利用正交设计优化桃SRAP-PCR反应体系

以桃基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mg2+、Taq酶、dNTP、引物、模板5种因素4个水平对桃SRAP反应体系进行优化,建立了适合于桃的SRAP-PCR优化反应体系,该25μL反应体系:模板DNA50 ng,MgCl22.5 mmol/L,dNTP200μmol/L,上下引物各0.4μmol/L,Taq DNA聚合酶1.5 U,以灭菌双蒸水补齐至25μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,50℃复性1 min,72℃延伸1 min,35个循环,72℃延伸10 min。     

黄芪SRAP反应体系优化

以黄芪为材料,对黄芪SRAP反应体系进行优化.黄芪最佳SRAP反应体系为,在20 μl反应体积中含:模板DNA 15 ng,引物0.2 μmol/L,dNTP 200 μmol/L,MgCl2 2 mmol/L,Taq DNA聚合酶 1 U,1×Buffer;反应程序为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环;最后72 ℃延伸5 min.     

大白菜SRAP反应体系的建立与优化

以大白菜基因组DNA为模板,通过正交试验设计,从Mgz^2＋、Taq酶、dNTPs、引物、模板5种因素4个水平对大白菜SRAP（Sequence-related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性）反应体系进行优化,建立了适合于大白菜的SRAP-PCR优化反应体系,该体系为25 μL：Mg^2＋浓度为3.0 mmol/L,dNTPs为0.2 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物为0.2 μmol/L,模板DNA73.2 ng.PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min,35 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,5个循环;94 ℃变性1 min,50 ℃复性1 min,72 ℃延伸1 min,35个循环,72 ℃延伸10 min.     

白桦SRAP反应体系的建立与优化

以白桦(Betula platyphlla Suk)基因组DNA为模板,利用趋势面设计对白桦SRAP-PCR反应体系的5个因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物P)在3个水平上进行优化试验,筛选出各反应因素的最佳水平,建立了白桦SRAP-PCR反应的最佳体系。该反应体系为20μL:0.21g/LDNA,1.5μL;25mmol/LMg2+,1.4μL;5U/μLTaq酶,0.25μL;2.5mmol/L,2μL;10μm/L引物,0.35μL。PCR反应程序为:94℃预变性5min,94℃变性1min,35℃复性1min,72℃延伸1min,5个循环;94℃变性1min,50℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环,72℃延伸7min。     

花生基因组SRAP-PCR体系的优化

【研究目的】研究花生基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系;【方法】对模板DNA、引物、dNTP mixture、Taq DNA聚合酶浓度及退火温度设置不同梯度,研究各因素对PCR结果的影响;【结果】扩增程序为:94℃变性2min,1Cycle;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,40Cycles;72℃延伸7min。反应体系成份为:DNA模板80ng,左右引物各200ng,dNTP mixture2.0mmol/L,Taq DNA聚合酶3U,10×Buffer8μl,总体积60μl。【结论】建立了满足花生基因组SRAP-PCR的优化扩增体系。     

兜兰ITS-PCR反应体系的建立及优化

为优化兜兰ITS-PCR反应体系,以兜兰属植物为试材,用改进的CTAB法提取总DNA,并采用单因子试验设计,对影响兜兰DNA ITS-PCR扩增反应的主要因素即Taq DNA聚合酶的用量、Mg2-浓度、dNTP浓度、引物退火温度、模板DNA用量和引物浓度等进行优化研究,建立兜兰最佳ITS扩增反应体系.结果表明:最佳反应体系为25 μL体系中,添加10×PCR buffer 2.5 μL、Taq DNA酶1.25U、Mg2+ 1.5mmol/L、dNTP 0.15 mmol/L、引物0.6μmol/L和模板DNA 40 ng,反应程序为94℃预变性4 min,1个循环;94℃变性30 s,54℃退火45 s,72℃延伸1 min,35个循环;72℃延伸7 min后终止反应,4℃保存.利用此反应体系可得到预期大小的ITS基因片段.     

西瓜SRAP-PCR程序和体系优化

建立适宜西瓜DNA的SRAP-PCR扩增体系,为西瓜基因图谱的构建和分子标记打下基础。以西瓜中华拳王品种为试验材料,探索了西瓜SRAP-PCR反应程序,并对西瓜SRAP-PCR反应体系的各影响因子进行梯度实验,筛选和建立可扩增多态性高、重复性好、带型清晰的最佳SRAP-PCR反应程序和体系。最佳SRAP-PCR反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃退火1 min,72℃延伸1min,共5个循环;94℃变性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸5 min;4℃保存。最佳SRAP-PCR反应体系(15μl)为:DNA 100 ng,dNTPs 0.3 mmol/L,Mg2+2.0 mmol/L,primer 7.5 pmol/L,Taq polymerase 0.75 U。该程序和体系能很好地满足西瓜基因组SRAP扩增的要求,SRAP标记应用于西瓜遗传研究是可行的。     

巴东木莲DNA的提取及SRAP-PCR反应体系的正交优化

研究确定了提取巴东木莲基因组DNA的方法,采用正交试验设计法对影响SRAP-PCR反应的引物浓度、Taq DNA聚合酶的用量、Mg2 和dNTPs浓度及PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了比较、优化.同时对DNA模板浓度进行了筛选.结果表明,Mg2 、dNTPs、Taq酶及引物的不同水平均对PCR反应结果有显著的影响.建立了巴东木莲20μL SRAP-PCR的反应体系为lxbuffer、Mg2 浓度为2.O mmol.L-1、dNTPs浓度为O.25 mmol·L-1、引物浓度为0.45μmol·L-1、Taq酶为0.5 U和模板DNA 40ng.适宜的扩增程序为94℃预变性1 min,94℃变性1 min,33℃复性1 min,72℃延伸1 min,10个循环;94℃变性1 min.55℃复性l min,72℃延伸1 rain,30个循环;最后72℃延伸5min.试验表明,该体系重复性好、稳定性强.     

山杏RAPD反应体系条件的优化

以山杏新鲜叶片为材料,研究了山杏RAPD分析过程中的影响因素,包括Taq酶、Mg2 、dNTP、引物、模板DNA浓度、变性时间、循环次数等,建立了适合山杏RAPD反应的PCR体系,即20μl反应体系中含有Taq酶1.0U、Mg2 2.0mM,四种dNTP各0.1mM,引物0.5μM,模板DNA50ng。扩增程序为:94℃预变性4mins;94℃变性1min,36℃退火1min,72℃延伸1.5mins,10个循环;94℃变性30s,36℃退火40s,72℃延伸60s,30个循环;最后72℃延伸5min。     

人参SRAP-PCR体系优化条件的建立（摘要）

[目的]研究人参基因组SRAP-PCR的扩增条件,建立其优化扩增体系。[方法]采用单因子实验方法探讨模板DNA、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2＋浓度等因素对PCR结果的影响。[结果]优化后的扩增程序为：94℃预变性2min;94℃变性30s,48℃复性30s,72℃延伸1min,共40次循环;72℃延伸7min。最佳反应体系为：DNA模板30ng,上下游引物浓度2.0μmol/L,dNTP浓度0.3mmol/L,Mg^2＋2.5mmol/L,总体积25μl。[结论]建立了满足人参SRAP-PCR的优化扩增体系,为人参亲缘关系和遗传多样性SRAP分析提供快速、简便、重复性好的实验方法。     

均匀设计优化猕猴桃SRAP体系

采用均匀设计对影响猕猴桃SRAP-PCR体系的5种因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA)进行5因素5水平和5因素3水平的两轮优化,建立猕猴桃SRAP-PCR的最佳体系(25μL):Mg2+2.50 mmol·L-1,dNTPs 0.25 mmol·L-1,引物0.2μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.25 U,模板DNA 150 ng.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性1 min,35℃复性1 min,72℃延伸1 min,5个循环;94℃变性1 min,53℃复性1 min,72℃延伸1 min,33个循环,72℃延伸10 min.     

黄麻DNA提取与RAPD反应体系的建立

以假黄麻、假长果、越南圆果 (圆果种黄麻 )等为材料 ,研究了黄麻 DNA的提取方法以及对 RAPD分析的影响因素 ,包括模板浓度、Mg2 + 、d NTP、引物和 Taq酶等 ,建立了适于黄麻种质 RAPD分析的 PCR反应体系 .即在 2 5μL反应体积中 ,Tris- HCl(p H8.0 )、KCl、Mg Cl2 、d NTP、随机引物的浓度分别为 10 mmol· L-1、5 0mmol·L-1、2 .5 mmol· L-1、15 0 μmol· L-1、0 .2 μmol· L-1,并含有 30 - 60 ng DNA与 1.5 U Taq DNA聚合酶 .扩增程序为 :94℃预变性 5 min;然后 94℃ 30 s,37℃ 1.5 min,72℃ 1min,4 1个循环 ;最后 72℃延伸 7mi     

黄瓜霜霉菌ITS区序列分析反应体系的构建及优化

文章以黄瓜霜霉菌为材料,采用改良的CTAB方法提取基因组DNA,研究了黄瓜霜霉菌ITS区序列分析中PCR反应体系的各主要成分对检测结果的影响,确立了适宜的退火温度和反应体系。优化后的反应体系(25μL)为:采用引物ITS1/ITS4各40 ng,60 ng DNA模板,2.5 mmol·L-1 Mg2+2.0μL,2.5 mmol·L-1 dNTP 1.5μL,Taq酶1 U。优化的PCR扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃50 s,52.2℃40 s,72℃1.5 min。在这一条件下运行35个循环;72℃延伸7 min。采用此反应体系和扩增程序,对采自黑龙江省不同地区的31份黄瓜霜霉菌基因组DNA进行PCR扩增,均可得到一条约为900 bp的条带。     

万寿菊SS-PCR反应体系的优化

实验材料为色素万寿菊雄性不育两用系'9901AB',通过对SSR-PCR反应体系中的主要因素dNTPs、引物及模板DNA进行最优条件筛选,建立了适合于万寿菊雄性不育两用系的SSRPCR反应体系:2.5μL 10×buffer、40 ng模板DNA、2μL 10μmol·μL1引物、1.0 U Taq酶、1.2μL2.5...     

南瓜SRAP反应体系的建立与优化

以‘密本’南瓜作为筛选体系的材料,通过单因素试验对南瓜20μL SRAP-PCR扩增体系的Mg^2＋、dNTP、 Taq酶、引物及DNA浓度和扩增程序的退火温度与循环次数进行优化,筛选出各组分的最佳浓度、最佳的退火温度和最佳循环次数。试验结果确立南瓜最佳的20μL SRAP体系为：0.2 mmol · L ^-1 dNTP ,1.5 U Taq酶,80 ng DNA ,0.16μmol·L^ -1的单条引物,Mg^2＋1.5 mmol·L^ -1,2μL 10＆#215;Buffer ;最佳扩增程序为：94℃预变性5min;94℃1 min ,35℃1 min ,72℃1 min ,5个循环;94℃1 min ,52℃1 min ,72℃1 min 35个循环;最后72℃延伸10 min。选用17个南瓜品种对确立扩增体系及扩增程序进行验证,检测结果表现为扩增产物条带清晰明亮、多态性丰富、特异性强、重复性好,表明本试验所确定的反应体系及反应程序适用于南瓜的SRAP分子标记。     

山核桃SRAP体系的建立及与RAPD和ISSR标记的比较

以山核桃Carya cathayensis基因组DNA为模板,对聚合酶链式反应（PCR）体系各组分进行了梯度实验,优化出条带清晰、重复性好的相关序列扩增多态性聚合酶链式反应（SRAP-PCR）扩增体系,并筛选了引物。该体系（25.00 μL）为：1 × 缓冲液0.20 mmol·L^－1,脱氧核糖核苷酸（dNTPs）,0.20 μmol·L^－1 引物,2.00 mmol·L^－1镁离子（Mg²⁺）,33.34 nkat Taq DNA 聚合酶,0.80 mg·L^－1基因组DNA（以上均为终浓度）。反应条件为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s,35 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,5个循环;94 ℃变性30 s,50 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,30个循环;72 ℃延伸8 min,4 ℃保存,反应时间比其他体系缩短了一半。从100对引物中筛选出了适用于山核桃的引物15对。在山核桃中,随机扩增多态性DNA（RAPD）,简单序列重复区间（ISSR）,SRAP等3种标记,以SRAP标记每对引物扩增的位点数及每对引物扩增的多态性位点数为多,但SRAP多态性引物的比例、多态性位点比例居于另2种标记之间。在山核桃研究中可以考虑使用SRAP及RAPD标记。图6表4参28     

新疆野苹果SSR-PCR 反应体系的优化

以4个新疆野苹果株系为试材,利用CTAB法提取DNA,对影响SSR-PCR扩增结果的主要因子设计了多梯度的优化试验。结果表明:新疆野苹果SSR-PCR反应体系(25μL)中含Taq DNA聚合酶0.5 U、模板DNA 5.0 ng、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2+1.0 mmol/L、退火温度为60℃时效果最佳。最佳扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,65℃退火1 min,72℃延伸1 min,4个循环;94℃变性30 s,60℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。利用此反应体系对30份新疆野苹果进行SSR-PCR扩增和电泳检测,扩增谱带清晰且多态性较好,表明该体系适用于新疆野苹果的基因连锁图谱构建和QTL定位。     

香榧ISSR-PCR扩增条件的优化和引物筛选

以香榧Torreya grandis ‘Merrillii’基因组DNA为材料,对影响简单序列重复区间扩增?鄄聚合酶链式反应（ISSR-PCR）的Taq酶用量、Mg²⁺浓度、模板DNA用量、磷酸碱基脱氧核苷酸（dNTPs）浓度和引物浓度等进行了优化试验。优化后的香榧ISSR-PCR扩增体系为：总容积20 μL,包括30 ng模板DNA,16.67 nkat Taq酶,0.350 μmol·L -1引物,1.625 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.250 mmol·L^-1 dNTPs,10 × PCR buffer 2 μL。PCR扩增程序：94 ℃变性5.0 min;35个循环：94 ℃变性30 s,退火45 s,退火温度视引物而定,72 ℃延伸1.5 min;最后72 ℃延伸7.0 min,4 ℃保温。在此基础上,从77个ISSR引物中筛选出34个适合香榧ISSR分析的引物,且通过梯度PCR确定了各自最适的退火温度。研究结果为香榧遗传图谱构建打下了基础。图4表1参12