犬SLAM基因真核表达载体的构建及在MDCK细胞中的稳定表达

为了构建稳定表达犬信号淋巴细胞激活因子(SLAM)的MDCK细胞系,该研究从犬外周血淋巴细胞中克隆了犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)细胞受体SLAM基因,将鉴定正确的SLAM基因插入到高效真核表达载体pcDNA3.1(+)中.采用脂质体转染的方式将重组质粒pcDNA3.1/SLAM转染到MDCK细胞中,采用G418加压筛选及有限稀释法克隆,获取稳定表达SLAM的MDCK细胞株.结果表明,成功构建了SLAM的真核表达载体pcDNA3.1/SLAM,并通过G418筛选获得了稳定表达SLAM的细胞系MDCK.     

犬瘟热病毒水貂分离株F基因真核表达载体的构建与表达

为了构建犬瘟热病毒F基因真核表达载体,利用RT-PCR方法扩增出水貂源犬瘟热病毒分离株的F基因,将其克隆至pMD-18T载体上,用BamHⅠ和KpnⅠ进行双酶切,回收目的基因。将目的基因亚克隆至pcD-NA3.1(+)中,获得真核重组质粒pcDNA3.1-CDVF。通过脂质体介导法将pcDNA3.1-CDVF转染至BHK-21细胞中,并利用间接免疫荧光试验和RT-PCR法检测pcDNA3.1-CDVF在BHK-21细胞中的表达情况。结果表明,真核重组表达质粒pcDNA3.1-CDVF构建成功,F基因可在BHK-21细胞中表达。     

猪瘟病毒囊膜蛋白E2基因真核分泌型表达载体的构建及其表达

【目的】构建猪瘟病毒囊膜蛋白(E2 protein)基因的真核表达载体,并将其在猪脐静脉血管内皮细胞中进行表达。【方法】采用PCR技术扩增出E2蛋白全长基因(E2qc)序列和去除跨膜基因(E2sh)序列,并将其克隆入真核表达载体pSecTag2(A)中,构建pSecTag-E2qc和pSecTag-E2sh表达载体,分别进行PCR、双酶切及测序鉴定。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染猪脐静脉血管内皮细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测目的基因的转录情况,同时对转染细胞及细胞上清液进行SDS-PAGE和Western-blot分析,以检测目的蛋白的表达情况。【结果】成功克隆了E2蛋白基因全长序列1119bp和去除E2蛋白跨膜基因序列999bp的目的基因。构建的表达载体经PCR、双酶切法及测序鉴定均无误。转染后细胞的RT-PCR结果显示,目的基因被成功转录。转染后细胞及细胞上清液的SDS-PAGE和Western-blot结果显示,目的基因被成功表达。【结论】成功构建了猪瘟病毒E2蛋白的真核表达载体,转染猪脐静脉血管内皮细胞后,分泌表达了猪瘟病毒E2重组蛋白。     

人pot1基因cDNA的克隆及其在HeLa细胞中的表达

目的：克隆人端粒保护蛋白（human proteetlon of telomeres 1.pot1）基因cDNA全编码区,构建成真核表达质粒并实现在HeLa细胞中的表达。方法：RT-PCR法扩增出HeLa细胞hpot1基因cDNA编码区全序列,定向克隆至真核表达载体pcDNA3,阳性重组质粒经插入片段测序验证;重组的pcDNA3-hpot1质粒瞬时转染HeLa细胞,RT-PCR和EMSA法（电泳迁移率改变分析）检测hpot1基因的表达水平。结果：来自Hela细胞的hpot1基因cDNA编码区全序列构建成的真核表达质粒pcDNA3-hpot1,经测序分析序列和ORF正确;该重组质粒转染在HeLa细胞48h后,hpot1基因表达水平增高。结论：真核表达载体pcDNA3-hpot1构建成功,并实现了hpot1在Hela细胞中的表达。     

鸡痘DNA疫苗pVAX-env的构建及其体内外表达

利用PCR技术将鸡痘病毒env基因亚克隆到pVAX1真核载体上,构建了含有该基因的真核表达质 粒pVAX-env。将质粒pVAX--env体外瞬时转染BHK21细胞通过间接免疫荧光检测蛋白表达。将pVAX-env质粒肌肉注射免疫14日龄雏鸡,通过RT-PCR和组织免疫荧光检测体内质粒表达。结果表明,成功构建了真核表达质...     

三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。     

猪瘟病毒Npro基因的克隆表达

 为了得到一个表达Npro蛋白的真核表达载体,从而为下一步研究不同时间段细胞主要组织相容性复合体（MHC）表达的变化情况,从分子水平上说明Npro与MHC之间的关系,本研究应用反转录聚合酶链式反应（RT PCR）技术对猪瘟病毒石门毒株Npro基因进行了克隆和测序,结果得到了长度为592bp的目的片段。用BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶分别对重组克隆质粒和转移载体pcDNA30进行双酶切,回收目的基因DNA片段,将目的基因Npro亚克隆至真核转移载体pcDNA30中,经双酶切和序列测定鉴定插入基因和连接方向正确,得到含完整Npro基因的重组载体质粒P Npro。构建成功的真核表达载体以脂质体介导的转染方法将此重组载体质粒转染PK 15细胞,转染24和48h后检测表达情况。经Western blot方法检测表明,此Npro蛋白在PK 15细胞中正确表达。     

犬黑皮质素受体4真核表达载体的构建及表达

[目的]构建带myc和His标签的犬黑皮质素受体4真核表达载体并在MDCK细胞中进行表达。[方法]以犬MC4R基因组DNA为模板PCR扩增目的基因编码区,将扩增产物进行T-A克隆;酶切、测序鉴定成功后将目的基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A。重组体pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R经酶切和测序鉴定;采用FuGENE HD介导转染技术将重组体导入MDCK细胞;转染后继续培养72 h,提取细胞内总RNA,RT-PCR鉴定目的基因的表达;提取细胞总蛋白,Western Blot检测蛋白表达。[结果]构建带标签的pcDNA3.1-myc-His/A-cMC4R重组真核表达载体,测序结果与GenBank公布的序列相似性为99%。RT-PCR和Western Blot检测到目的基因表达。[结论]成功构建犬真核表达载体pcDNA3.1-myc-His/A-MC4R,重组体能在MDCK细胞中表达。     

牛白细胞介素-17真核表达载体的构建及在牛乳腺上皮细胞中的表达

【目的】在体外分离培养牛乳腺上皮原代细胞,并构建牛白细胞介素-17(bIL-17)基因真核表达质粒,观察重组质粒在牛乳腺上皮细胞的表达.【方法】提取牛脾脏细胞总RNA,通过RT-PCR扩增bIL-17,将bIL-17连入pMD19-T进行测序,测序成功后将bIL-17插入含有增强型绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-N3上,构建真核表达质粒pEGFP-N3-bIL-17.用脂质体法将pEGFP-N3-bIL-17质粒转染于牛乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,RT-PCR检测bIL-17基因在细胞内的转录,定量ELISA检测bIL-17蛋白在细胞内的表达情况.【结果和结论】成功构建具有绿色荧光和新霉素抗性的双选择标记的牛白细胞介素-17真核表达载体,并可在牛乳腺上皮细胞成功表达.     

新孢子虫NcGRA2基因真核表达质粒的构建及其在293细胞内的表达

[目的]为了构建新孢子虫NcGRA2基因的真核表达载体,探讨重组载体在体外细胞的表达.[方法]从含有NcGRA2基因的重组质粒pGEX-4T1-NcGRA2中,用限制性内切酶进行酶切获得带有粘性末端的NcGRA2基因片段.经琼脂糖凝胶电泳切胶回收NcGRA2基因片段,与pcDNA3.1载体连接.将构建的真核表达质粒pcDNA3.1-NcGRA2转染到293细胞中表达.[结果]经酶切分析和序列测定,证实了重组质粒的正确连接.经免疫荧光抗体试验验证pcDNA3.1-NcGRA2能在293细胞中表达NcGRA2蛋白.[结论]获得重组质粒pcDNA3.1-NcGRA2,并能在体外细胞中表达NcGRA2蛋白,为进一步研究核酸疫苗的动物免疫试验奠定了基础.     

大熊猫源犬瘟热病毒基因组遗传特征分析

【目的】对首次暴发的大熊猫源性犬瘟热病毒（panda derived-canine distemper virus,P-CDV）全基因组进行克隆测序,以了解大熊猫源CDV的全基因组遗传变异情况,进一步追踪感染源,为大熊猫犬瘟热防控提供理论依据。【方法】根据GenBank公布的CDV全基因组序列设计17对特异性引物,利用RT-PCR技术,从感染犬瘟热病毒的大熊猫肺渗出液中分片段扩增CDV全基因序列,并克隆到pMD19-T载体中;经测序、拼接,获得第一个P-CDV全长cDNA序列;利用DNAman生物学分析软件分别对全基因组序列、H蛋白基因序列、F蛋白基因序列、P蛋白基因序列、M蛋白基因序列等进行遗传变异分析,构建系统进化树。【结果】经序列测序和拼接,大熊猫源犬瘟热病毒全基因组长15 690 nt,GenBank登录号为KP677502,主要编码6种蛋白,分别是N蛋白、P蛋白、M蛋白、F蛋白、H蛋白和L蛋白,在各个基因及间隔区中未发现碱基插入和缺失。遗传进化分析显示,P-CDV全基因组与20株代表性CDV全基因组序列同源性为91.5%-98.7%,P-CDV与强毒株MKY-KM08（HM852904）、PS、HLJ1-06（JX681125）、Hebei（KC427278）以及AC96I-H358（AB753776）在一个大的分支上,与PS株（JN896331）亲缘关系最近,同源性为98.7%,与标准野毒株Strain A75-17（AF164967）同源性为95.7%,与疫苗株CDV3（EU726268）亲缘关系较远,同源性为91.5%。H蛋白氨基酸序列分析和系统进化树表明,大熊猫源犬瘟热病毒属于强毒株,基因型为Asia-I型。P-CDV各蛋白基因与20株代表性的毒株相比有9处氨基酸发生了变异,与GenBank上现有的CDV序列相比,其中3处是独有的,分别是：F蛋白基因的208位由N（Asn,天冬酰胺,强毒株多为N）或K（Lys,赖氨酸,弱毒株多为K）变成了S（Ser,丝氨酸）,第215位由S变成了A（Ala,丙氨酸）,P蛋白基因的58位由Q（Gln,谷氨酰胺）变成K（Lys,赖氨酸）。【结论】成功克隆了大熊猫源犬瘟热病毒的全基因,并完成了序列分析,发现了在F、P基因上碱基的重要变异。这些数据将为研究大熊猫犬瘟热的遗传变异和流行特征提供分子生物学依据。     

石河子垦区犬瘟热病毒流行株H基因遗传变异分析

为了解石河子垦区的CDV流行株H基因遗传变异特点,设计2对特异性引物,通过RT-PCR方法对29份临床疑似犬瘟热的病料进行检测,对于检测CDV阳性的病料进行流行株H基因克隆、测序和序列分析,结果检测出7份阳性病料。序列分析发现,7个流行株H基因之间的同源率在91.0%～98.9%,与疫苗株(FJ461699.1)的同源率为86.9%～91.7%,存在一定的变异。糖基化位点及抗原表位预测分析发现,与参考株Onderstepoort相比,7个流行株推导的H蛋白糖基化位点、抗原表位均有不同程度的改变。遗传进化分析显示,CDV shz1~CDVshz6亲缘关系较近,它们与CDVshz7相距较远。研究结果提示,石河子垦区发病犬中存在CDV变异株。     

犬瘟热病毒小熊猫株核蛋白和融合蛋白基因克隆及序列分析

根据GenBank中报道的CDV核苷酸序列,设计合成了2对特异性引物,对犬瘟热病毒小熊猫株(CDVLP)核蛋白(N)和融合蛋白(F)两种主要结构蛋白基因进行了克隆、测序及序列分析。结果表明,CDVLP株N蛋白基因全长1571bp,预测编码523个氨基酸;F蛋白基因全长1989bp,预测编码662个氨基酸,F蛋白氨基酸序列中含有5个潜在的N-联糖基化位点。聚类分析提示,CDVLP株是一株与CDV强毒株亲源关系很近的毒株。用DNAstar软件对CDVLP株和Onderstepoort弱毒株N蛋白和F蛋白进行了疏水性及抗原表位预测分析。抗原表位差异提示CDVLP毒株N和F蛋白的免疫原性可能要优于Onderstepoort弱毒株。在分子水平上阐明了CDVLP株的N和F蛋白基因更适合作为构建基因疫苗和重组活载体疫苗的目的基因。     

厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析（摘要）

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母其进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。     

厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。     

广东地区犬瘟热病毒血凝素基因的克隆与序列分析

【目的】对广州和东莞市宠物犬感染犬瘟热病毒(CDV)的情况进行病原鉴定和分析,为监测CDV的遗传变异情况和防治犬瘟热(CD)提供数据基础。【方法】从表现CD症状的犬只中鉴定了17份CDV阳性样本,采用RT-PCR的方法克隆得到这些野毒株的血凝素(H)基因序列,采用生物信息学方法进行序列比对分析。【结果】17株CDV的H基因核苷酸与氨基酸序列的相似性分别为97.4%～100.0%和97.5%～100.0%,与Onderstepoort、Lederle和Convac等疫苗株相比,其核苷酸与氨基酸序列相似性分别为90.3%～91.5%和89.4%～90.8%。进化树分析结果显示,17株CDV野毒株均属于AsiaⅠ型,与疫苗株的分支较远;本研究鉴定的野毒株已进化形成9个潜在的N-糖基化位点。【结论】AsiaⅠ型CDV仍为该地区的流行基因型,基因型较稳定,但与疫苗株相比形成了一定的进化距离和出现了大量的变异。因此,继续监控CDV在犬群中的进化,掌握其遗传变异状况具有重要意义。     

犬瘟热病毒贵州株CDV-GZ1的分离与鉴定

为丰富我国犬瘟热病(CD)的流行病学资料,同时为CDV贵州分离株主要抗原基因及结构研究奠定基础,对贵阳市某宠物医院犬瘟热病毒金标卡检测呈阳性病死犬的肝脏、肺脏、淋巴结等组织,取适量经混合研磨过滤后,同步接种于Vero传代细胞上进行病毒分离培养,并对该分离毒株进行理化特性、电镜形态、血清学和核酸检测等系列鉴定。结果表明:在Vero细胞上盲传至第6代时稳定出现特征性的CPE,该毒株为RNA囊膜病毒,电镜下可见胞浆包涵体、病毒粒子呈晶格状排列,病毒可被犬瘟热阳性血清中和,分离病毒为犬瘟热病毒并被命名为CDV-GZ1株。     

拟南芥两个MYB基因标签融合蛋白转基因植株的获得和鉴定

[目的]进行染色体免疫共沉淀（ChIP）试验,挖掘MYB类基因At3g11280和At5g05790所调控的下游基因。[方法]在构建了标签融合蛋白植物表达载体的基础上,利用农杆菌介导的转化将这些载体转入拟南芥植物中,获得转基因植株,并用Western blotting检测标签融合蛋白在转基因植株中的表达。[结果]拟南芥植株转基因的效率很高,4种标签蛋白融合载体的转化均获得了20株以上的转基因植株。随机对4种转基因植株的8株T1代植株进行Western blotting分析,结果表明4,种转基因植株中均鉴定出阳性植株。融合蛋白的条带大小在30 kD左右,将显色信号条带与Marker比对,显示条带大小与预测蛋白大小相符。[结论]这些有融合蛋白表达的转基因植株为ChIP试验的进行提供了重要材料。     

橡胶树蔗糖转运蛋白基因SOS酵母双杂交体系的诱饵载体构建及自激活检测

为了筛选巴西橡胶树蔗糖转运蛋白（HbSUT）的互作蛋白质,构建了以SOS恢复系统为原理的胞质酵母双杂交系统的6个HbSUT基因的诱饵载体,并进行了自激活检测。通过PCR技术从携带HbSUT基因的质粒中获得预期的基因编码序列,将目标片段定向插入诱饵载体pSOS的SalⅠ及NotⅠ酶切位点之间,酶切和测序结果表明,获得了序列和读框正确的6个HbSUT基因的诱饵载体pSOS-SUTs,进一步导入酵母温度敏感酵母cdc25H菌株中,检测其表达产物对酵母SOS恢复系统Ras信号通路的激活作用,除pSOS-SUT5外,其他5个诱饵载体对酵母菌株均无激活作用,因而适合于进行后续互作蛋白质筛选研究。     

用RT-PCR检测病料中犬瘟热病毒的研究

利用RT-PCR技术检测了来自不同地区水貂、狐狸、貉子和老虎病料中是否存在犬瘟热病毒。根据犬瘟热病毒H和N基因核苷酸序列,设计合成2对引物。利用这2对引物分别对14份病料进行了检测。利用H基因引物从7份病料中扩增出761 bp的核酸片段,利用N基因引物也从同样的7份病料中扩增出586 bp的核酸片段。其余病料的检测结果为阴性。2对引物对病料的检测结果一致。