铜胁迫下天蓝苜蓿根组织实时定量PCR内参基因的选择

豆科植物-根瘤菌共生体系因固氮能力卓越,肥土效应明显,常被作为先锋植物进行环境修复。利用qRT-PCR分析铜胁迫下天蓝苜蓿(Medicago lupulina L.)与根瘤菌(Sinorhizobium meliloti,CCNWSX0020)共生固氮过程中差异基因时,由于环境中铜离子差异可能使持家基因表达不稳定,因此需要筛选合适的持家基因作为内参。本研究选取8个天蓝苜蓿的持家基因(肌动蛋白(beta actin,ACT)、组蛋白(histone H2A,H2A)、核糖体蛋白18S(ribosomal 18S,18S)、微管蛋白(tubulin beta,TUB)、泛素连接酶(ubiquitin,UBI)、延伸因子1(elongation factor 1,EF1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和亲环蛋白(cyclophilin,CYP))作为候选内参基因,人工模拟不同水平铜(浓度分别为50、100、150和200 mg/kg)污染,以接种根瘤菌后30 d的天蓝苜蓿根为材料,筛选最佳内参基因。经引物特异性及PCR扩增效率检测,各候选内参基因引物均符合稳定性筛选要求。荧光定量PCR分析结果表明,8个候选内参基因的表达水平和稳定性随铜离子浓度不同而呈现差异。在线评估所有样品中候选内参基因表达稳定性,结合geNorm软件分析最佳内参基因组合数目,结果发现,最适内参基因组合为GAPDH和EF1;分别在线评估不同铜浓度处理下候选内参基因表达稳定性,结果表明,低浓度铜(≤50 mg/kg)处理下最佳内参基因为GAPDH,中高浓度铜(≥100 mg/kg)处理时最佳内参基因为UBI。本研究结果为铜胁迫下天蓝苜蓿共生结瘤过程中差异基因的表达分析提供了基础资料,同时为其他重金属胁迫下内参基因的筛选提供了参考和借鉴。     

光照强度对石斛生长与代谢的影响

在石斛分蘖期 ,于 2 5℃下分别设 80、 16 0、 32 0、 6 4 0 μmol·m- 2 ·s- 1光照处理 ,研究其对石斛生长与代谢的影响。结果表明 :低光照强度有利于株高和可溶性蛋白质含量的增加 ,但增重少 ,繁殖率低 ,代谢较弱 ;随光照强度的提高 ,光合能力递增 ,但呼吸消耗也随之加大 ;6 4 0 μmol·m- 2 ·s- 1的强光照破坏了叶绿素的形成 ,叶绿素含量较 16 0 μmol·m- 2 ·s- 1处理降低 17.7% ,可溶性蛋白质与总糖含量显著下降 ,分别比 32 0 μmol·m- 2 ·s- 1处理低 2 7%和15% ;CAT活性明显降低 ,MDA含量与POD活性则显著提高 ,表明出现光抑制。因此 ,石斛生长的光照强度以 32 0 μmol·m- 2 ·s- 1为宜。     

参与紫云英共生固氮的1个上调表达结瘤素基因AsB6的分离与鉴定

基于接种华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumhuakuii)7653R的紫云英(Astragalus sinicusL.)感染根与未接种对照根在转录水平上的差异,利用抑制差减杂交技术(suppression subtractive hybridization,SSH),建立了紫云英结瘤固氮过程中的差异表达cDNA文库,共获得527个有效克隆,其中增强或特异性表达的上调文库中包含341个克隆,抑制表达的下调文库包含186个克隆。对其中的1个上调表达cDNA克隆AsB6利用RACE(rapid amplification of cDNAends)方法获得了其基因全长序列,利用BLAST在线软件和GenBank,Gen-Bank EST和Tigr Porcine EST等数据库进行同源序列比较,表明AsB6与苜蓿的β-酮酯酰合成酶及依赖于SAM(S-adenosgl methiomine,S-腺苷蛋氨酸)的羧甲基转移酶具有66%的同源性,同时利用实时荧光定量PCR研究了该基因的时空表达特征。结果显示,接种根瘤菌7653R后,在紫云英感染根和根瘤中该基因的表达量显著增强,且在接种后根瘤形成早期和固氮中晚期表达...     

根瘤菌群体感应系统在共生结瘤过程中的功能

根瘤菌能够合成群体感应(quorum sensing,QS)信号分子——酰基高丝氨酸内酯(N-acyl homoserine lactone,AHL)类化合物,其在与豆科植物共生结瘤的过程中,以群体密度依赖的方式通过AHLs诱导相关基因的表达。目前,根瘤菌QS系统的研究结果主要来自根瘤菌属和中华根瘤菌属。不同根瘤菌中的QS系统明显不同,它们对共生过程的影响有很大区别。同时,寄主植物也能通过分泌AHLs类似物等方式介导根瘤菌QS系统的表达。本文在简要介绍革兰氏阴性菌群体感应系统的基础上,综述了不同根瘤菌群体感应系统的类型及其对共生结瘤的影响,以及豆科植物对群体感应系统的响应等方面的研究进展,并对当前根瘤菌与豆科植物共生互作早期QS系统功能研究中存在的问题及今后的研究方向进行了分析与展望。     

蓝细菌分离DnaE内含肽的自我剪接研究

【目的】证实蓝细菌Anabaenasp.PCC 7120复制酶中分离的DnaE内含肽的自我剪接活性。【方法】分别将AnabaenaPCC 7120中分离的2个dnaE基因的部分序列克隆到表达载体上,获得重组表达质粒,经超量表达和纯化后,免疫家兔获得相应的抗体;同时,两段分离的dnaE序列被克隆到同一表达载体,构建双重组表达质粒,两段序列具有各自的ORF,但由同一启动子调控。双重组表达质粒经诱导之后,利用以上获得的抗体对含有内含肽的DnaE蛋白在大肠杆菌表达体系中的自我剪接反应进行检测。【结果】在双重组表达质粒的表达产物中,抗体不仅可以分别与对应的蛋白质反应,而且还可以同时识别1条新条带,该条带的表观分子量与成熟DnaE的理论值大致相符。【结论】蓝细菌分离的DnaE内含肽在大肠杆菌表达体系中可以进行自我剪接;本研究中获得的抗体具有较好的特异性,无明显背景干扰,而且效价高,抗体可以稀释1 000倍以上使用,也可以用于相关方面的研究。