多聚磷酸盐激酶(PPK)基因植物表达载体的构建(英文)

[目的]构建融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK。[方法]根据GenBank中登录的大肠杆菌PPK基因序列(L03719)设计引物,以E.coli DH5α基因组DNA为模板,通过PCR扩增得PPK基因,然后用In-Fusion@HD Cloning Kit将PPK基因克隆到pCAMBIA1302载体的NcoI酶切位点。[结果]序列测定结果显示,pCAMBIA1302-PPK含有约2.0kb的PPK基因片段,说明PPK基因已经插入植物表达载体pCAMBIA1302的绿色荧光蛋白基因前。[结论]成功构建了融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK。     

多聚磷酸盐激酶(PPK)基因植物表达载体的构建

[目的]枸建融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK.[方法]根据GenBank中登录的大肠杆菌PP基因序列(L03719)设计引物,以E.coli DH5α基因组DNA为模板,通过PCR扩增得PPK基因,然后用In-Fusion@HD Cloning Kit将PPK基因克隆到pCAMBIA1302载体的Nco Ⅰ酶切位点.[结果]序列测定结果显示,pCAMBIA1302-PPK含有约2.0kb的PPK基因片段,说明PPK基因已插入植物表达载体pCAMBIA1302的绿色荧光蛋白基因前.[结论]成功构建了融合表达PPK和绿色荧光蛋白的融合表达载体pCAMBIA1302-PPK.     

双向启动子构建及在毛白杨中瞬时表达研究

该研究通过PCR扩增、酶切及连接等分子生物学研究方法分别将β葡萄糖苷酶基因(gusA)和绿色荧光蛋白基因(gfp)与双向启动子两端融合,构建成双可视报告基因融合双向启动子的植物二元表达载体pBDGG. 通过农杆菌介导的叶盘法转化毛白杨叶片以鉴定所构建的双向启动子的功能. 对农杆菌侵染3～4 d的毛白杨同一叶片进行GUS组织化学染色检测和紫外激发后通过荧光显微镜观测绿色荧光,结果表明gusA基因和gfp基因都能够进行瞬时表达,表明该双向启动子可在毛白杨中实现双向表达. 该文还讨论了双向启动子在植物基因工程中应用的可能性,为实现植物基因工程的“一箭双星”（即一个启动子同时双向表达两个或多个基因）奠定基础.      

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中Os-WRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了该基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinG-FP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了OsWRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBinGFP-OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

水稻OsWRKY17基因定位表达载体的构建(英文)

[目的]研究水稻OsWRKY17基因的生理生化特性,确定OsWRKY17蛋白在植物中的定位。[方法]根据GenBank数据库中OsWRKY17全序列设计引物,进行OsWRKY17的RT-PCR扩增,克隆了OsWRKY17基因,将该片段与带绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒载体pBinGFP重组,将构建正确的表达载体pBinGFP-OsWRKY17通过农杆菌介导的花蕾浸泡法转化到拟南芥中。[结果]经菌落PCR与酶切鉴定表明成功构建了Os-WRKY17基因与GFP融合的植物表达载体pBin-GFP/OsWRKY17,并成功将OsWRKY17基因整合到拟南芥的基因组中,获得了抗性植株。[结论]OsWRKY17基因表达载体的构建为研究该基因的生理生化特性奠定了基础。     

苎麻生长素结合蛋白BnABP1与GFP融合在烟草中的表达

运用已克隆的苎麻生长素结合蛋白BnABP1基因cDNA及植物表达载体pCAMBIA1300 GFP,构建了35S启动子控制的苎麻BnABP1基因编码区段与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合表达重组体(pCAMBIA1300 GFP BnABP1)。通过根癌农杆菌介导法将其转化烟草WS38,经抗性筛选和PCR检测获得了转基因烟草。对转基因烟草细胞进行荧光显微镜观察,发现在细胞质膜和内膜系统上都有较强烈的荧光信号,进一步证明苎麻生长素结合蛋白ABP1已结合在细胞的膜系统上。     

绿色荧光蛋白基因在植病研究中的应用

综述了绿色荧光蛋白基因在植物病害研究中的应用及进展。重点分析了绿色荧光蛋白基因在病原菌的检测、侵染与定殖、致病基因的表达及构建抗性植株的筛选中的应用,提出了绿色荧光蛋白基因在应用中存在的问题以及在植物病害研究领域展现出的巨大潜力。     

泛素结合酶UFC1基因的荧光表达载体构建

利用pEGFP-C3作为载体,构建与绿色荧光蛋白基因相连的泛素结合酶UFC1(ubiquitin-fold modifier conjugating enzyme 1)序列的真核表达质粒,观察其在真核细胞中的表达和定位,为进一步研究UFC1基因功能打下了基础。采用RT-PCR方法从宫颈癌Hela细胞中扩增UFC1基因全长cDNA,双酶切后克隆到真核表达载体pEGFP-C3中,构建并鉴定pEGFP-C3-UFC1质粒。经脂质体介导转染Hela细胞后,在荧光显微镜下观察目的蛋白在真核细胞内的表达情况。双酶切鉴定和测序分析均证实,已成功构建pEGFP-C3-UFC1重组载体。重组载体转染Hela细胞,观察到绿色荧光蛋白表达,还可见绿色荧光呈点状分布于细胞质中;而对照pEGFP-C3质粒转染Hela细胞,绿色荧光蛋白则呈弥散状分布。成功克隆了UFC1基因,构建了pEGFP-C3-UFC1重组质粒。     

rd29A启动子克隆及对低温响应的研究

研究从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA克隆了rd29A基因启动子,序列分析表明该启动子具有两个干旱、高盐和低温响应顺式作用元件(DRE),在851～856 bp碱基处为TATA box,其它主要调控区域也存在。然后,分别用rd29A启动子和CaMV 35S启动子,构建了具有绿色荧光蛋白(GFP)基因的植物表达载体pBIG和pBIRG。通过基因枪导入法转化洋葱表皮细胞,在25 ℃和4 ℃条件下培养16 h后,用荧光显微镜观察GFP基因的表达水平。结果表明,在低温条件下,rd29A启动子的活性明显高于CaMV 35S启动子,说明rd29A启动子是一低温诱导型启动子,可满足在低温条件下使目的基因在转基因植物中进行表达的目的。     

绿色荧光蛋白基因在水稻遗传转化中的应用

本研究构建了含有编码绿色荧光蛋白基因的植物表达载体,以愈伤组织作为外植体,采用农杆菌介导法将携带绿色荧光蛋白的植物表达载体转入水稻品种秀水11中.分析了转化1个月的抗性愈伤组织以及2个月的转基因植株根中绿色荧光蛋白基因的表达.在荧光显微镜下观察到了绿色荧光蛋白基因的表达,转基因水稻愈伤组织和根具有很高的绿色荧光信号.结果表明,在水稻遗传转化研究中,绿色荧光蛋白基因既可用于检测基因的瞬间表达,也可用于检测基因在细胞中的稳定表达.     

绿色荧光蛋白在秋黏虫细胞中的表达

将绿色荧光蛋白基因编码区克隆到转移载体pBacPAK8,与杆状病毒BacPAK6共转染昆虫细胞,通过同源重组和筛选,构建了整合有绿色荧光蛋白基因的重组病毒。在昆虫细胞中表达的绿色荧光蛋白,在荧光显微镜下呈现绿光。这样,就可在细胞内通过监测其表达情况,以了解病毒在不同细胞中的感染情况。     

荧光蛋白标记表达H6亚型禽流感病毒血凝素基因

研究构建了H6N2亚型AIV的核酸疫苗表达载体,以绿色荧光蛋白基因作为报告基因,构建了HA与报告基因的融合基因,并克隆于pAVX1表达载体,再经脂质体转染BHK细胞进行体外表达试验.构建的表达载体pAVX1-H6A-GFP酶切鉴定已克隆上融合基因;体外表达试验中,脂质体转染24 h后出现微弱荧光,48 h后见较强的荧光表达,从而成功实现了用荧光蛋白标记表达了H6亚型禽流感病毒血凝素基因.     

eGFP标记狂犬病病毒G基因与EgM123基因重组融合蛋白的表达与鉴定

【目的】反向遗传学技术构建EgM123基因重组狂犬病SRV₉病毒疫苗株,研究狂犬病病毒G基因、细粒棘球绦虫EgM123基因、eGFP基因重组质粒在真核细胞中的蛋白表达效果与蛋白免疫原性,为通过反向遗传学拯救eGFP标记EgM123基因重组狂犬病病毒,制备狂犬病-包虫病二联基因重组疫苗提供研究基础。【方法】将已构建的携带eGFP增强型绿色荧光蛋白的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒(3033 bp)利用脂质体转染方法转染BHK-21细胞,使其在BHK-21细胞中表达出融合蛋白,并通过荧光显微镜观察、SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳、Western blotting试验鉴定融合蛋白的荧光蛋白表达、融合蛋白分子量,鉴定其免疫原性。【结果】在转然后48 h可见绿色荧光蛋白的表达;通过SDS-PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳结果显示,重组质粒在BHK-21细胞中表达获得分子量约为120KDa的融合蛋白;Western blotting结果显示,将蛋白凝胶转移PVDF膜分别经狂犬病病毒G蛋白单克隆抗体、EgM123多克隆抗体、GFP单克隆抗体分别孵育,均在120KDa处可见抗原抗体结合条带。【结论】eGFP标记的狂犬病病毒G基因重组细粒棘球绦虫EgM123基因重组质粒在真核细胞中成功表达出融合性蛋白,且具有免疫原性,     

盐穗木HcGKR基因亚细胞定位表达载体的构建及定位分析

[目的]以GFP基因为报告基因,构建HcGKR基因的亚细胞定位表达载体.[方法]采用PCR方法和基因枪法.[结果]用PCR法,以pGEM- T- HcGKR质粒为模板,获得HcGKR基因的目的片段.然后将其克隆到亚细胞定位表达载体35S:GFP中,获得由CaMV35S启动子调控目的基因的35S - GFP - HcGKR融合表达载体,使目的基因能够和GFP融合同时表达.采用基因枪法将35S - GFP - HcGKR转化到洋葱表皮细胞中,暗培养24 h后,经共聚焦显微镜观察确定发出绿色荧光的位置,对HcGKR基因进行亚细胞定位.[结论]构建的亚细胞定位表达载体可在植物细胞中表达,通过洋葱细胞中绿色荧光的位置确定目的基因定位在细胞膜上,为进一步盐穗木HcGKR基因的功能奠定了理论基础.     

The glucocorticoid receptor: rapid exchange with regulatory sites in living cells

Steroid receptors bind to site-specific response elements in chromatin and modulate gene expression in a hormone-dependent fashion. With the use of a tandem array of mouse mammary tumor virus reporter elements and a form of glucocorticoid receptor labeled with green fluorescent protein, targeting of the receptor to response elements in live mouse cells was observed. Photobleaching experiments provide direct evidence that the hormone-occupied receptor undergoes rapid exchange between chromatin and the nucleoplasmic compartment. Thus, the interaction of regulatory proteins with target sites in chromatin is a more dynamic process than previously believed.     

pEGFP-hTERT载体的构建及其在牛A型精原细胞中的表达

为了构建端粒酶逆转录酶表达载体,用带有绿色荧光蛋白报告基因的载体pEGFP-C1和带有hTERT cDNA的载体pCL-Neo-hTERT,通过基因重组构建新的载体pEGFP-hTERT,转化后筛选阳性克隆进行酶切鉴定;pEGFP-hTERT载体通过脂质体介导法转染纯化后的牛A型精原细胞,观察绿色荧光表达,G418筛选阳性克隆。结果表明,pEGFP-hTERT载体与预设计的一致;pEGFP-hTERT载体转染牛A型精原细胞后,经筛选获得了1个表达绿色荧光蛋白的阳性细胞克隆。由此可见,hTERT表达载体得到了成功构建,并在牛A型精原细胞中实现了表达。     

人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白融合表达载体的构建及转染

目的：构建携带人LIF基因与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的融合表达载体,并转染人胚肺成纤维细胞,为研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．方法：以重组质粒pcDNA3．1／lif为模板,PCR扩增LIF基因,将扩增片断双酶切后连接到质粒pEGFP-N1中,形成重组表达载体pEGFP—N1／lif．并用脂质体法转染人胚肺成纤维细胞,荧光显微镜下观察,RT—PCR及Western杂交检测融合蛋白的表达．结果：成功构建融合表达载体pEGFP—N1／lif,在人胚肺成纤维细胞实现表达,检测到融合蛋白EGFP—LIF．结论重组pEGFP—N1／lif载体构建成功,可用于标记LIF蛋白、为进一步研究LIF在维持人胚胎生殖细胞自我更新中的作用机制奠定基础．     

脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞条件的优化(英文)

[目的]优化脂质体介导外源基因体外转染牦牛乳腺上皮细胞的条件。[方法]通过胶原酶消化法和组织块贴壁法,体外分离培养得到牦牛乳腺上皮细胞。采用免疫细胞化学技术检测细胞角蛋白在细胞内的表达。以绿色荧光蛋白为报告基因,通过脂质体介导外源基因转染牦牛乳腺上皮细胞,统计在不同细胞融合度、脂质体浓度、脂质体与质粒的比例、转染时间下的转染效率,寻求最佳转染条件。[结果]采用胶原酶消化法,24h内细胞团块贴壁生长,纤维样细胞沿着细胞团块生长,后上皮样细胞爬出。上皮细胞与纤维细胞界限明显,细胞呈椭圆形,排列紧密,岛屿状生长。纯化至5代左右可得到较纯的上皮样细胞。采用组织块贴壁法,6d左右组织块周围出现细胞晕,有少量纤维样细胞生长;8d左右,上皮样细胞长出,并往外不断铺展。在荧光显微镜下观察,试验组细胞角蛋白检测呈阳性,细胞质呈绿色,细胞核复染呈红色。牦牛乳腺上皮细胞在细胞融合度为81%～90%,脂质体的量为1.8μl,脂质体与质粒比例为2∶1,转染时间为4h时,转染效率最高。[结论]该研究可为乳腺生物反应器构建提供试验依据。