玉米转录因子ABP9瞬时表达体系的建立

[目的]研究玉米抗逆相关转录因子ABP9在玉米抗逆应答中的功能及其表达调控机理.[方法]以2叶期玉米叶片为材料分离原生质体,通过PEG介导的转化方法,建立玉米叶肉原生质体瞬时表达ABP9的系统.利用该系统,通过反转录PCR和Western blot分别检测ABP9genomic：：FLAG融合基因在原生质体中的转录和翻译;并通过转化ABP9：：GFP融合表达载体和GFP荧光检测,对ABP9进行亚细胞定位.[结果]玉米原生质体瞬时表达ABP9系统中,ABP9genomic：：FLAG融合基因能够正确转录出mRNA并翻译出蛋白质;利用该系统进行亚细胞定位结果显示ABP9定位于细胞核中.[结论]玉米原生质体瞬时表达ABP9体系的建立,为进一步探究玉米中ABP9的表达和调控提供了良好的实验系统.     

绿色荧光蛋白在贵阳腐霉的组成性表达

以潮霉素抗性基因hph为筛选标记,以双元载体pPK2为基本骨架,将增强型绿色荧光蛋白基因egfp置于组成型启动子PgpdA和色氨酸C终止子TtrpC之间,构建了组成性表达egfp的载体pPK2EGFP,利用根癌农杆菌介导的遗传转化法,转入贵阳腐霉(Pythium guiyangense)表达.对转化子进行RT-PCR和荧光显微镜检测,结果表明,egfp基因在贵阳腐霉转化子中能稳定表达.     

沙漠小球藻转植物表达载体的表达预测

以建立小球藻(沙漠小球藻)表达系统为目的,为利用小球藻重组表达外源蛋白,以及GFP荧光特性研究沙漠中的小球藻生理及理化性质提供基础方法;同时也探索植物表达载体p CAMBIA2300-35S-OCS能否在沙漠小球藻中表达。通过菌落PCR验证E.coli DH5α是否含有目的基因(GFP基因)的重组植物表达载体p CAMBIA2300-35S-GFP-OCS,然后从E.coli DH5α中提取也构建完成的重组植物表达载体pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS;利用电转化的方法将重组植物表达载体p CAMBIA2300-35S-GFP-OCS转入到小球藻细胞中;将电转的小球藻在含有100 mg/L卡那霉素的BBM固体培养基中筛选出单克隆,将单克隆在含有15 mg/L卡那霉素的BBM液体培养基中扩大培养,然后利用PCR和RT-PCR预测绿色荧光蛋白基因(GFP基因)的存在与否和表达情况,再利用SDS-PAGE和荧光倒置显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况。通过SDS-PAGE和荧光倒置显微镜观察结果表明绿色荧光蛋白(GFP)在小球藻中表达成功。试验结果表明重组植物表达pCAMBIA2300-35S-OCS能够在小球藻中表达外源蛋白,以及利用GFP的荧光特性研究小球藻的生理生化差异;也为小球藻在沙漠环境上的应用提供基础。     

黑曲霉分泌表达载体的构建以及绿色荧光蛋白的表达

采用PCR扩增得到糖化酶基因启动子（PglaA-g）、色氨酸合成酶基因终止子（TtrpC）和潮霉素抗性筛选标记基因,依次连接这些基因元件,获得黑曲 Aspergillus niger 分泌表达载体pPHT. EGFP 基因与黑曲霉表达载体pPHT连接,得到重组表达载体pPHT-EGFP.pPHT-EGFP表达载体通过原生质体转化法转化黑曲霉,经潮霉素抗性筛选、基因组PCR鉴定阳性重组转化子.荧光显微镜观察表明,绿色荧光蛋白成功表达,而且荧光的分布具有一定的规律,主要集中在菌丝顶端、膈膜以及培养基中;固体培养基发出绿色荧光,表明绿色荧光蛋白分泌到培养基中,属于分泌性表达,蛋白分泌的部位主要位于菌丝顶端.     

红色荧光蛋白融合表达载体的构建和蛋白质细胞内定位研究

为进一步研究目的蛋白质在细胞内的定位,构建融合了红色荧光蛋白mCherry或mScarlet的表达载体。选取VTI12、RabD2a、ARA7以及SYP61等4个定位基因来构建红色荧光蛋白融合表达载体。根据TAIR数据库中相关蛋白质的基因序列设计引物,通过PCR技术扩增序列并将其分别连接到已制备好的红色荧光蛋白融合表达载体上,制备得到质粒后转化入原生质体进行瞬时表达。结果表明,成功构建了pUC18HE-NmCherry-VTI12、pUC18HE-NmCherry-RabD2a、pUC18-mScarlet NT-ARA7以及pUC18-mScarlet NT-SYP61等4个红色荧光蛋白融合表达载体,并且成功在拟南芥叶肉细胞原生质体中瞬时表达。     

猪细小病毒VP2基因与猪圆环病毒2型ORF2基因共表达对PPV病毒样颗粒形成的影响

将扩增得到的PPV SC-1株VP2基因产物插入真核表达载体pPI-2.EGFP中,得到了重组质粒pPI-2.EG-FP.VP2。再以含有PCV2 SC株全基因组的重组质粒pMD-PCV2为模板扩增PCV2ORF2基因,进一步将其插入pPI-2.EGFP.VP2中,构建含有PPVVP2基因、PCV2ORF2基因及EGFP报告基因的真核表达载体pPI-2.EG-FP.VP2.ORF2。用脂质体介导法将pPI-2.EGFP.VP2.ORF2 DNA转染Vero细胞,观察绿色荧光蛋白的融合表达,采用ELISA方法检测转染液与PPV、PCV2高免血清的反应特性,同时将转染出现绿色荧光明显的Vero细胞制备电镜样品。结果显示,VP2基因、ORF2基因与绿色荧光蛋白得到融合表达,转染液与PPV、PCV2高免血清具有良好的抗原抗体反应特性,电镜观察到重组病毒样颗粒的形成。     

PEI介导外源基因进入植物细胞的瞬时表达

 【目的】医学方面的大量研究证实,聚乙烯亚胺（polyethylenimine,PEI）作为一种新型阳离子多聚物基因载体可以吸附和浓缩DNA,通过与细胞膜亲和粘附和细胞吞噬作用运载外源基因进入细胞并实现表达。本实验研究旨在探索PEI作为非病毒基因载体介导外源基因进入植物细胞并获得瞬时表达的可能性。【方法】制备PEI/DNA复合物,利用凝胶阻滞分析PEI与DNA的结合情况,采用电子显微镜观察PEI/DNA复合物的形态。以绿色荧光蛋白基因为报告基因研究不同N/P比条件下PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率,并与PEG转化方法进行比较分析。【结果】PEI与DNA的质量比为5﹕1～1﹕4,PEI可以与DNA稳定结合,形成粒径约100～200 nm的球形复合物。PEI/DNA复合物对拟南芥原生质体细胞的转化效率随其N/P比的增大而提高,N/P＝5时PEI的转化效率达到最高且明显高于PEG介导的转化效率,N/P＞5时转化效率反而下降,容易使细胞破碎和变形。【结论】PEI作为一种新型的外源基因运送载体对拟南芥原生质体细胞具有良好的介导基因转移效果。     

大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)增强型绿色荧光蛋白遗传转化载体的构建

载体的构建是建立遗传转化体系的基础。以真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro为基本骨架,构建大豆疫霉菌遗传转化载体,通过限制性内切酶酶切、去磷酸化、连接等基因重组技术,将增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)基因和来自莴苣霜霉菌(Bremia lactucae)的启动子(ham34)、终止子重组到真核表达载体pcDNA3.1(-)/hygro中,经大肠杆菌转化后对转化子进行了酶切验证,为大豆疫霉菌遗传转化体系的建立提供载体。     

山羊乳腺上皮细胞的光镜观察

采用电穿孔转化法,将EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因转化体外培养的山羊乳腺上皮细胞。细胞穿孔转化7d后在荧光显微镜下观察。结果显示,EGFP基因成功地转入体外培养的山羊乳腺上皮细胞,EGFP基因获得表达,6种电穿孔参数的转化效果基本相同。     

磁性纳米颗粒负载质粒DNA的研究

【目的】研究磁性纳米颗粒(MNP)负载质粒DNA形成的纳米载体-基因复合物的生物物理学特性、负载形态与负载机理,为基于磁性纳米载体定向编辑技术的应用奠定基础。【方法】以MNP作为基因载体,与质粒DNA pRGEB32制备纳米载体-基因复合物MNP-pRGEB32,分析MNP负载、保护pRGEB32的能力,并对其粒度分布、Zeta电位、结合形态进行研究。【结果】MNP通过静电作用压缩、吸附、聚集pRGEB32,形成纳米载体-基因复合物。MNP能有效负载并保护pRGEB32。【结论】MNP可作为一种理想的基因转移载体。     

rbcS启动子的克隆及活性鉴定

利用PCR技术从豌豆(Pisum satium Linn)基因组DNA中分离了rbcS基因启动子及叶绿体定位信号编码序列。序列分析表明,扩增片段(1256bp)与已报道序列的相应区域同源性达98.41 %。将其与绿色荧光蛋白基因(GFP)串连在一起,构建了植物表达载体,通过基因枪介导法转化烟草叶片及洋葱表皮细胞。结果表明这一表达系统增强了绿色荧光蛋白基因的瞬时表达,从而为外源基因在转基因植物中的高效表达提供了新的工具,可以实现目的基因的组织特异性和光诱导性表达。     

表达绿色荧光蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白 (GFP)的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcoRⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下 ,克隆进表达载体质粒pYA3334的EcoRⅠ和NcoⅠ位点之间 ,构建成重组表达质粒pYAGFP ,然后转化大肠杆菌X6 2 12、中间宿主X3730、终末宿主X45 5 0。X45 5 0于LB培养基上呈绿色 ,在荧光显微镜下观察 ,整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。     

根癌农杆菌介导VirE2-N-EGFP在2种茄科植物中的表达分析

为了明确根癌农杆菌介导的外源蛋白在茄科植物叶片细胞中能否瞬时表达,克隆了土壤根癌农杆菌的VirE2基因,并融合至绿色荧光蛋白(EGFP)的N端,成功构建pPZP-VirE2-N-EGFP植物表达载体.以茄科的本氏烟为对照,根癌农杆菌介导在辣椒和番茄叶片细胞中进行了表达分析.用共同聚焦显微镜可以在本氏烟和辣椒叶片细胞中观察到绿色荧光,而在番茄叶片细胞中未观察到.表明外源蛋白VirE2-N-EGFP可以在辣椒叶片细胞瞬时表达.该研究结果为进一步研究辣椒中与植物病原互作基因的功能奠定了基础.     

多角体包埋异源蛋白杆状病毒表达系统的构建

[目的]探索多角体病毒的包装特性,构建能形成多角体包裹外源蛋白的polyh+Bac-to-Bac表达系统。[方法]通过酶切连接的方式,将4个元件片段:作为标记的绿色荧光基因EGFP,Bm CPV自身的多角体蛋白基因,用于基因表达的H1信号肽柔性连接肽,插入到质粒Fast Bac Dual中,利用Ac MNPV Bac-to-Bac系统,得到整合表达重组Bacmid:Ac-polyh/EGFP。将其感染Sf9细胞后,检测蛋白表达情况。[结果]利用该系统构建了一种能大量表达绿色荧光蛋白(EGFP)和能在胞质形成多角体的重组病毒v Bm Bac(polyh+)-EGFP。感染的Sf9细胞在荧光显微镜下观察发现EGFP与多角体可以在同一细胞中同时表达;从感染的Sf9细胞中收集纯化多角体,观察到多角体能被激发出绿色荧光,进一步利用Western blot证实多角体中含有EGFP。[结论]该表达系统为解决活性蛋白长期保存提供了新方法,同时拓宽了杆状病毒在开发含有毒素蛋白的新型生物杀虫剂和新型疫苗的转运载体等领域的应用前景。     

表达绿色荧光蛋白重组减毒鼠伤寒沙门氏菌的构建

应用DNA重组技术构建了表达绿色荧光蛋白（GFP）的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌。用EcorⅠ和NcoⅠ将pEGFP质粒中的绿色荧光蛋白基因EGFP切下，克隆进表达载体质粒pYA3334的EcorⅠ和NcoⅠ位点之间，构建成重组表达质粒pYAGFP，然后转化大肠杆菌X6212、中间宿主X3730、终末宿主X4550。X4550于LB培养基上呈绿色，在荧光显微镜下观察，整个菌体发绿色荧光。构建的表达GFP的重组鼠伤寒沙门氏菌为减毒沙门氏菌活载体基因工程疫苗的研制提供一个良好模型。     

多聚赖氨酸-硅纳米的制备及体外转染HepG2细胞的研究

目的观察多聚赖氨酸-硅纳米颗粒作为基因转染载体体外转染肝癌细胞系HepG2细胞的可行性。方法自制硅纳米颗粒并用多聚赖氨酸修饰,与增强型绿色荧光蛋白基因质粒(pEGFP-C1)结合后体外转染HepG2细胞,观察转染后绿色荧光蛋白表达情况,计算转染效率。结果制备出大小均匀、粒径30 nm、稳定性及分散性好的球形硅纳米,硅纳米表面经多聚赖氨酸修饰后作为基因转染载体,能有效地转染pEGFP-C1进入HepG2细胞,转染效率为30%~40%。结论本文成功制备了多聚赖氨酸-硅纳米,该纳米颗粒在体外可作为基因载体,有效转染质粒pEGFP-C1。     

雌二醇依赖性的细胞表达载体的研究

 根据雌激素类化合物在机体内的作用机理，以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为报告基因构建了4个启动子不同的表达载体(pERE-SV-EGFP, pERE-TA-EGFP, pERE-CMV-EGFP, pERE-TK-EGFP)。以这些表达载体瞬时转染MCF-7细胞，报告基因的基础表达与启动子的强度相关。以17β-雌二醇(E2 ,10-9 mol·L-1)诱导表达载体瞬时转染的MCF-7细胞，发现在表达载体pERE-TA-EGFP、pERE-TK-EGFP、pERE-SV-EGFP转染的MCF-7细胞中，E2能诱导2倍以上的报告基因的表达。这表明在这些瞬时表达系统中报告基因的表达是雌激素依赖性的，因此这些表达载体可用于稳定转染以建立稳定表达分析系统。     

版纳微型猪近交系B4GALNT2基因真核表达载体构建及亚细胞定位分析

【目的】研究异种器官移植免疫排斥相关基因B4GALNT2的亚细胞定位情况。【方法】以版纳微型猪近交系(BMI)为试验对象,通过RT-PCR方法获得B4GALNT2基因cDNA序列,运用分子克隆技术构建B4GALNT2和报告基因EGFP的重组真核表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,将其转染猪肾上皮细胞PK15进行瞬时表达,同时用Mito Tracker和Hoechst33342荧光染料分别对线粒体和细胞核染色,通过EGFP示踪检测B4GALNT2在PK15细胞中的表达和定位。【结果】成功构建了BMI B4GALNT2基因的绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-C1-B4GALNT2,转染PK15细胞后主要在细胞质中检测到绿色荧光蛋白的表达,试验结果与PSORTⅡserver网站的预测一致。【结论】B4GALNT2蛋白主要定位于细胞质,揭示该蛋白主要在细胞质中发挥其功能作用。     

野大麦CIPK基因的亚细胞定位

为明确野大麦CIPK基因在植物亚细胞水平上的定位情况,以已知细胞质膜定位的拟南芥AtCBL1基因和液泡膜定位的AtCBL3基因作为参照,构建了这两个基因分别与红色荧光蛋白基因（RFP）融合的植物表达载体（参照载体）,以及野大麦CIPK基因与绿色荧光蛋白基因（GFP）融合的植物表达载体（目标载体）,利用基因枪转化法将参照载体和目标载体共转化洋葱上表皮细胞,瞬时表达后利用激光共聚焦显微镜进行共定位分析。结果表明,该基因主要定位于细胞膜和细胞核,为进一步深入分析该基因的功能提供了重要依据。     

绿色荧光蛋白基因银耳表达载体构建及表达

以银耳芽孢为材料,由载体pEGFP、pCAMBIA1300经过HindIII和EcoRⅠ双酶切、连接、转化,重组质粒酶切验证,成功构建了由双孢蘑菇gpd启动子调控EGFP基因的银耳真核表达载体,命名pCB-BEGFP。采用电击转化法将携带EGFP基因的银耳表达载体pCB-BEGFP转化到银耳芽孢。提取4个转化子基因组DNA,用EGFP基因特异引物PCR扩增,电泳结果表明有与EGFP基因大小一致的特异带出现;荧光显微镜观察在再生培养基上的转化子可看到很强的绿光;其中一个转化子蛋白SDS-PAGE电泳,结果发现在大约27kD处有一明显的蛋白条带出现,与预期的蛋白分子量相近。以上结果证明EGFP基因转入银耳芽孢中,双孢蘑菇启动子可以调控外源基因的在银耳芽孢中正确表达。