牛SPAG11D基因的原核表达及其抑菌活性研究

为了检测重组蛋白SPAG11D的抑菌活性,提取牛睾丸组织总RNA,经RT-PCR扩增了SPAG11D基因,将该基因插入p ET-32a(+)融合表达载体,并转入BL21(D3)进行原核表达,通过改变IPTG浓度和诱导时间优化表达条件,并用琼脂扩散法测定重组蛋白体外抑菌活性。结果显示,成功扩增牛SPAG11D基因,产物大小为390 bp,其序列与Gen Bank公布序列相一致;正确构建了原核表达载体p ET-32a(+)-SPAG11D,重组蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导时间为4 h;表达产物的分子质量约为33 k Da;该重组蛋白对霍乱弧菌具有明显的体外抑菌活性。本研究成功构建了牛SPAG11D基因的原核表达载体,并获得了具有抑菌活性的重组蛋白His-SPAG11D。     

抗菌肽Lactoferricin B的原核表达及其纯化

牛乳铁蛋白活性多肽(Lactoferricin B,LfcinB)是一种阳离子型抗菌肽,因其具有多种生物学功能,现已被认为具有能够替代传统抗生素的发展前景。然而,由于传统的分离制备方法存在诸多弊端,所以基于基因工程的原核表达技术在制备高纯度和高效表达的该蛋白方面具有极其深远的意义。研究旨在摸索出一套完整的利用原核表达技术制备LfcinB的分子生物学方法。依据大肠杆菌密码子偏爱性的原则,设计了LfcinB的基因序列,通过人工合成的方法获得该基因的优化序列,借助Bam HI和Sal I双酶切、连接等手段将其构建到原核表达载体pGEX-4T-2上,获得重组表达载体pGEX-4T-2-LCB,将该载体转化E.coli Rosetta(DE3)。使用IPTG诱导,结果发现LfcinB在大肠杆菌中表达量超过20%。通过一系列蛋白纯化技术分离得到纯度达到95%以上的LfcinB融合蛋白。抑菌试验结果表明,重组抗菌肽LfcinB融合蛋白具有很好的抑菌活性。研究结果为人们使用基因工程技术制备抗菌肽LfcinB提供了具有重要参考价值的技术路线和理论依据。     

新疆荷斯坦牛β防御素5基因的克隆、表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆和表达新疆荷斯坦牛中性粒细胞防御素5(BNBD5)基因,对BNBD5蛋白进行纯化并分析其抗菌活性。【方法】利用RT-PCR方法扩增新疆荷斯坦奶牛BNBD5的cDNA序列,将BNBD5 cDNA克隆到原核表达载体pGEX-4T-2,测序分析后转化大肠埃希菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析;利用GST亲和柱纯化BNBD5蛋白,并进行体外抑菌试验。【结果】通过PCR扩增获得了218bp的牛BNBD5全长cDNA序列,经IPTG诱导,获得了约33 ku的牛BNBD5蛋白。牛BNBD5蛋白在15~25℃培养时的可溶性较37℃时多,且大多以包涵体形式存在,经纯化后最终获得了少量的目的蛋白。纯化的BNBD5蛋白对标准金黄色葡萄球菌和标准大肠埃希菌均具有明显的抑菌活性。【结论】克隆、表达了牛BNBD5基因,表达的BNBD5蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌活性。     

家蚕抗菌肽基因BmMoricin的克隆及重组蛋白的自诱导表达

抗菌肽是构成昆虫体液免疫的主要方式,BmMoricin是家蚕免疫系统中1种重要的抗菌肽,具有极强的抑菌活性。以家蚕中肠组织总RNA为模板,设计1对特异性引物,通过RT-PCR技术扩增BmMoricin,构建pET32aBmMoricin原核表达载体,采用自诱导表达系统表达BmMoricin重组蛋白。结果表明,BmMoricin基因片段的大小为201 bp,编码66个氨基酸,自诱导表达的BmMoricin重组蛋白大小约为19 ku,表达产率比异丙基-β-D-疏基半乳糖苷(IPTG)诱导的重组蛋白表达产率高,为BmMoricin抗菌肽的生物学活性鉴定及应用奠定了基础。     

抗菌肽Thanatin基因表达载体构建与表达

根据大肠杆菌的密码子偏好性,人工设计并合成了3条寡核苷酸片段,相邻片断有17个碱基的重叠区,通过PCR扩增得到抗菌肽Thanatin基因,将此基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-1中,然后将重组质粒pGEX- Thanatin转化E.coli BL 21,经IPTG诱导进行融合表达.通过SDS - PAGE分析,融合蛋白GST -Thanatin 表达成功.     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

绵羊肺炎支原体热休克蛋白Hsp70 C末端基因原核表达

为研究绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)热休克蛋白Hsp70抗原特性,以Mo贵州分离株为模板扩增得到Hsp70蛋白C末端基因,将目的基因连接至pET-28a原核表达载体,经PCR、双酶切和序列测定正确的阳性重组质粒转化E.coli Rosseta表达菌,IPTG诱导表达,表达产物进行SDS-PAGE及Western blotting分析。结果显示,经PCR从Mo贵州分离株扩增获得567bp的C末端片段,并成功构建含Mo Hsp70蛋白C末端基因的原核表达质粒,经IPTG诱导表达获得分子质量约为27ku的目的蛋白,且目的蛋白能与Mo阳性血清印迹反应。说明,成功构建可有效表达Mo贵州分离株Hsp70蛋白C末端基因的原核表达载体。     

杂合肽基因的合成及在大肠杆菌中的表达

将LfcinB15-Ma12杂合肽基因克隆到载体pET32a上,构建抗菌肽LfcinB15-Ma12杂合肽基因,并在大肠杆菌中表达融合蛋白。根据已报道的抗菌肽LfcinB和Magainin基因的氨基酸序列,推导出其cDNA序列,将两者连接为杂合基因并克隆到载体pET32a上,IPTG诱导表达。构建了LfcinB15-Ma12杂合肽基因重组质粒,经PCR扩增和DNA测序分析,成功构建了LfcinB15-Ma12杂合肽基因重组质粒,经IPTG诱导,成功表达了杂合肽LfcinB15-Ma12。这为利用基因工程表达其他抗菌肽奠定了基础。     

海岛棉枯萎病抗性相关基因 RGBCH 的克隆、原核表达及抑菌活性分析

为明确海岛棉抗枯萎病相关基因（RGBCH ）是否抑制海岛棉重要土传真菌枯萎菌的生长,克隆了海岛棉抗枯萎病基因相关基因 RGBCH 的全长编码序列,将该基因编码序列亚克隆到原核表达载体 pET-30a 上,构建成pET-30a-RGBCH 融合蛋白表达载体。经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,获得了以包涵体形式表达的pET-30a-RGBCH 重组蛋白。经过裂解、洗涤、溶解、复性等处理,获得了纯化的 pET-30a-RGBCH 融合蛋白。体外抑菌试验表明,RGBCH 蛋白显著抑制枯萎病病原菌的生长。     

A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1的表达纯化及活性检测

为获得具有活性的A型FMDV VP1蛋白,以A型vp1重组质粒pMD19T A vp1为模板,利用PCR扩增得到A型FMDV vp1基因片段,将此基因片段与原核表达载体pET28a连接,构建重组质粒pET A vp1。经IPTG诱导表达含重组质粒pET A vp1的E. coli BL21 (DE3) 菌后,SDS PAGE显示VP1蛋白以包涵体形式获得高效表达,蛋白分子质量约为29 ku。通过对IPTG浓度及诱导时间进行优化,结果表明,在37 ℃条件下,IPTG终浓度为0.3 mmol/L,诱导表达6 h后,VP1蛋白的表达量最大。Western Blot分析表明,VP1重组蛋白能够被A型口蹄疫阳性血清特异性识别。ELISA检测结果显示,VP1包涵体蛋白经洗涤纯化,尿素浓度梯度透析复性后具有较高的活性。     

僵蚕抑菌活性成分的提取及其对大肠杆菌的抑制作用

【目的】探讨僵蚕抑菌活性成分的提取方法,比较所得提取物对大肠杆菌的抑制作用,为解析和深入研究僵蚕的抑菌药理机制提供参考。【方法】以僵蚕为材料,以体积分数95%乙醇为提取溶剂,对中药僵蚕的4种提取方法(超声波法、微波法、煎煮法、冷浸法)进行平行比较研究;采用超声波提取法,探讨了石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、体积分数95%乙醇、甲醇和水7种提取溶剂的提取效果,采用比色法、纸片扩散试验和肉汤倍比稀释法研究所得僵蚕活性提取物对大肠杆菌(Escherichia coli)的抑菌活性。【结果】以体积分数95%乙醇作为提取溶剂,4种提取方法中,以超声波法提取时的浸膏得率最高。采用超声波提取法时,7种提取溶剂中,以体积分数95%乙醇提取浸膏的得率最高。研究结果显示,不同提取方法得到的提取物对大肠杆菌均有明显的抑菌作用,其中采用超声波提取法,以体积分数95%乙醇为提取溶剂时,所得提取物的抑菌活性最高,其对大肠杆菌的最低抑菌浓度(MIC)为0.625mg/mL。【结论】不同提取方法得到的僵蚕提取物对大肠杆菌均具有明显的抑菌活性,僵蚕的抗炎作用与其抑菌活性相关。     

紫茎泽兰抑制马铃薯晚疫病菌的初步研究

将紫茎泽兰的乙醇提取物依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取,萃取物对马铃薯晚疫病菌进行抑菌试验.结果表明,石油醚萃取物抑菌效果最好,抑菌率达100%.进一步采用不同梯度的混合有机溶剂对石油醚萃取物进行硅胶柱层析,抑菌试验结果表明,用石油醚:乙酸乙酯(8:1)、石油醚:乙酸乙酯(4:1)和甲醇试剂洗脱得到的有效物质,其抑菌效果最好,抑菌率达100%.     

壳聚糖抗菌膜的研究进展

壳聚糖是一种来源广泛、无毒无害、具有生物相容性的可生物降解天然高分子材料,具有良好的成膜性和一定的抗菌性。综述了壳聚糖及其衍生物抗菌膜的制备方法、物理性能、抗菌性及在食品保鲜和医药方面的研究进展,提出了其中的不足之处,并对其未来研究进行展望。     

抗苹果树腐烂病解淀粉芽孢杆菌TS-1203的抑菌活性物质稳定性及抑菌谱测定

【目的】研究将抗苹果树腐烂病解淀粉芽孢杆菌TS-1203开发成高效低毒生防制剂的潜力.【方法】采用生长速率法测定解淀粉芽孢杆菌TS-1203的生长曲线和抑菌活性物质稳定性.【结果】解淀粉芽孢杆菌TS-1203生长曲线呈"S"型,13h后进入对数生长,43h后趋于稳定期;物理因素光照、温度与紫外照射对抑菌活性物质影响不大,只有当温度与紫外照射时间分别为100℃、60s时,其粗提液对苹果树腐烂病菌(Valsa mail)抑菌率显著下降,与对照达到显著差异水平(P0.05);化学因素中,只有强酸强碱,金属离子为Mg~(2+)时,其抑菌率显著下降,与对照达到显著差异(P0.05);不同饱和度硫酸铵对粗提液抑菌率影响也不明显;粗提液抑菌谱测定发现其对多种病原菌有抑制作用,其中对立枯丝核菌和链格孢抑菌率均达80%以上.【结论】解淀粉芽孢杆菌TS-1203粗提液有良好的稳定性,且抑菌谱广.     

重组家蝇抗菌肽Des-HF在酵母中的表达及对金黄色葡萄球菌的抗菌活性

参考家蝇防御素抗菌肽基因序列(AY260152) 设计4条引物,用降落PCR方法获得家蝇防御素抗菌肽成熟肽基因.将基因克隆人酵母表达载体pPICZα-A,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC-Des-HF,转化Pichia pastoris受体菌SMD1168,在醇氧化酶(AOX) 启动子调控下,相对分子质量约5 000的重组抗菌肽Des-HF获得表达.抗菌试验结果表明,该表达产物对金黄色葡萄球菌有较好的抑菌活性.以小鼠为试验模型研究重组抗菌肽对金黄色葡萄球菌的体内抗菌活性,试验结果表明,240μg重组Des-HF可分别保护小鼠免受10倍最小致死浓度的金黄色葡萄球菌(ATCC26003) 和Cowan I的攻击.     

蛹虫草抗菌活性物质的初步研究

利用平板对峙法,从实验室保藏的20株蛹虫草菌株中筛选出抗菌效果较强的CF2菌株；采用蒸馏水和95％乙醇作为提取剂,提取液作用于指示菌,发现水溶性提取物抑菌效果明显优于脂溶性提取物；经Sevage法脱蛋白后抑菌效果消失,初步分析该活性物质为蛋白质.在90℃水浴10 min后抑菌物质才失去活性,表明该抑菌物质对温度不敏感.对芽孢杆菌和酵母菌的抑制率分别为97.1％、30.9％,对黑曲霉菌落生长抑制率为18.4％.     

淫羊藿甙的提取及抑菌作用

以淫羊藿甙的含量为指标,采用正交设计试验对淫羊藿甙的提取工艺优化,并研究了淫羊藿甙的抑菌作用。结果表明：影响提取效率的因素按影响大小依次为提取次数＞乙醚的用量＞提取时间。最佳的提取工艺为淫羊藿与乙醚按1：10(g/ml)投料,回流反复提取4次,每次1．5h。淫羊藿甙对常见的几种食品污染菌均有一定的抑制作用,且淫羊藿甙经瞬时高温处理后,仍具有较强的抑菌作用。另外,对黑曲霉的最低抑菌浓度为0．23%,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度为0．12%,对枯草杆菌、青霉、酵母菌的最低抑菌浓度均为0．05%。     

微生态制剂中抑菌物质的分析

本文以一种市售微生态制剂为试材,对其产生的抑菌活性物质的生化性质做了研究,发现该抑菌物质显示活性的ｐＨ范围为４．０～６．０,ｐＨ值变化对其活性影响较大,ｐＨ值为７．０时活性全部消失;该活性物质对热不敏感,１２１℃处理３０ｍｉｎ后,其活性无明显变化;紫外光照射也不能使它失活;随发酵时间的延长,发酵液中的抑菌活性物质逐渐增加。根据其生化性质可以判断该抑菌物质是一种分子量较小,结构简单的多肽,具有广谱抑     

具抗菌活性的红树林细菌的分离筛选

从广西山口红树林保护区采集的样品中分离得到32株细菌,以金黄葡萄球菌为指示菌初筛得到7株细菌具有抗菌活性,同时检测它们对其他4株指示菌的抗菌情况,结果发现SK-01对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和黑曲霉均有明显的抗菌活性。选取SK-01进行初步研究,结果发现SK-01在3号培养基、pH值7.0、盐浓度0的条件下生长最好;在1号培养基、pH值7.0、培养时间48 h、盐浓度1%的条件下产活性物质效果最好;对SK-01进行传代试验,结果显示SK-01具有良好的遗传稳定性,可以进行进一步的开发和利用。