传染性法氏囊病毒VP_2在酵母细胞内的高效表达及其免疫原性研究

 应用Pichia酵母表达系统高效表达了传染性法氏囊病毒 (IBDV)VP2 基因片段。首先用OLIGO设计 1对引物P5、P6 ,以插入IBDVVP2 基因的 pUC19为模板 ,扩增出带有终止密码子的 1.5kb片段 ,将此片段正向亚克隆到 pPICZA表达载体上 ,将构建好的载体pPICVP2 用SacI内切酶线性化后 ,转染酵母PichiapastorisGS115细胞 ,经PCR鉴定 ,筛选出 5 0多个重组子。分别用甲醇诱导后 ,经SDS PAGE凝胶电泳、琼脂扩散试验、Dot ELISA检测 ,得到 9个不同程度表达 4 1kuVP2 活性蛋白的阳性重组子。经凝胶薄层扫描仪分析 ,表达蛋白占酵母细胞总蛋白的最高比率为 16 % ,表达量为 0 .6 2 0 8g·L-1。表达产物免疫SPF鸡可诱导产生特异性抗体 ,并能保护鸡抵抗超强毒致死性攻击 ,具有良好的免疫原性。     

固始鸡白细胞介素2基因的克隆、表达及其表达蛋白活性的检测

参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明,表达蛋白主要以包涵体的形式存在,表达蛋白分子质量约为18 ku;目的蛋白表达量占总量的18％。体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性。     

猪γ干扰素的基因克隆、改造、表达及活性测定

提取经ConA诱导培养的猪外周血白细胞总RNA ,RT -PCR扩增出猪IFN -γ基因并克隆到pGEM -T -easy载体 ,测序结果表明扩增片段是含有信号肽的猪IFN -γ的完整基因。设计 1对引物亚克隆猪IFN -γ成熟蛋白基因并对其5′端前 2个稀有密码子进行大肠杆菌偏嗜性改造。经测序鉴定后插入原核表达载体pRLC ,并实现在大肠杆菌中的高效表达。表达产物以包涵体形式存在 ,经 7mol·L-1盐酸胍的变性液溶解及 0 5mol·L-1盐酸胍复性液复性处理 ,表达产物进行脱盐、凝胶层析纯化。细胞病变抑制法测定结果表明 ,重组猪IFN -γ具有较高的干扰素活性 ,约为 4 5× 10 6U·mg-1。     

鸡 PD 1胞外区基因的克隆表达及其蛋白生物学活性鉴定

为研究鸡程序性细胞死亡因子1（PD 1）胞外区的生物学活性,根据 GenBank 中的鸡 PD 1基因序列,经生物信息学比对分析,设计鸡 PD 1胞外区特异性克隆引物,扩增目的基因,连接原核表达载体 pET 28a（＋）,构建重组表达载体 pET 28a PD 1,转化至 Rosetta（DE3）大肠杆菌,并对IPTG 浓度、诱导温度、诱导时间进行优化,对表达产物进行 SDS PAGE 和 Western blot 分析,应用流式细胞术对所获得重组蛋白的生物学活性进行鉴定。结果显示,成功克隆了鸡 PD 1胞外区基因;SDS PAGE 和 Western blot 分析结果表明,37℃、0．1 mmol/L IPTG 诱导4 h 时,PD 1胞外区融合蛋白表达量最高,以包涵体形式存在;流式细胞术分析结果表明,PD 1胞外区重组蛋白具有一定的生物学活性。     

鸡催乳素受体胞外域的分子克隆及原核表达

根据家鸡催乳素受体基因胞外域序列（GenBank号：D13154）设计并合成1对覆盖编码区58～1249位核苷酸的引物，以家鸡垂体总RNA为模板，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片断，将该片断克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌Ecoli DH5α永久保存．通过设计第2对引物扩增PRLR胞外域cDNA片段，该片段经酶切后克隆到表达载体pRSETA的EcoRⅠ和HindⅢ两酶切位点之间，构建重组质粒pR-PRLR．该质粒在转化感受态细菌E．coli B121（DF．3）后，在IPTG诱导下促使重组菌表达了相对分子质量为53640左右的重组融合蛋白，表达量在0．1mmol／L IPTG诱导5h时达到最高，约占总菌体蛋白的17．6％左右．表达产物可经体积分数为50％的Ni-NTA凝胶纯化，说明重组蛋白中具有正确的His-tag标签及之后的鸡催乳素受体编码区胞外域序列．     

慢性髓性白血病bcr-abl融合基因的克隆与表达

以慢性髓性白血病K562细胞总RNA为模板,采用RT PCR技术扩增包含bcr abl融合位点周围的基因片段,定向克隆到pGEX 6P 1载体谷光甘肽S转移酶(GST)的下游。将重组质粒转化大肠杆菌BL21菌株,以1.0mmol·L-1IPTG诱导bcr abl融合基因片段的表达,其产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定,结果证实该融合蛋白分子质量约42ku。用该表达产物免疫ICR小鼠,所制备的抗血清可与K562细胞中特异性抗原反应,表明该bcr abl/GST融合蛋白具有bcr abl基因产物的特异抗原性。     

新疆卡拉库尔羊Fas基因原核表达载体的构建及表达

根据GenBank的羊Fas细胞凋亡因子序列设计1对特异性引物，将EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点引入到引物两端，同时加上保护性碱基。利用RT-PCR技术，从新疆卡拉库尔羊外周血淋巴细胞总RNA中扩增出特异性基因片段。将分离纯化后的PCR产物与pMD-18T载体进行连接，利用双酶切反应与菌液PCR对阳性重组克隆进行鉴定筛选，然后进行序列测定。使用原核表达载体pET28a来完成Fas的定向克隆，成功构建重组融合表达质粒pET-28a-Fas，然后将质粒转化至E.coli BL21感受态，设置不同IPTG浓度和诱导温度，选择最佳的表达条件，然后初步纯化重组融合蛋白。结果表明，在pET28a表达载体中，Fas基因的插入方向和读码框均正确；同时Fas基因也完成在E.coli BL21融合表达的目的，融合蛋白分子质量为39.7 ku。     

鸭leptin基因在大肠杆菌中的融合表达及生物学活性分析

 【目的】研究鸭leptin在体外高效表达特点，探讨表达产物的生物学活性及其功能。【方法】构建重组鸭leptin基因原核表达菌株，重组菌株经不同浓度IPTG和不同时间诱导后，对表达蛋白进行提取、纯化、复性和浓缩，经注射昆明小鼠后，对小鼠的体重﹑采食量和体脂含量进行分析。【结果】鸭leptin在大肠杆菌中实现了高效特异性融合表达，融合蛋白分子量约为20 kD，其中16 kD为鸭leptin基因表达产物，目的蛋白在0.2 mmol•L-1 IPTG的诱导下，表达量最高约占菌体总蛋白的57%。重组蛋白纯化﹑复性﹑浓缩后，能够明显降低小鼠摄食量、体重和体脂含量。【结论】鸭leptin基因在大肠杆菌中进行了高效融合表达，表达产物具有明显的生物学活性。     

鸡β- 防御素7 的克隆及表达

以NCBI已登录的鸡β-防御素7(登录号:NM_001001194)为模板,设计特异性引物,扩增鸡β-防御素7基因,目的基因与pET32a载体相连,构建表达质粒并导入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达和抗菌试验。结果表明,PCR扩增的目的片段,经测序证明与鸡β-防御素7基因NM_001001194序列同源性达99%,经IPTG诱导表达的重组蛋白与预期大小相符。平板抑菌试验结果表明,该重组多肽对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌活性。     

鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。     

Ⅰ群禽腺病毒100K蛋白主要抗原区基因片段的表达及鉴定

利用PCR技术对Ⅰ群禽腺病毒(FAVⅠ)100K蛋白主要抗原区片段进行扩增,得到约1062bp的基因片段;将其克隆到原核表达载体pGEX-4T-1,经测序及序列分析确证其正确插入到表达载体,成功构建重组表达载体pGEX-100K。重组质粒转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达,对表达的蛋白用SDS-PAGE电泳和Western-blot分析。结果表明,100K蛋白主要抗原区基因片段得到良好的表达,表达的蛋白以可溶形式存在,分子质量约为64.5ku,与预测值相符;表达的100K蛋白与FAVⅠ阳性血清发生特异性结合,具有良好的反应原性,为FAVⅠ诊断试剂盒的研制奠定基础。     

梭鱼白细胞介素-22原核表达及活性蛋白的制备

根据梭鱼IL-22cDNA序列设计特异性引物,从梭鱼脾脏中扩增IL-22用于表达片段,连接至载体pUC57。分别以BamHⅠ和KpnⅠ对含有目的基因的质粒和pQE-30进行酶切,连接并转化到大肠杆菌M15中,以IPTG进行诱导表达。表达产物通过Ni-NTA亲和层析进行纯化。经SDS-PAGE对表达产物进行鉴定。SDS-PAGE显示该IL-22表达质粒经IPTG诱导后,IL-22重组蛋白主要在菌体培养上清中表达。通过优化蛋白表达及纯化方法,成功获得了梭鱼IL-22活性蛋白。     

人肥胖基因大肠杆菌表达载体的构建及其诱导表达

通过设计1对PCR引物（上游引物,5-′GCCATATGGTGCCGATCCAAAAAG-3′,下游引物,5-′GAGAATTCCCTTCAAGGCCTCAG-3′）,采用PCR方法扩增出人肥胖基因编码成熟肽的核苷酸序列,将扩增产物从琼脂糖凝胶上回收后插入测序载体pMD-18-T后进行了核苷酸序列测定。将经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的扩增产物插入经EcoRⅠ和NdeⅠ双酶切后的大肠杆菌表达载体pET-28a（＋）,构建了可在大肠杆菌中高效表达人瘦蛋白的表达载体。将表达载体转化入大肠杆菌菌株BL21,经IPTG诱导后进行SDS-PAGE检测,结果表明构建的人肥胖基因表达载体得到高效表达,重组蛋白占到菌体总蛋白的31.2%。     

牛蛙皮肤抗菌肽Ranalexin 基因的原核表达及其抑菌活性

    为了验证重组抗菌肽Ranalexin的抑菌活性,提取牛蛙皮肤组织总RNA,经RT-PCR 扩增抗菌肽基因ranalexin,克隆测序后,将该基因插入pGEX-3X融合表达载体,进行原核表达,通过改变IPTG剂量、培养液pH值、诱导表达温度和诱导时间优化表达条件,并采用谷胱甘肽氧化/还原系统对重组蛋白进行复性,用琼脂扩散法测定其体外抑菌活性.结果显示,扩增获得的牛蛙皮肤抗菌肽基因ranalexin 大小为201 bp,其序列与GenBank公布序列同源性达99.57%;正确构建了pGEX-3X-Ranalexin表达载体,最佳表达条件为IPTG终浓度1.0 mmol·L-1、诱导时间5～6 h;表达产物的分子质量约为34 kDa,并以包涵体的形式表达,经复性纯化后该重组蛋白对金黄色葡萄球菌具有明显的体外抑菌活性.说明牛蛙皮肤抗菌肽基因ranalexin 的原核表达载体构建成功,并获得了具有抑菌活性的重组抗菌肽GST-Ranalexin.     

猪胸膜肺炎放线杆菌结构蛋白基因ApxIVA特异性片段的表达和纯化

以猪胸膜肺炎放线杆菌的血清8型分离株Hpn-405株基因组DNA为模板,PCR方法扩增ApxIVA特异性片段,PCR产物经纯化后与载体pMD18-T进行连接、转化,经酶切及序列分析鉴定后,亚克隆到原核表达载体pET-28a中,构建成重组表达质粒pET-ApxIVA3,转入到大肠埃希氏菌BL21(DE3)中,以IPTG进行诱导重组蛋白的表达,SDS-PAGE检测结果显示,表达的融合蛋白分子质量约为18 ku,与预期片段大小相符;将经过超声破碎的菌液离心取沉淀经尿素洗涤溶解后用镍金属螯合层析柱进行纯化。Western-blot分析证实,该融合蛋白具有免疫学活性。     

小鼠Rig-Ⅰ蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备

【目的】进一步研究小鼠维甲酸诱导基因Ⅰ(Rig-Ⅰ)蛋白的细胞信号传导、结构与功能。【方法】利用已经构建好的逆转录病毒载体MigRI-Rig-Ⅰ,用PCR方法扩增出小鼠Rig-Ⅰ基因氨基端100 bp长度的片断(Rig-Ⅰ-N),将此片段定向克隆到原核表达载体pGEX-4T2中,构建pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N,再将Rig-Ⅰ基因剩余部分克隆到已构建有Rig-Ⅰ-N部分片段的pGEX-4T2-Rig-Ⅰ-N中,构建融合表达载体pGEX-4T2-Rig-Ⅰ,将其转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,对表达产物GST-Rig-Ⅰ融合蛋白进行纯化,制备抗体,并对抗体效价进行ELISA检测及抗体特异性的Western blot分析。【结果】重组蛋白GST-Rig-Ⅰ能在大肠杆菌中表达,表达的融合蛋白GST-Rig-Ⅰ纯化和洗脱后分子质量为130 ku,纯度>90%,制备的抗体效价达到1∶625 000,并且能够识别在原核表达系统以及真核细胞内表达的小鼠Rig-Ⅰ蛋白。【结论】建立的表达系统能够表达重组蛋白GST-Rig-Ⅰ,制备的抗体具有良好的免疫特异性。     

鳗鲡病原菌外膜蛋白三联表达载体的构建、表达与表达产物的纯化

为研制能同时预防鳗鲡3种常见病原菌感染的三联外膜蛋白疫苗,分别选择创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白的ompU、ompA和omp porinП基因,设计特异性引物后分别扩增基因中表达外膜蛋白膜外区域且抗原决定簇丰富的3个基因片段并通过融合PCR技术进行连接。根据表达载体(pGEX-2T-his)的限制性酶切位点,在连接片段的两端引入BamHⅠ和EcoRⅠ两个酶切位点,将3个外膜蛋白基因片段与质粒连接后成功构建了重组表达载体。重组表达载体成功转化大肠杆菌(E.coli BL21)后,当菌液浓度(D600nm)为0.8时加入0.25mmol/L IPTG,16℃培养过夜后得到了高效表达。表达产物用镍柱进行洗脱纯化后经梯度尿素复性获得了分子质量约85ku的高纯度蛋白。     

鸡MyoG基因在成纤维细胞中的表达

利用分子克隆技术,通过RT-PCR反映扩增、克隆、测序含有Eco RⅠ/XhoⅠ酶切位点的MyoG片段,构建真核荧光表达载体pEGFP-N1-MyoG,并通过脂质体瞬时转染鸡成纤维细胞,对表达产物进行RT-PCR和SDS-PAGE鉴定。结果表明,经脂质体介导重组体pEGFP-N1-MyoG可成功转染鸡成纤维细胞,RT-PCR和SDS-PAGE电泳证实pEGFP-N1-MyoG可在鸡成纤维细胞中表达出MyoG蛋白。该结果为进一步研究MyoG基因的生物学作用奠定了基础。     

LZ-8蛋白的原核密码子优化表达及免疫调节功能的初步检测

    为研究LZ-8蛋白的免疫调节活性,设计合成12个寡核苷酸片段,并用PCR方法将它们连接为经密码子优化的新LZ-8基因;将该新基因克隆至原核表达载体pET-28b,构建重组表达质粒pET-28b_lz8,并在大肠杆菌BL21中进行诱导表达.表达产物经Ni离子亲和层析法纯化后,蛋白表达量达70 mg·L-1.通过不同品系小鼠的皮肤移植模型检测表明:纯化的重组蛋白具有一定程度的免疫抑制功能,还需进一步实验验证.     

坏死梭杆菌白细胞毒素基因SH片段的克隆与表达

坏死梭杆菌白细胞毒素是坏死杆菌病的主要致病因子,白细胞毒素基因（lkt）是其编码基因。以分离到的国内牛源坏死梭杆菌FN（A）菌株F4基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增白细胞毒素基因SH片段,克隆至pMD18-T载体上,以BamHⅠ和HindⅢ酶切的目的片段SH与相应酶切的pET32a载体连接构建pET32a-SH重组表达质粒,经转化E coli BL21（DE3）后用IPTG进行蛋白诱导,SDS-PAGE检测重组蛋白表达情况。结果表明：扩增基因序列大小为1800bp,SDS-PAGE检测重组蛋白有效表达,表达得到大小为80.2kDa的目的蛋白,采用镍柱亲和层析方法纯化SH重组蛋白,获得了纯度达95%的重组蛋白;经West-ern-blot证实,该蛋白对抗坏死杆菌阳性血清具有反应活性。