禽致病性大肠杆菌luxS和rbsC双基因缺失株的构建及其生物特性分析

禽致病性大肠杆菌(APEC)能引起家禽严重的呼吸系统和全身性疾病,由于APEC耐药菌株的不断出现迫使新型抗菌方式的研发迫在眉睫。本研究旨在评价APEC的luxS和rbsC双缺失的突变株作为减毒疫苗候选株的潜力,通过在APEC分离株DE17的单基因缺失株DE17ΔluxS的基础上,利用Red重组系统构建双基因缺失株DE17ΔluxSΔrbsC,并对其生物学特性进行了分析。结果显示:rbsC的缺失不影响DE17ΔluxS的生长特性和生物被膜形成能力,但运动性显著降低;与DE17ΔluxS相比,DE17ΔluxSΔrbsC的黏附能力和入侵能力分别降至46.92%和28.78%;半数致死量(LD50)结果显示,毒力下降了115.5倍;肝脏、脾脏和血液中的载菌量分别下降了3.63倍、79.20倍和2124.41倍。根据以上结果推测,rbsC基因的缺失会进一步降低DE17ΔluxS的毒力,本文为评价DE17ΔluxSΔrbsC株减毒机制提供参考。     

微小隐孢子虫P23基因在毕赤酵母中的表达及初步应用

为将微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P23基因在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)系统中进行表达,利用表达蛋白初步建立隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,设计引物从微小隐孢子虫基因组DNA中扩增P23基因序列,构建pPIC9K-P23重组质粒,在毕赤酵母中进行表达,用阴离子交换层析柱进行纯化。以重组P23纯化蛋白为抗原建立间接ELISA检测方法,对现场采集的猪血清样品进行检测。SDS-PAGE显示所表达的蛋白大小约为23 kDa。Western blot检测表明该蛋白能与兔抗P23蛋白血清特异性结合。用建立的间接ELISA技术对186份猪血清样品进行检测,阳性率为83.3%。本研究获得了真核表达的P23重组蛋白,初步建立了微小隐孢子虫病间接ELISA诊断技术,为隐孢子虫病的诊断和流行病学调查打下了基础。     

隐孢子虫不同基因型P23基因的克隆及序列比较

为克隆隐孢子虫不同基因型子孢子表面抗原P23基因,比较其序列差异,提取上海地区分离的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidiummouse genotype)、隐孢子虫兔基因型(Cryptosporidiumrabbit geno-type)、隐孢子虫猪基因型Ⅱ(Cryptosporidiumpig genotypeⅡ)总RNA,经RT-PCR扩增P23基因,克隆到pMD18-T载体中,进行序列测定,并与GenBank上下载的微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)序列进行同源性比对。结果显示,从隐孢子虫3个基因型中均扩增出了P23基因。与微小隐孢子虫P23基因核苷酸序列比较,隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型ⅡP23基因同源性分别为97.6%、97.3%、97.3%,氨基酸序列同源性分别为97.3%、97.3%和96.4%。获得了隐孢子虫鼠基因型、兔基因型、猪基因型Ⅱ子孢子表面抗原P23基因。     

微小隐孢子虫CP15-P23-CP15/60基因的融合表达及抗血清的制备

以微小隐孢子虫基因组DNA为模板,PCR扩增获得子孢子表面抗原CP15、P23和CP15/60基因。利用重叠延伸PCR(SOE PCR)将该3段基因片段串联在一起,各基因片段之间引入柔性氨基酸接头(GGGGS)编码基因。将串联基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,构建重组表达载体,转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中进行诱导表达,将纯化的重组蛋白免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体。结果表明,获得了CP15-P23-CP15/60融合基因,并在大肠埃希菌中高效表达,Western blot显示重组蛋白能被牛抗微小隐孢子虫阳性血清识别,制备的多克隆抗体能被重组蛋白特异性识别,表明获得的重组蛋白具有较好的抗原性。     

仔猪日常饲养管理与健康管护

通过仔猪的生理特点就哺乳仔猪和断奶仔猪饲养管理与健康管护方面谈谈具体做法,还针对仔猪急病防治和饲养人员管理做了简单的介绍。     

异体皮肤移植法测定鸡细胞免疫

为了研究隐孢子虫感染对鸡细胞免疫功能的影响，设计了鸡异体皮肤移植试验。受试鸡为ＳＰＦ鸡，饲养于隔离器内。感染组１～３日龄感梁隐抱于虫，并于感染后４ｄ粪便检查隐孢子虫卵囊，证明感染成功。２０日龄时进行皮肤移植试验。手术切口在鸡腿内侧，盼关节下方。移植皮片不缝合，采用创可贴包扎固定。同体移植皮片９６％（２５／２６）被接受，异体移植皮片，对照组１００％（１３／１３）被排斥，而感染组５８．３％（７／１２）被排斥，从而建立了异体皮肤移植测定鸡细胞免疫的方法。     

柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)马杜拉霉素抗药株和敏感株孢子化卵囊的蛋白质差异分析

利用双向电泳技术,对本实验室诱导保存的柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株与敏感株的蛋白质表达图谱进行差异比较和分析,发现两者之间差异有4个蛋白质斑点,利用MALDI-TOF-TOF质谱技术对3个差异明显的蛋白质斑点进行分析鉴定,获得3个明确的肽质量指纹图谱,通过在NCBInr数据库中检索分析,确定了其中1种蛋白质为球虫子孢子表面抗原TA4.另外2种蛋白质与疟原虫的Pfj1和线粒体转运蛋白受体Tom40具有很高的同源性,上述蛋白的鉴定将对球虫的抗药性产生机理和柔嫩艾美耳球虫马杜拉霉素抗药株的分之标志物提供了研究方向.     

球虫抗药性检测方法评述

抗药性是药物预防鸡球虫病的主要障碍,鸡球虫抗药性的检测方法主要包括笼饲试验法(鸡体测定法)、鸡胚试验法、细胞培养法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、同工酶测定法、PCR测定法等,本文对上述各种检测方法及其判定标准进行了综述.     

五种药物抗鸡贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi)人工感染试验初步观察

作者分别用大蒜素(粉剂和乳剂,1000ppm、400ppm、200ppm)、乙酰螺旋霉素(200ppm)、速丹(3ppm)、对-氨基水杨酸(1000ppm)、水杨酸异戊酯(1000ppm)五种药物进行了三次抗鸡隐孢子虫人工感染试验.结果发现对-氨基水杨酸、水杨酸异戊酯、大蒜素可以明显地降低粪便卵囊排出量,防止临床症状的出现和死亡.乙酰螺旋霉素、速丹的效果不明显.     

哺乳类和鸟类动物隐孢子虫交叉感染试验研究

为了明确哺乳类和鸟类宿主隐孢子虫能否交叉感染，分别从鸡、兔、小白鼠、鸭、鹌鹑分离到隐孢子虫进行交叉感染。结果，从鸡分离的隐孢子虫卵囊能感染鸭、鹌鹑、麻雀，而不能感染鸽、大白鼠、小白鼠、兔，从鸭分离的卵囊能感染鸡，从兔、小白鼠分离的卵囊不能感染鸡、鹌鹑，从鹌鹑分离的卵囊不能感染兔、大白鼠、小白鼠和鸡。提示隐孢子虫在宿主纲水平上有宿主特异性。