厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达的初步分析（摘要）

[目的]研究厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin真核表达载体构建及表达。[方法]通过对前期所获得的厚壳贻贝多条mytilin和myticin抗菌肽基因进行筛选,选择其中5条厚壳贻贝抗菌肽基因,采用PCR技术和DNA重组技术构建了相关的真核表达载体,并采用LiAC转化法将其转化到S78酿酒酵母中并进行初步表达分析。[结果]5种厚壳贻贝抗菌肽基因的真核表达载体构建成功,对转化酵母其进行mRNA检测结果表明,5种厚壳贻贝抗菌肽的基因在S78酵母中成功转录。[结论]该研究结果为最终采取基因工程手段表达厚壳贻贝抗菌肽mytilin和myticin并在此基础上开展厚壳贻贝抗菌肽的后续研究奠定基础。     

水稻OsVDAC5真核表达载体的构建及在酵母中的表达研究

[目的]构建水稻OsVDAC5的真核表达载体,对其进行真核表达研究。[方法]将Osvdac5基因与酵母表达载体pPIC3.5K连接,通过电转化的方法插入到毕氏酵母GS115中,筛选阳性重组菌株,通过0.5%的甲醇诱导使外源的水稻Osvdac5基因表达,并利用West-ern Blot鉴定表达蛋白的特异性。[结果]成功构建了Osvdac5::pPIC3.5K酵母表达载体,将其整合到酵母GS115基因组后,对其进行诱导表达,产物经Western Blot检测,证实了表达蛋白为OsVDAC5。[结论]该研究结果为进一步研究OsVDAC5蛋白的功能奠定了基础。     

牛乳素Lfcin B基因的合成及其在酵母菌中的表达研究

[目的]为临床研究和治疗某些病原微生物引起的感染提供依据。[方法]参照LfcinB的氨基酸序列,利用化学合成法合成LfcinB基因并克隆到pPIC9K载体中,转化到酵母菌GS115感受态细胞中,用抗性选择标记G418筛选出高拷贝酵母菌转化子。利用甲醇诱导表达重组LfcinB,经Tricine-SDS-PAGE电泳检测目的蛋白牛乳铁蛋白素的表达情况,同时通过体外抑菌试验检测表达产物的抑菌活性。[结果]提取的酵母菌DNA扩增出1条预期的560bp左右的特异性条带。目的基因已经成功克隆到pPIC9K载体中,并转到酵母菌GS115中而且获得了表达。重组酵母表达上清中牛乳铁蛋白素抗菌肽对沙门氏肠炎杆菌的抗菌活性为42.857IU/ml,表明LfcinB基因的酵母表达载体构建成功。[结论]该研究证明利用化学合成法直接合成编码LfcinB的DNA构建真核表达载体、通过生物发酵工程来制备LfcinB是可行的。     

玉米ZmPsaH基因真核表达载体的构建及转化

[目的]PsaH是光合系统Ⅰ(PSI)中的一个亚基,在植物光合系统中起着重要的作用.为研究玉米ZmPsaH基因在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmPsaH基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.利用RT-PCR技术扩增得到大小约为420 bp的玉米ZmPsaH基因,经限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒ZmPsaH-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmPsaH-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米ZmPsaH基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

玉米ZmCPK12基因真核表达载体的构建及转化

[目的]CDPK是一类依赖于Ca2+而不依赖CaM及磷脂的蛋白激酶,或类钙调素结构域的蛋白激酶,是植物和低等动物所特有.研究为玉米CDPK基因家族在抗逆中的作用提供基础.[方法]构建玉米ZmCPK12基因真核表达载体是了解玉米中该基因功能的重要途径之一.实验利用RT - PCR技术扩增得到大小为1 533 bp的玉米ZmCPK12基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP -5N连接,获得重组真核表达质粒ZmCPK12 - 5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒ZmCPK12-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转人酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建了玉米mCPK12基因真核表达载体,并且成功转化了酵母.     

大菱鲆抗菌肽基因酵母表达载体的构建及表达

将大菱鲆（Scophthalmus maxinus）hepcidin基因成熟肽序列经过部分改造后采用PCR方法克隆到毕赤酵母胞内表达载体pGAPZB中,构建了重组胞内表达载体pGAPZB—tbhep6his。用BlnI线性化重组质粒后,电击转化毕赤酵母SMD1168。经过Zeocin筛选和PCR扩增转化子基因组筛选,得到了数株基因工程酵母菌。通过SDS—PAGE和Western blot鉴定,发现目的蛋白与预期蛋白的分子量相吻合,并能与特异抗体antihis特异性结合,表明大菱鲆抗菌肽hepcidin基因在酵母菌中进行了表达。大菱鲆抗菌肽酵母表达载体的构建和表达为进一步研究该抗菌肽的功能并开发新型鱼类饵料奠定了理论基础。     

抗菌肽SMAP-29基因密码子优化及其在毕赤酵母中的表达

[目的]对抗菌肽SMAP-29的基因密码子进行优化,并使其在毕赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中表达。[方法]根据已知抗菌肽SMAP-29的氨基酸序列,参照毕赤巴斯德酵母密码子的偏好性,设计合成抗菌肽SMAP-29成熟肽基因片段,并同载体pPIC3.5K连接,电击转化至毕赤酵母受体菌GS115中,经G418筛选高拷贝转化子,并用MM、MD板和PCR法筛选Mut+表型。用甲醇诱导表达构建好的重组酵母表达基因工程菌,并裂解酵母细胞进行Tricine-SDS-PAGE分析。[结果]在诱导至第2天的细胞裂解液中检测到与预测的SMAP-29分子量相当,约为3.2 kD的表达带;表达产物对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有明显的抑菌作用,而对大肠杆菌抑菌效果不明显。[结论]该研究为SMAP-29在生物医学、农业等领域中的应用奠定基础。     

EV71病毒3C蛋白真核表达载体的构建及表达

[目的]构建EV71病毒3C蛋白的真核表达载体,并验证其在细胞中的正确表达。[方法]采用RT-PCR技术,从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因,克隆到真核表达载体pc DNA3.0-Flag上,并转染He La细胞,通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。[结果]酶切及测序鉴定显示,EV71病毒3C真核表达载体构建成功。Western blot和免疫荧光结果证实3C蛋白在He La细胞中成功表达。[结论]该研究成功构建了真核表达载体pc DNA3.0-Flag-3C,为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。     

外源基因在原核生物和真核生物中的表达(英文)

[目的]研究外源基因在原核生物和真核生物中的表达。[方法]将带有目的基因的表达载体pTYB2-WF转化大肠杆菌ER2566,用IPTG诱导植酸酶基因表达。用SDS-PAGE验证植酸酶融合蛋白表达情况,并进一步对融合蛋白进行纯化。用毕赤酵母表达系统表达植酸酶基因phyA;构建酵母整合载体pPIC9K-phyA,转化毕赤酵母GS115,构建工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结果]在甲醇的诱导下表达植酸酶,经酶活力的测定,其植酸酶活力达7.3μ/ml,构建了毕赤酵母工程菌GS115-pPIC9K-phyA。[结论]甲醇酵母表达机制在分子生物学以及工业应用领域发挥作用。     

猪PR39 真核表达载体构建

为构建猪源抗菌肽PR39的高效表达真核载体pVAX1-PR39,通过猪股骨骨髓组织基因组RNA合成c DNA,根据PR39基因全长序列,设计高效表达启动子,利用PCR扩增获得PR39全长基因,连接到真核载体pVAX1,构建重组载体pVAX1-PR39。转化大肠杆菌DH5α后进行菌落PCR鉴定和测序,测序结果与NCBI网站上猪源抗菌肽PR39基因序列完全一致,表明已成功构建了猪PR39的真核表达载体,理论上所构建的PR39表达载体能够提高猪的免疫能力。     

基于线粒体COⅠ基因比较分析野生与养殖厚壳贻贝种群的遗传多样性

[目的]通过比较分析线粒体CO I基因,探讨福州厚壳贻贝野生型和养殖型种群的遗传多样性。[方法]以福建省福州市野生厚壳贻贝(Mytilus coruscus Gould)和养殖厚壳贻贝各20个样本为试验材料,通过设计特异性引物,采用PCR技术对该40个个体的mtDNACO I(线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ)序列进行扩增,通过测序分析和序列比对检索,鉴定扩增的序列,并利用MEGA(version 4.10)和DnaSP(version 4.0)软件对序列进行分析。[结果]测序结果显示扩增序列总碱基数为668 bp,40条序列中T、C、A和G碱基平均含量分别为28.0%2、2.8%3、2.3%和16.9%,其中A+T的含量(60.3%)显著高于G+C含量(39.7%),表现了明显的碱基偏倚;40个个体表现为26种单倍型,包括408个多态位点,单倍型间平均遗传距离为0.299,单倍型多态性(h)为0.944,核苷酸多态性(π)值为0.153 06。上述结果表明福州厚壳贻贝的遗传多样性水平比较高,并且养殖群体和野生群体无遗传分化。[结论]该研究揭示了福州厚壳贻贝的遗传资源现状,试验结果可为厚壳贻贝良种筛选提供参考依据。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建及表达

[目的]克隆小鼠白细胞介素-5（mIL-5）cDNA构建真核表达质粒,并转染293细胞检测其是否表达。[方法]以小鼠脾脏细胞总RNA,经逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）扩增小鼠IL-5基因cDNA,酶切后插入pRc-CMV/Fc真核表达质粒中,构建重组真核表达质粒mIL-5/Fc-pRc-CMV,转染293细胞,RT-PCR与ELISA法检测目的基因表达。[结果]Fc-pRc-CMV中插入DNA序列与mIL-5 cDNA一致,重组质粒转染293细胞后,ELISA可检测出质粒能在293真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白。[结论]该研究成功克隆了小鼠IL-5基因cDNA,并构建其真核表达质粒。     

pEGFP-N1-hTERT真核表达载体的构建与表达鉴定

[目的]构建pEGFP-N1-hTERT真核表达载体,观察其在真核细胞中的表达。[方法]利用pC1-neo-hTERT和pEGFP-N1质粒构建重组质粒,通过双酶切鉴定、DNA测序分析验证人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)片段的准确性。将pEGFP-N1-hTERT真核表达载体转染到大鼠胎儿神经干细胞(NSCs)中,通过绿色荧光蛋白间接观察人端粒酶逆转录酶蛋白在细胞中的表达定位,通过RT-PCR、WesternBlot验证所构建的真核表达质粒pEGFP-N1-hTERT的正确性。[结果]所构建的pEGFP-N1-hTERT真核表达载体结构正确并能够在真核细胞中表达。[结论]该研究为建立大鼠永生化NSCs系奠定了基础。     

铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因的原核表达

[目的]对铜绿假单胞菌脂肪酶Lipase基因进行原核表达。[方法]利用PCR方法从铜绿假单胞菌基因组DNA中扩增得到脂肪酶基因,测定其核苷酸序列,利用基因重组技术构建脂肪酶基因的原核表达载体,加IPTG至终浓度为1.0 mmol/L诱导蛋白表达4 h,并进行SDS-PAGE电泳。[结果]从铜绿假单胞菌中克隆的脂肪酶基因成熟肽的序列,与NCBI上所递交的铜绿假单胞菌脂肪酶序列同源性很高,达99.36%。成功构建了脂肪酶基因的原核表达载体pET32a-Lip,进一步SDS-PAGE电泳结果显示目的基因得到高效表达。[结论]克隆的铜绿假单胞菌脂肪酶带有自身的信号肽,也可以在大肠杆菌中正常表达,可以用于进一步的研究。     

枯草芽孢杆菌分泌载体构建及其对脂肪酶A的分泌表达

[目的]构建含不同信号肽编码序列的枯草芽孢杆菌分泌表达载体,并研究这些载体对脂肪酶A的分泌表达效率。[方法]克隆得到枯草芽孢杆菌168株的脂肪酶A编码基因,同时扩增得到蛋白质NprE、Bpr、YweA的信号肽编码序列,构建了脂肪酶A分泌表达载体pMA5-estA、pMA5-nprE-estA、pMA5-bpr-estA和pMA5-yweA-estA,并转化到枯草芽孢杆菌168株中得到相应的重组分泌表达菌株。[结果]对4株重组表达菌株进行摇瓶培养,所有菌株都实现了脂肪酶A的分泌,20 h后,168（pMA5-bpr-estA）的细胞外脂肪酶A的酶活力达到1.68 U/ml,约占该菌株脂肪酶A总表达量的86%。[结论]枯草芽孢杆菌Bpr信号肽对脂肪酶A具有较高的分泌效率。     

厚壳贻贝胚胎发育观察

[目的]研究厚壳贻贝的胚胎发育情况。[方法]选择性腺成熟的厚壳贻贝亲贝,通过催产受精,对厚壳贻贝受精、卵裂、幼体发育等细胞生物学现象用显微镜进行连续观察,经显微摄影,详细记录了厚壳贻贝的胚胎发育全过程。[结果]厚壳贻贝亲贝经阴干刺激,排出精卵,获得成熟受精卵,直径约75μm,在水温13~20℃的条件下,受精卵分裂,经过桑椹期、囊胚期、原肠期、担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、匍匐幼虫等阶段,最后变成附着稚贝,其胚胎发育的全过程历时35 d。[结论]厚壳贻贝亲贝暂养温度要适当,一般在10℃左右。厚壳贻贝胚胎发育的时间与水温密切相关,其适宜温度为13~20℃,并由受精卵开始发育时相对较低的温度逐步升高。     

微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体的构建及初步鉴定(英文)

[目的]构建微小隐孢子虫miR-2980真核表达载体,并进行鉴定。[方法]从微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)基因组DNA扩增cp-miR-2980前体,克隆到pMD18-T载体上,经测序鉴定正确后亚克隆到pVAX1载体上,转染HCT-8细胞,提取细胞总RNA,RT-PCR检测cp-miR-2980的表达。[结果]成功地构建了cp-miR-2980真核表达载体pVAX-miR2980,RT-PCR检测证实其能在真核细胞HCT-8中表达。[结论]构建的真核表达载体pVAX-miR2980能在HCT-8细胞中成功表达cp-miR-2980,为后续研究cp-miR-2980的功能打下了基础。