCR研究了该基因的时空表达特征。结果显示,接种根瘤菌7653R后,在紫云英感染根和根瘤中该基因的表达量显著增强,且在接种后根瘤形成早期和固氮中晚期表达...     

柔嫩艾美耳球虫抗马杜拉霉素、地克珠利虫株特异消减文库的构建

 以遗传背景一致的柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）敏感株孢子化卵囊为驱动组，马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊为试验组，利用抑制消减杂交（SSH）方法，通过两轮杂交和两次PCR分别构建了富含两个抗药株孢子化卵囊与敏感株孢子化卵囊之间差异表达基因的消减cDNA文库。随机从两个消减文库中分别挑取50个克隆，经PCR鉴定马杜拉霉素抗药株和地克珠利抗药株孢子化卵囊的消减文库重组率分别为96%和98%，差异基因片段大小分布在250 bp～1.0 kb之间。从每个文库中随机挑取65个阳性克隆经斑点杂交试验，分别选择表达量上调的6个克隆进行序列分析和同源性比较。结果发现，有4个cDNA片段可能是新基因片段，与地克珠利抗药株的产生有关；有3个新的cDNA片段可能与马杜拉霉素抗药株的产生有关。这些结果将为克隆全长cDNA和探索球虫抗药性产生及发展的分子机理奠定了一定的基础。     

油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因的初步分析

采用抑制性消减杂交技术,以甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1" 及野生型"3529"为材料构建与植株高矮性状关系最为密切的茎尖差异表达抑制消减cDNA文库.所建cDNA文库插入片段大小主要集中在100～500 bp之间.斑点杂交筛选得到30个阳性克隆,序列测定和同源性对比分析表明,所得克隆功能涉及到第二信使、转录因子、激素代谢、蛋白质降解及转运等多个方面.并对其中几个差异表达基因的功能进行了初步分析,为进一步认识油菜植株矮化机理奠定了基础.     

一种改进的固相扣除杂交法直接克隆全长差异表达基因

该文集多种分离差异表达基因方法的优点于一体,自行优化了一种基于固相扣除杂交和聚合酶链式反应(PCR)技术直接克隆全长差异表达基因的策略．该策略中的所有操作步骤,包括poly (A)+mRNA的分离,cDNA的合成和扣除杂交都是在磁珠上进行的,操作简单易行．扣除杂交是用结合在磁珠上的以oligo(dT)为引物合成的对照材料（Driver）的cDNA第一链,直接扣除加有接头的处理材料（Tester）cDNA第二链中的共有序列．多次反复使用Driver一链与Tester二链进行杂交,能有效去除Tester二链中的共有序列.磁珠的分离能最小限度地减少每次杂交造成的损失．最后一轮扣除后的Tester二链中,含有大量差异表达序列,用Tester二链特有的接头引物进行扩增,能进一步提高扣除效率．该文选用此扣除方法,成功分离到了低温驯化沙冬青幼苗和对照苗2个群体的18个差异表达克隆,其中有4个克隆是全长cDNA序列．经序列分析发现,这些基因都与低温相关,进一步说明,该方法可用于克隆未知差异表达基因．      

抑制性消减杂交技术及其在植物抗病性研究中的应用

在植物的不同生长、发育、繁殖阶段和不同类型细胞中,基因的表达各不相同。近几年发展起来的研究基因差异表达的方法很多,抑制消减杂交（Suppression Subtractive Hybridization）是其中一项基于转录水平,结合消减杂交与 PCR技术的分离差异表达基因的方法,其原理可概括为消减同源序列,富集差异序列。该技术报道于1996年,在一个循环过程中分离差异表达基因尤其是低丰度表达的基因,虽然存在一些缺点,但以其较高的灵敏性、容易操作、假阳性率低、重复性好等优点,在分离及其克隆差异表达基因研究方面得到了广泛的应用。近几年,此技术在植物抗病基因的诱导表达方面已得到了应用,目前大多数研究主要集中在文库构建及筛选等方面。文章对抑制性消减杂交（SSH）技术的原理、优缺点及其在植物抗病性研究机制中应用进展进行了综述。     

利用抑制消减杂交技术筛选猪蛔虫性别差异表达基因

 为了筛选线虫的性别特异性基因，为线虫乃至寄生虫的性别控制提供新的工具，本研究选择猪蛔虫（Ascaris suum）为模型，分别提取雌性和雄性成虫的mRNA后，采用Clontech公司的PCR-selectTM试剂盒进行反转录合成cDNA并进行抑制消减杂交（SSH），构建猪蛔虫雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库，并采用地高辛（DIG）标记的cDNA探针进行Southern 杂交检验所构建文库的消减效率。结果表明，雌、雄虫性别差异表达的消减cDNA文库均具有很强的性别特异性。随机从各库中各抽取25个克隆进行测序及在线BLAST分析，发现在25个雄虫ESTs中有20个已知ESTs，5个新的ESTs；25个雌虫ESTs中有11个已知ESTs，还有8个可能为新基因。猪蛔虫性别差异表达的消减cDNA文库的成功构建，为进一步研究性别特异基因的功能奠定了基础。     

抑制消减杂交技术在植物病害研究中的应用

抑制消减杂交技术以抑制性PCR技术和杂交二级动力学原理为基础,该技术具有高灵敏性、高效率、易操作等特点,是有效分离、克隆基因差异表达的方法之一。该文对其技术的原理、特点及其在植物寄生性线虫和植物抗病机制研究中的应用进行了综述。