犬血清IgG的纯化、抗体制备及其鉴定

[目的]探讨犬血清IgG的纯化方法。[方法]采用硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析提取纯化犬血清IgG,利用SDS-PAGE电泳和免疫印迹法鉴定所得产品的纯度和免疫活性。[结果]获得的纯化犬血清IgG的SDS-PAGE图谱中存在2条蛋白条带,表明获得了高纯度的犬血清IgG;重链分子量为58kD,轻链分子量为27kD,IgG分子量为170kD。特异性检测发现犬血清IgG重链和轻链都能与鼠抗犬血清IgG抗体结合,表明纯化犬血清IgG具有免疫原性和反应原性。[结论]硫酸铵盐析法结合SephadexG-200凝胶柱层析可获得纯度高、活性好的纯化犬血清IgG,为犬血清IgG相关的免疫学试验提供了高质量的免疫材料。     

鸡IgG单克隆抗体的制备与鉴定

[目的]制备鸡免疫球蛋白单克隆抗体,提高诊断鸡特异性抗体的水平。[方法]应用盐析法粗提和葡聚糖G200凝胶层析分离纯化鸡血清IgG,免疫BALB/c小鼠,并进行细胞融合和ELISA筛选。[结果]间接ELISA法检测C44、C45、C67和C68共4株鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞的腹水效价分别为1∶640000、1∶320000、1∶640000和1∶80000。Westernblot分析显示,C44和C45株单克隆抗体识别鸡IgG轻链,而C67和C68株单克隆抗体识别鸡IgG重链,它们与鸭、猪等血清Ig均没有反应。小鼠Ig亚类分析表明,4株细胞分泌的抗体均为IgG1型。[结论]成功获得了4株稳定分泌鸡IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞。     

SPA协同凝集试验快速诊断鸡马立克氏病的研究

应用鸡胚成纤维细胞(CEF)培养MDV-814株,经反复冻融、超声波处理、差速离心法纯化病毒,制成油乳剂灭活抗原;皮内多点注射法免疫健康家兔,获得高效价的免疫血清,经56℃、30min灭能,用硫酸铵沉降3次后,再用透析袋透洗,以除去部分NH4 和SO42-,最后用DEAE离子交换柱提取IgG。用IgG 2次标记金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)制成致敏的SPA菌悬液,用SPA协同凝集试验检测病鸡羽毛囊中MD特异性抗原。试验证明,上述方法的灵敏度是AGPT的48倍。整个试验只需几分钟即可完成,不需要复杂的仪器设备,具有操作简便,检测速度快,结果准确和便于现场应用等优点。     

中华鳖和杂交鳢血清免疫球蛋白免疫印迹和酶联免疫分析

[目的]探讨中华鳖和杂交鳢血清免疫球蛋白的同源性及其含量。[方法]采集中华鳖和杂交鳢血清与25种商品二抗共同抚育,进行免疫印迹及酶联免疫分析。[结果]中华鳖和杂交鳢血清可与兔抗鸡IgM、兔抗猪IgG、兔抗鸡IgG、兔抗大鼠IgM、兔抗猴IgG和羊抗人IgG等6种二抗发生免疫印迹反应。利用鸡IgG、鸡IgM、猪IgG、大鼠IgM、猴IgG和人IgG的ELISA试剂盒测定了中华鳖和杂交鳢血清免疫球蛋白水平,中华鳖血清免疫球蛋白浓度为28.5～215.4μg/L,杂交鳢血清免疫球蛋白浓度为24.5～201.5μg/L。[结论]该研究能够丰富中华鳖、杂交鳢特异性免疫系统的研究,对中华鳖、杂交鳢的健康养殖有一定的指导意义。     

鸡免疫球蛋白 GFc(IgGFc)重链的分离纯化及其抗血清制备——Ⅰ 兔抗鸡 IgGFc 重链抗血清制备

经硫酸铵盐析沉淀、柱色谱分离纯化得到鸡血清 IgG。然后用木瓜蛋白酶水解IgG,再经 DEAE-纤维素柱色谱纯化制得 IgGFc 重链。继用 IgGFc 重链免疫家兔制备兔抗鸡 IgGFc 重链抗血清。     

猪血免疫球蛋白G提取及分子量测定

[目的]纯化猪血免疫球蛋白IgG,并测定其轻链与重链的分子量。[方法]采用分步硫酸铵盐析法粗提猪血浆中的免疫球蛋白G,透析袋脱盐后用DEAE-SephadexAS0对IgG进行纯化,对纯化后的免疫球蛋白进行SDS-PAGE电泳,采用AlphaEaseFC凝胶分析软件对凝胶图像进行分析。[结果]3份样品中免疫球蛋白的浓度分别为2．712、2．679、2．489mg／ml;电泳后每泳道均出现2条蛋白带,说明所提免疫球蛋白的纯度较高;2条蛋白带分别为IgG的重链（H链）与轻链（L链）,与标准蛋白Marker进行比较可知,H链的分子量约为57KDa,L链的分子量约为26KDa。[结论]得到了高纯度的猪IgG,并进一步确定了IgG轻链与重链的分子量。     

GST-Dot4融合蛋白的表达·纯化及鉴定

[目的]为了提高Dotg蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达并获得较高纯度的蛋白。[方法]以pGEX—KG—Dot4重组质粒转化EcoliBL21后,用IPTG诱导重组菌表达GST—Dot4融合蛋白,采用SDS—PAGE及WesternBlot法鉴定表达产物,用GlutathioneSepharose4B亲和层析柱分离纯化。[结果]pGEX—KG—Dot4重组表达载体在大肠杆菌中获得高效表达;经GlutathioneSepharose4B亲和层析柱纯化获得了高纯度的Dot4融合蛋白;WesternBlot表明,该蛋白可与GST标签抗体反应,表明获得了目的蛋白。[结论]在大肠杆菌中表达纯化后得到较高纯度的GST—Dot4融合蛋白,为Dot4蛋白的结构、功能及作用机制研究奠定了基础。     

鸡胚原代肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离培养与鉴定

[目的]本试验旨在建立一套稳定的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化和培养技术,为深入研究鸡舍空气污染物对鸡肺泡功能影响提供体外研究模型。[方法]采用Ⅰ型胶原酶对16日龄鸡胚的肺组织进行消化,经过差速离心和差速贴壁法分离细胞,采用鸡免疫球蛋白G(IgG)免疫吸附法纯化细胞,再利用免疫荧光检测和碱性磷酸酶进行细胞鉴定。[结果]培养18～24 h细胞伸展贴壁,细胞为多边形,呈岛屿状生长;培养24～72 h,细胞增殖代谢旺盛,胞核明显,胞浆丰富,细胞之间逐渐连接成单层;培养72 h后,细胞内颗粒物减少,细胞形态改变。免疫荧光检测可见上皮细胞标志物细胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK19)的表达,碱性磷酸酶染色可见胞浆内出现弥散的红色或红棕色颗粒物。[结论]该方法是一种有效的鸡肺泡Ⅱ型上皮细胞分离、纯化和培养的技术,细胞产量高,纯度大,能够满足一般的体外研究。     

蒜氨酸酶的分离纯化条件分析

采用（NH4）2SO4盐析、Sephadex G-200凝胶过滤对蒜氨酸酶进行了部分纯化。结果表明,蒜氨酸酶的含量和酶活性在（NH4）2SO4为30％～50％时较高,40％时蒜氨酸酶活性最高;经Sephadex G-200凝胶过滤获得的酶液纯化倍数为34．45,回收率为1．72％。     

蛋鸡血清载脂蛋白AI的分离纯化及鉴定

介绍了一种分离纯化蛋鸡血清载脂蛋白AI的一种新方法。用磷钨酸沉淀制备鸡血清HDL．乙醇/丙酮(体积分数ψ=1)脱脂后经sephadex G-150凝胶层析柱反复层析。获得的apu AI经12.5％的SDS-PAGE电泳显示为单一条带，分子量测定大约为27788Da。本方法的优点是通过使用磷钨酸沉淀法代替了超速离心的繁琐过程．在一般实验室条件下，缩短了制备时间且分离效果好。     

兔抗猪瘟高免血清的制备及纯度鉴定

利用猪瘟弱毒疫苗(C株)免疫新西兰大白兔,制备抗猪瘟高免血清IgG。运用间接ELISA方法测血清效价,再经饱和硫酸铵盐析沉淀法提纯血清IgG,SDS-PAGE电泳法鉴定提纯IgG的纯度,结合无菌检查试验和仔猪接种试验,检测血清IgG的安全性。结果表明,获得了蛋白含量为6 mg/mL,效价为1∶6400的高效价、安全性高、成本低的抗猪瘟高免血清IgG。为猪瘟病毒的检测和猪瘟的防制提供了理想的生物制剂。     

羊抗鸡酶标二抗用于鹅血清抗体检测的研究

通过比较鸡IgG与鹅IgG的相似性,探讨羊抗鸡酶标二抗用于检测鹅血清抗体的可行性。用辛酸-硫酸铵盐析法提纯鸡、鸭、鹅、小鼠、兔、猪、羊的IgG,比较上述动物IgG粗提物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱,并用蛋白免疫转印法定性检测上述动物血清IgG与羊抗鸡酶标二抗的结合情况;然后用直接ELISA方法分析不同动物血清分别与抗鸡酶标抗体和抗鹅酶标抗体结合程度的差异;最后用间接ELISA方法比较两种酶标抗体对同一鹅群大肠杆菌抗体的检测结果。结果表明,鸡、鸭、鹅IgG具有较大的相似性,都能够与抗鸡酶标二抗结合;羊抗鸡酶标二抗可以替代抗鹅酶标二抗来检测鹅的血清抗体。     

鸡免疫球蛋白G的提纯及定量测定

从成年鸡血清中用硫酸铵三次沉淀粗提r球蛋白。然后,用G200凝胶柱过滤,洗脱液含O.14M NaCl,0.01M PB,流速6—8滴/分。取第二峰,用DE52纤维素柱层析,洗脱液是0.1M PH7.0 PBS。洗脱蛋白用免疫电泳等技术鉴定为纯化IgG。以此抗原1毫克加福氏完全佐剂首次免疫家兔后,再用同种抗原2—3次加强免疫,总蛋白用量3—5毫克。兔抗鸡IgG抗血清效价在1:16—1:32以上。以单向免疫扩散试验,测出不同周龄鸡血清中IgG的含量: 2周龄:2.9117±0.0779(n=20); 4周龄:3.8748±O.0591 (n=20); 10—13周龄:8.2243±O.4000 (n=59); 18—21周龄:13.3107±0.7434(n=44);     

应用PPA—ELISA检测鸡血清中禽分枝杆菌抗体的研究

用禽型提纯结核菌素(PPD)作包被抗原,建立了PPA—ELISA检测鸡结核病血清抗体的程序。筛选最佳包被抗原浓度为25μg/ml,待检血清稀释度为1:40倍,兔抗鸡IgG血清稀释度为1:800倍。检测了30份结核病鸡血清和30份健康鸡血清。两者OD值分别为x0.345和x0.086,P/N值为4.0(P<0.01)。     

鸡IgG几种不同纯化方法的比较研究

试用三种不同的方法纯化鸡免疫球蛋白Ｇ（ＩｇＧ），其中硫酸葡聚糖钠法虽好，但因其价格昂贵，不易推广；氯仿法是一种简便、快速而又经济的好方法，它的产率高，且不影响ＩｇＧ的活性。     

传染性法氏囊病病毒dsRNA核酸提取

用免疫沉淀法从感染鸡法氏囊组织中分离传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ），用差速离心法从感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）中分离ＩＢＤＶ，再从分离的ＩＢＤＶ中抽提ｄｓＲＮＡ。在ｄｓＲＮＡ提取物受ＤＮＡ降解产物影响时，可用ＤＮａｓｅⅠ消化去除，核酸再经琼脂糖凝胶电泳纯化。